研究tnfr1/map4k4/arp3復合物在膠質瘤侵襲性生長機制的實驗方法

研究tnfr1/map4k4/arp3復合物在膠質瘤侵襲性生長機制的實驗方法
【專利摘要】研究TNFR1/MAP4K4/ARP3復合物在膠質瘤侵襲性生長機制的實驗方法，包括以下步驟：步驟1，分析TNFR1與MAP4K4的相互作用及其機制，明確膠質瘤炎癥微環境中，TNFR1招募并激活MAP4K4，從而促進膠質瘤侵襲性生長；步驟2，分析MAP4K4與ARP3的相互作用及其機制，明確在膠質瘤進展中，MAP4K4通過磷酸化ARP3，激活ARP2/3復合物，促進肌動蛋白聚合及偽足形成，增強膠質瘤細胞的侵襲性。
【專利說明】研究TNFR1/MAP4K4/ARP3復合物在膠質瘤侵襲性生長機制的實驗方法
[0001]
技術領域
[0002]本發明涉及腦膠質瘤瘤侵襲性生長的研究領域，具體涉及研究TNFR1/MAP4K4/ARP3復合物在膠質瘤侵襲性生長機制的實驗方法。
[0003]
【背景技術】
[0004]長期以來對于膠質瘤侵襲性生長的研究主要著重于膠質瘤細胞內相關癌基因的作用機制，而忽略了炎癥微環境的作用；1863年，現代病理學奠基人Rudolf Virchow就提出假說:炎癥微環境是導致包括腫瘤在內的多種慢性疾病的原因之一;最近越來越多的實驗和臨床研究已經證實了這一假說，而這也是當前腫瘤研究的熱；組織損傷，無論是物理，化學或感染所致，均會發生炎癥反應，是機體對傷害刺激的防御反應的一部分，但機體免疫功能未能控制的炎癥反應將會擾亂細胞的微環境，從而導致癌癥相關基因和細胞信號蛋白的翻譯后修飾的改變；同時巨噬細胞、肥大細胞和中性粒細胞等炎癥細胞可導致包括腫瘤壞死因子a(tumor necrosis factor-a，TNF_a)、白介素-6(interleukin- 6，IL_6)、轉化生長因子^transforming growth factor-0，TGF_0)等在內的非特異性炎性細胞因子上調，從而支持腫瘤的發生發展;在惡性膠質瘤中，腫瘤相關巨噬細胞的浸潤往往提示腫瘤患者預后的不良，說明炎癥微環境在膠質瘤的發生發展中起關鍵作用。
[0005]

【發明內容】

[0006]本發明提供研究TNFR1/MAP4K4/ARP3復合物在膠質瘤侵襲性生長機制的實驗方法。
[0007]研究TNFR1/MAP4K4/ARP3復合物在膠質瘤侵襲性生長機制的實驗方法，包括以下步驟:
步驟I，分析TNFRl與MAP4K4的相互作用及其機制，明確膠質瘤炎癥微環境中，TNFRl招募并激活MAP4K4，從而促進膠質瘤侵襲性生長；
步驟2，分析MAP4K4與ARP3的相互作用及其機制，明確在膠質瘤進展中，MAP4K4通過磷酸化ARP3，激活ARP2/3復合物，促進肌動蛋白聚合及偽足形成，增強膠質瘤細胞的侵襲性；步驟3，分析TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚體的相互作用及其機制，明確膠質瘤炎癥微環境中，TNFRl通過招募并激活MAP4K4，從而磷酸化ARP3，激活ARP2/3復合物，促進肌動蛋白聚合及偽足形成，增強膠質瘤細胞的侵襲性；
步驟4，利用膠質瘤臨床病理標本及構建裸鼠膠質瘤腦內模型，在整體水平全面探討分析TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚體對膠質瘤在體內侵襲性生長的影響； 進一步的，所述步驟I包括:(I)驗證膠質瘤及正常腦組織中TNFRl與MAP4K4的表達，分析兩者表達的相關性，及與臨床病理因素包括患者病理級別、復發及預后的相關性；(2)分別在膠質瘤組織、工具細胞及膠質瘤細胞中驗證并分析TNFRl與MAP4K4的相互作用，并根據各自結構域特點分別構建截短突變質粒，明確其相互作用結構域;(3)在TNF-α刺激下，干預TNFRl表達或TNFRl與MAP4K4相互作用，分別在膠質瘤細胞株及工具細胞中明確TNFRl與MAP4K4相互作用對MAP4K4磷酸化修飾的調節作用；(4)在TNF-α刺激下，干預TNFRl表達或TNFRl與MAP4K4相互作用，分析TNFRl與MAP4K4相互作用對膠質瘤細胞迀移及侵襲能力的影響；(5)分別構建TNFRl過表達、小干擾及不與MAP4K4相互作用的突變細胞株，利用裸鼠構建膠質瘤腦內模型，明確TNFRl與MAP4K4的相互作用對動物模型中膠質瘤發生發展的影響；
所述步驟2包括:(I)驗證膠質瘤及正常腦組織中MAP4K4與ARP3的表達，分析兩者表達的相關性，及與臨床病理因素包括患者病理級別、復發及預后的相關性；(2)分別在膠質瘤組織、工具細胞及膠質瘤細胞中驗證并分析MAP4K4與ARP3相互作用，并根據各自結構域特點分別構建截短突變質粒，明確其相互作用結構域；(3)干預MAP4K4表達或MAP4K4與ARP3相互作用，分別在膠質瘤細胞株及工具細胞中明確MAP4K4與ARP3相互作用對ARP3磷酸化修飾的調節作用；(4)干預MAP4K4表達或MAP4K4與ARP3相互作用，分析MAP4K4與ARP3相互作用對膠質瘤細胞肌動蛋白聚合、偽足生長及迀移、侵襲能力的調節作用；(5)分別構建MAP4K4過表達、小干擾及不與ARP3相互作用的突變細胞株，利用裸鼠構建膠質瘤腦內模型，明確MAP4K4與ARP3的相互作用對動物模型中膠質瘤發生發展的影響；
所述步驟3包括:(1)工具細胞及膠質瘤細胞中驗證TNFRUMAP4K4及ARP3三者兩兩相互作用，并明確TNFRl與ARP3相互作用的結構域；(2)分別在膠質瘤細胞及工具細胞中干預TNFR1/MAP4K4、MAP4K4/ARP3復合物形成，明確TNFRl影響MAP4K4對APR3的磷酸化作用；(3)分別在膠質瘤細胞及工具細胞中干預TNFR1/MAP4K4、TNFR1/ARP3及MAP4K4/ARP3復合物形成，明確TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚體對膠質瘤細胞肌動蛋白聚合、細胞偽足形成及細胞迀移、侵襲能力的影響；
所述步驟4包括:(I)綜合分析膠質瘤及正常腦組織中TNFRl、MAP4K4與ARP3表達的相關性及與臨床相關因素包括患者病理級別、復發及預后的相關性；(2)分別構建TNFRl、MAP4K4與ARP3過表達、小干擾的穩定細胞株，以I X 108密度在腦立體定位儀下注射至裸鼠皮質內，構建裸鼠膠質瘤腦內模型；(3)4周后收集腦組織，檢測腫瘤形成的大小、重量等情況，并比較其與裸鼠生存率的關系，HE染色檢測腫瘤侵襲情況；(4)獲取裸鼠腫瘤組織Western Blot及免疫組化檢測TNFRl、MAP4K4與ARP3的表達情況；(5)組織消化，原代細胞培養，重復步驟2，分析并驗證TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚體對裸鼠原代膠質瘤細胞肌動蛋白聚合、細胞偽足形成及細胞迀移、侵襲能力的影響。
[0008]進一步的，所述步驟I還包括:I)收集130例膠質瘤病例的病理組織石蠟標本，病例選擇標準為:①有影像學明確診斷(包括CT及核磁共振);②有術后病理明確診斷;③術前無放療、化療及激素治療;④組織分型和病理分級參照《2007年WHO中樞神經系統腫瘤分類標準》;收集40組膠質瘤術后新鮮癌組織及癌旁組織，結合臨床作出明確的組織分型和病理分級診斷;另取10例因急性腦外傷行內減壓術所得正常腦組織標本為對照；
2)通過Western Blot和免疫組化等方法，研究不同病理分級的膠質瘤組織、膠質瘤瘤體中心組織及周邊組織中TNFRl與MAP4K4的蛋白表達情況，將蛋白表達情況與膠質瘤的臨床因素進行相關性統計，分析TNFRl與MAP4K4表達的相關性及其表達與膠質瘤患者病理級另U、復發及預后的相關性；
3)在體外，GST-pulldown驗證TNFRl與MAP4K4存在相互作用；
①構建His標記的TNFRl及GST標記的MAP4K4的原核表達載體，誘導體外表達，分離純化His-TNFRl及GST-MAP4K4;
②將耦合有GST-MAP4K4的Glutath1ne Sepharose 4B與純化的His-TNFRl 共孵育，洗滌后予SDS裂解液裂解蛋白，Western Blot檢測His-TNFRl的表達，明確TNFRl在體外可以與MAP4K4相結合形成復合物；
4)HEK293T細胞中驗證TNFRl與MAP4K4存在相互作用；
①構建Myc標記的MAP4K4及HA標記的TNFRl的真核表達載體，共轉入HEK293T細胞，收集細胞蛋白，分別用HA及Myc抗體進行免疫共沉淀,Western Blot檢測Myc_MAP4K4及HA-TNFRl的表達，明確TNFRl與MAP4K4的外源性相互作用；
②根據TNFRl與MAP4K4的分子結構的特征，構建TNFRl及MAP4K4的截短載體，將上述截短載體共轉HEK293T細胞，免疫共沉淀聯合Western Blot分析TNFRl與MAP4K4截短載體的相互作用，明確TNFRl與MAP4K4相互作用的結構域；
5)膠質瘤細胞中驗證TNFRl與MAP4K4存在相互作用；
①收集H4、U87-MG及U251膠質瘤細胞，通過WesternBlot在蛋白水平檢測TNFRl與MAP4K4的表達；收集H4、U87-MG及U251膠質瘤細胞，通過RT-PCR在mRNA水平檢測TNFRl與MAP4K4的表達;選擇低表達的細胞株用于過表達實驗，選擇高表達的細胞株用于小干擾實驗；
②選取TNFRl與MAP4K4表達差異顯著的膠質瘤細胞株，收集細胞蛋白，分別用TNFRl及MAP4K4的抗體進行免疫共沉淀，并以同型IgG作為對照，Western Blot檢測MAP4K4及TNFRl的表達，明確在膠質瘤細胞株中TNFRl與MAP4K4的內源性相互作用；
③固定膠質瘤細胞株，分別用TNFRl與MAP4K4的特異性抗體進行免疫標記，激光共聚焦顯微鏡下觀察膠質瘤細胞中TNFRl與MAP4K4的定位情況，分析膠質瘤細胞株中TNFRl與MAP4K4的相互作用；
6)膠質瘤細胞中檢測TNFRI與MAP4K4的相互作用對MAP4K4磷酸化修飾的調節及其機制;選取高表達TNFRl的膠質瘤細胞系，予以干擾TNFRl表達;低表達TNFRl的膠質瘤細胞系，予以過表達TNFRl，同時予以TNF-a 50 ng/mL刺激48 h，對照組不予TNF-a刺激，收集細胞蛋白，用TNFRl抗體進行免疫共沉淀，Western Blot檢測TNFRl與MAP4K4相互作用的改變，及MAP4K4及P- MAP4K4的表達；
7)HEK293T細胞中檢測TNFRl與MAP4K4的相互作用對MAP4K4磷酸化修飾的調節及其機制;
①將Myc標記的MAP4K4及濃度不同的HA標記的TNFRl表達載體共轉染HEK293T細胞，同時予以TNF-a 50 ng/mL刺激48 h，對照組不予TNF-a刺激，收集細胞蛋白，用HA抗體進行免疫共沉淀，Western Blot檢測TNFRl與MAP4K4相互作用的改變，及MAP4K4及p- MAP4K4的表達；
②將Myc標記的MAP4K4分別與HA標記的TNFRl及其截短突變表達載體共轉染HEK293T細胞，予以TNF-a 50 ng/mL刺激48 h，對照組不予TNF-a刺激，收集細胞蛋白，用HA抗體進行免疫共沉淀，Western Blot檢測MAP4K4及p- MAP4K4的表達；
8)在TNF-α刺激下，檢測TNFRl及MAP4K4各自對膠質瘤細胞迀移和侵襲性的調節作用；利用先前構建的TNFR及MAP4K4的過表達或小干擾質粒，轉染膠質瘤細胞株，將細胞接種至Lamin包被的培養板上，予或不予TNF-a刺激，利用細胞劃痕實驗構建膠質瘤細胞迀移模型；接種至包被有Matrigel的8um孔徑的Transwel I小室上構建侵襲模型，檢測不同細胞的迀移及侵襲的能力；
9)在TNF-α刺激下，檢測干預TNFRl與MAP4K4的相互作用對MAP4K4及TNFRl各自調節膠質瘤細胞迀移和侵襲能力的影響；在膠質瘤細胞中共轉TNFRl的過表達載體(或小干擾質粒)及MAP4K4的過表達載體或小干擾質粒，通過細胞劃痕及Transwell侵襲實驗，檢測不同細胞的迀移及侵襲的能力；
10)分別構建TNFRl過表達、小干擾及不與MAP4K4相互作用的穩定細胞株，以IX 108密度在腦立體定位儀下注射至裸鼠皮質內，構建裸鼠膠質瘤腦內模型;4周后收集腦組織，檢測腫瘤形成的大小、重量等情況，并比較其與裸鼠生存率的關系，HE染色檢測腫瘤侵襲情況;獲取裸鼠腫瘤組織Western Blot及免疫組化檢測TNFRl及MAP4K4的表達情況;組織消化，原代細胞培養，重復實驗步驟I中(3)及(4)，驗證并分析TNFRl與MAP4K4的相互作用對裸鼠原代膠質瘤細胞迀移、侵襲能力的影響；
所述步驟2還包括:1)收集130例膠質瘤病例的病理組織石蠟標本，病例選擇標準為:①有影像學明確診斷(包括CT及核磁共振);②有術后病理明確診斷;③術前無放療、化療及激素治療;④組織分型和病理分級參照《2007年WHO中樞神經系統腫瘤分類標準》;收集40組膠質瘤術后新鮮癌組織及癌旁組織，結合臨床作出明確的組織分型和病理分級診斷；另取10例因急性腦外傷行內減壓術所得正常腦組織標本為對照；
2)通過WesternBlot和免疫組化等方法，研究不同病理分級的膠質瘤組織、膠質瘤瘤體中心組織及周邊組織中MAP4K4與ARP3的蛋白表達情況，將蛋白表達情況與膠質瘤的臨床因素進行相關性統計，分析MAP4K4與ARP3表達的相關性及其表達與膠質瘤患者病理級別、復發及預后的相關性；
3)在體外，GST-pulldown驗證MAP4K4與ARP3存在相互作用；
①構建His標記的ARP3及GST標記的MAP4K4的原核表達載體，誘導體外表達，分離純化His- ARP3及GST-MAP4K4;
②將耦合有GST-MAP4K4的Glutath1ne Sepharose 4B與純化的His- ARP3 共孵育，洗滌后予SDS裂解液裂解蛋白，Western Blot檢測His- ARP3的表達，明確ARP3在體外可以與MAP4K4相結合形成復合物；
4)HEK293T細胞中驗證MAP4K4與ARP3存在相互作用；
①構建Myc標記的MAP4K4及Flag標記的ARP3的真核表達載體，共轉入HEK293T細胞，收集細胞蛋白，用Flag及Myc抗體進行免疫共沉淀，Western Blot檢測Myc_MAP4K4及Flag-ARP3的表達，明確MAP4K4與ARP3的外源性相互作用；
②根據MAP4K4與ARP3的分子結構的特征，構建MAP4K4及ARP3的截短載體，將上述截短載體共轉HEK293T細胞，免疫共沉淀聯合Western Blot分析MAP4K4與ARP3截短載體的相互作用，明確MAP4K4與ARP3相互作用的結構域；
5)膠質瘤細胞中驗證MAP4K4與ARP3存在相互作用； ①收集H4、U87-MG及U251膠質瘤細胞，通過WesternBlot在蛋白水平檢測MAP4K4與ARP3的表達;收集H4、U87-MG及U251膠質瘤細胞，通過RT-PCR在mRNA水平檢測MAP4K4與ARP3的表達;選擇低表達的細胞株用于過表達實驗，選擇高表達的細胞株用于小干擾實驗；
②選取MAP4K4與ARP3表達差異顯著的膠質瘤細胞株，收集細胞蛋白，分別用MAP4K4與ARP3的抗體進行免疫共沉淀，并以同型IgG作為對照，Western Blot檢測MAP4K4與ARP3的表達，明確在膠質瘤細胞株中MAP4K4與ARP3的內源性相互作用；
③固定膠質瘤細胞株，分別用MAP4K4與ARP3的特異性抗體進行免疫標記，激光共聚焦顯微鏡下觀察膠質瘤細胞中MAP4K4與ARP3的定位情況，分析膠質瘤細胞株中MAP4K4與ARP3的相互作用；
6)膠質瘤細胞中檢測MAP4K4與ARP3的相互作用對ARP3磷酸化修飾的調節及其機制；
選取高表達MAP4K4的膠質瘤細胞系，予以干擾TNFRl表達;低表達MAP4K4的膠質瘤細胞系，予以過表達MAP4K4，收集細胞蛋白，用MAP4K4抗體進行免疫共沉淀，Western Blot檢測MAP4K4與ARP3相互作用的改變，及ARP3和P- ARP3的表達；
7)HEK293T細胞中檢測MAP4K4與ARP3的相互作用對ARP3磷酸化修飾的調節及其機制；
①將Flag標記的ARP3及濃度不同的Myc標記的MAP4K4表達載體共轉染HEK293T細胞，收集細胞蛋白，用Myc抗體進行免疫共沉淀，Western Blot檢測MAP4K4與ARP3相互作用的改變，及ARP3和P- ARP3的表達；
②將Flag標記的ARP3分別與Myc標記的MAP4K4及其截短突變表達載體共轉染HEK293T細胞，收集細胞蛋白，用Myc抗體進行免疫共沉淀，Western Blot檢測ARP3及p- ARP3的表達；
8)檢測MAP4K4及ARP3各自對膠質瘤細胞肌動蛋白聚合、偽足生長及迀移、侵襲能力的調節作用；
利用先前構建的MAP4K4及ARP3的過表達或小干擾質粒，轉染膠質瘤細胞株，用免疫熒光檢測肌動蛋白的聚合及其速度的改變;免疫熒光及光鏡技術檢測細胞偽足生長的改變；細胞劃痕TranswelI侵襲實驗，檢測不同細胞的迀移及侵襲的能力；
9)檢測干預MAP4K4及ARP3的表達對ARP3及MAP4K4各自調節膠質瘤細胞肌動蛋白聚合、偽足生長及迀移、侵襲能力的影響；
在膠質瘤細胞中共轉MAP4K4的過表達載體(或小干擾質粒)及ARP3的過表達載體及小干擾質粒，用免疫熒光檢測肌動蛋白的聚合及其速度的改變;免疫熒光及光鏡技術檢測細胞偽足生長的改變;細胞劃痕Transwel I侵襲實驗，檢測不同細胞的迀移及侵襲的能力；
10)分別構建MAP4K4過表達、小干擾及不與ARP3相互作用的穩定細胞株，以IX 108密度在腦立體定位儀下注射至裸鼠皮質內，構建裸鼠膠質瘤腦內模型;4周后收集腦組織，檢測腫瘤形成的大小、重量等情況，并比較其與裸鼠生存率的關系，HE染色檢測腫瘤侵襲情況；獲取裸鼠腫瘤組織Western Blot及免疫組化檢測MAP4K4及ARP3的表達情況;組織消化，原代細胞培養，重復實驗步驟2中(3)及(4)，驗證并分析MAP4K4與ARP3的相互作用對裸鼠原代膠質瘤細胞迀移、侵襲能力的影響；
所述步驟3還包括:I)在體外，GST-pull down驗證TNFRl與ARP3存在相互作用；
①構建Hi s標記的ARP3及GST標記的TNFRl的原核表達載體，誘導體外表達，分離純化His- ARP3及GST-TNFR1; ②將耦合有GST- TNFRl的Glutath1ne Sepharose 4B與純化的His- ARP3共孵育，洗滌后予SDS裂解液裂解蛋白，Western Blot檢測His- ARP3的表達，明確ARP3在體外可以與TNFRl相結合形成復合物；
2)HEK293T細胞中驗證TNFRl與ARP3存在相互作用；
①構建HA標記的TNFRl及Flag標記的ARP3的真核表達載體，共轉入HEK293T細胞，收集細胞蛋白，用Flag及HA抗體進行免疫共沉淀，Western Blot檢測HA-TNFR1及Flag_ARP3的表達，明確TNFRl與ARP3的外源性相互作用；
②根據TNFRl與ARP3的分子結構的特征，構建TNFRl及ARP3的截短載體，將上述截短載體共轉HEK293T細胞，免疫共沉淀聯合Western Blot分析TNFRl與ARP3截短載體的相互作用，明確TNFRl與ARP3相互作用的結構域；
3)膠質瘤細胞中驗證TNFRl與ARP3存在相互作用；
①選取TNFRl與ARP3表達差異顯著的膠質瘤細胞株，收集細胞蛋白，分別用TNFRl與ARP3的抗體進行免疫共沉淀，并以同型IgG作為對照，Western Blot檢測TNFRl與ARP3的表達，明確在膠質瘤細胞株中TNFRl與ARP3的內源性相互作用；
③固定膠質瘤細胞株，分別用TNFRl與ARP3的特異性抗體進行免疫標記，激光共聚焦顯微鏡下觀察膠質瘤細胞中TNFRl與ARP3的定位情況，分析膠質瘤細胞株中TNFRl與ARP3的相互作用；
4)膠質瘤細胞中檢測TNFR1、ARP3及MAP4K4的相互作用對MAP4K4及ARP3磷酸化修飾的調節及其機制；
①選取高表達TNFRl的膠質瘤細胞系，干擾TNFRl表達;低表達TNFRl的膠質瘤細胞系，過表達TNFRl，予或不予TNF-α刺激，收集細胞蛋白，用TNFRl抗體進行免疫共沉淀，WesternBlot檢測ARP3及p-ARP3的表達；
②選取高表達TNFRl的膠質瘤細胞系，干擾TNFRl表達;低表達TNFRl的膠質瘤細胞系，過表達TNFRl，予或不予TNF-a刺激，收集細胞蛋白，檢測MAP4K4及p- MAP4K4表達的變化；
③若上一個步驟②中MAP4K4的表達有變化，在②的基礎上，干預MAP4K4的表達，用TNFRl抗體進行免疫共沉淀，Western Blot檢測ARP3及p_ARP3的表達是否改變；
5)HEK293T細胞中檢測TNFR1、ARP3及MAP4K4的相互作用對MAP4K4及ARP3磷酸化修飾的調節及其機制；
①將Flag標記的ARP3及濃度不同的HA標記的TNFRl表達載體共轉染HEK293T細胞，予或不予TNF-α刺激，收集細胞蛋白，用HA抗體進行免疫共沉淀，Western Blot檢測ARP3及p-ARP3的表達；
②將Flag標記的ARP3分別與HA標記的TNFRl及其截短突變表達載體共轉染HEK293T細胞，予或不予TNF-α刺激，收集細胞蛋白，用HA抗體進行免疫共沉淀，Western Blot檢測ARP3及P-ARP3的表達；
③將Flag標記的ARP3及濃度不同的HA標記的TNFRl表達載體共轉染HEK293T細胞，予或不予TNF-α刺激，收集細胞蛋白，檢測MAP4K4及P- MAP4K4表達的變化；
④若上一個步驟③中MAP4K4的表達有變化，在③的基礎上，干預MAP4K4的表達，用HA抗體進行免疫共沉淀，Western Blot檢測ARP3及p_ARP3的表達是否改變；
6)在步驟I及步驟2中，已檢測TNFRl、MAP4K4及ARP3各自對膠質瘤細胞肌動蛋白聚合、偽足生長及迀移、侵襲能力的調節作用；
7)在TNF-α刺激下，檢測干預TNFR1/ARP3復合物的形成對TNFRl促進ARP3磷酸化，調節膠質瘤細胞肌動蛋白聚合、偽足生長及迀移、侵襲能力的影響，明確TNFRl通過促進ARP3磷酸化，來促進膠質瘤侵襲性生長；
在膠質瘤細胞中共轉TNFRl的過表達載體(或小干擾質粒)及ARP3的過表達載體及小干擾質粒，予或不予TNF-a刺激，用Western Blot檢測ARP3及p_ARP3的表達;免疫熒光檢測肌動蛋白的聚合及其速度的改變;光鏡技術檢測細胞偽足生長的改變;細胞劃痕及Transwel I侵襲實驗，檢測不同細胞的迀移及侵襲的能力；
8)在TNF-α刺激下，檢測干預MAP4K4/ARP3復合物的形成對MAP4K4調節ARP3磷酸化及膠質瘤細胞肌動蛋白聚合、偽足生長及迀移、侵襲能力的影響，明確MAP4K4通過磷酸化ARP3，從而促進膠質瘤侵襲性生長；
在膠質瘤細胞中共轉ARP3的過表達載體(或小干擾質粒)及MAP4K4的過表達載體及小干擾質粒，予或不予TNF-a刺激，用Western Blot檢測ARP3及p_ARP3的表達;免疫熒光檢測肌動蛋白的聚合及其速度的改變；光鏡技術檢測細胞偽足生長的改變；細胞劃痕及TranswelI侵襲實驗，檢測不同細胞的迀移及侵襲的能力；
9)在TNF-α刺激下，檢測干預TNFR1/MAP4K4復合物的形成對MAP4K4磷酸化ARP3，從而調節膠質瘤細胞肌動蛋白聚合、偽足生長及迀移、侵襲能力的影響，明確TNFRl通過招募MAP4K4，從而磷酸化ARP3，促進膠質瘤侵襲性生長；
在膠質瘤細胞中共轉TNFRl的過表達載體(或小干擾質粒)及MAP4K4的過表達載體或小干擾載體，予或不予TNF-a刺激，用Western Blot檢測ARP3及p_ARP3的表達;免疫熒光檢測肌動蛋白的聚合及其速度的改變；光鏡技術檢測細胞偽足生長的改變；細胞劃痕及TranswelI侵襲實驗，檢測不同細胞的迀移及侵襲的能力；
所述步驟4還包括:1)收集130例膠質瘤病例的病理組織石蠟標本，病例選擇標準為:①有影像學明確診斷(包括CT及核磁共振);②有術后病理明確診斷;③術前無放療、化療及激素治療;④組織分型和病理分級參照《2007年WHO中樞神經系統腫瘤分類標準》;收集40組膠質瘤手術新鮮組織及瘤旁組織，結合臨床作出明確的組織分型和病理分級診斷；另取10例因急性腦外傷行內減壓術所得正常腦組織標本為對照；
2)通過Western Blot和免疫組化等方法，研究不同病理分級的膠質瘤組織、膠質瘤瘤體中心組織及周邊組織中TNFRl、MAP4K4與ARP3的蛋白表達情況，將蛋白表達情況與膠質瘤的臨床因素進行相關性統計，分析TNFRl、MAP4K4與ARP3表達的相關性及其表達與膠質瘤患者病理級別、復發及預后的相關性。
[0009]實驗方法理論依據:炎癥微環境中，活化的TNFRl參與多種腫瘤的惡性轉化，并已被報道可增強膠質瘤的侵襲性;ARP3是ARP2/3復合物組成成分之一，后者可以直接調節肌動蛋白的聚合及偽足的形成，在細胞運動及腫瘤侵襲性生長過程中起重要作用，且有研究證明ARP2/3復合物的磷酸化在其活化過程中必不可MAP4K4是ARP2/3復合物磷酸化修飾的激酶之一，具備調節肌動蛋白細胞骨架的功能，且在多種腫瘤中發現MAP4K4可促進腫瘤細胞的侵襲;有文獻報道TNFRl活化后可以招募TRAF2形成復合體結構，而TRAF2可與MAP4K4結合，調節MAP4K4的活性;預實驗發現TNFRl可以與ARP3相互作用，并且二者在膠質瘤組織中的表達與腫瘤病理等級、復發及膠質瘤細胞的迀移和侵襲呈正相關；在TNF-α的刺激下，ARP3的磷酸化表達增加，其磷酸化水平與膠質瘤的惡性程度及膠質瘤細胞的迀移和侵襲呈正相關;而且TNFRl及ARP3均與MAP4K4有相互作用，這提示在膠質瘤發生發展過程中，TNFRl與ARP3的相互作用具有重要的生物學意義；因此推測:在膠質瘤炎癥微環境中，TNFRl被其配體TNF-α活化，招募并激活MAP4K4，磷酸化ARP3，激活ARP2/3復合物，促進肌動蛋白聚合及偽足形成，增強膠質瘤細胞的侵襲性生長；
實驗方法技術保障:膠質瘤培養和分析技術;基因克隆、表達和干預技術;蛋白體外表達、Western Blot、免疫共沉淀、免疫組化和激光共聚焦等蛋白質分析技術;Northern Blot或Real time-PCR等核酸研究技術;染色質免疫共沉淀、凝膠電泳迀移實驗等轉錄調控分析技術;已經構建TNFRl、ARP3及MAP4K4的表達載體、干擾載體及突變載體，并且已經掌握慢病毒包轉技術;所需要的實驗材料如抗體、試劑盒等均可以商購;這將為本實驗的開展提供重要的技術支持和保障。
[0010]
【附圖說明】
[0011]圖1是膠質瘤組織中TNFRl、ARP3的表達情況(A.免疫組化檢測不同級別膠質瘤病理組織中TNFRl和ARP3的表達；B.WesternBlot檢測不同級別膠質瘤病理組織中TNFRl和ARP3的表達)
圖2是130例膠質瘤組織標本中TNFRl及ARP3的表達與臨床病理因素的相關性(注:*P〈0.05，差異有統計學意義)
圖3是膠質瘤組織中TNFRl與ARP3表達的相關性(統計學分析顯示膠質瘤中TNFRl與ARP3的表達呈正相關)
圖4是細胞劃痕及Transwell實驗證實TNFRl促進膠質瘤細胞迀移及侵襲(A.膠質瘤U251細胞中轉染TNFRl過表達及空載質粒，36小時后行細胞劃痕實驗檢測細胞迀移能力;B.膠質瘤U251細胞中轉染TNFRl過表達及空載質粒，36小時后行Transwel I實驗檢測細胞侵襲能力)
圖5是膠質瘤組織中TNFRUMAP4K4及ARP3存在相互作用(A.免疫共沉淀檢測膠質瘤組織中TNFRl與ARP3的相互作用；B.免疫共沉淀檢測膠質瘤組織中TNFRl與MAP4K4的相互作用;C.免疫共沉淀檢測膠質瘤組織中MAP4K4與ARP3的相互作用)
圖6是膠質瘤細胞中TNF-α對膠質瘤細胞迀移、侵襲能力及ARP3磷酸化的影響，ARP3磷酸化與膠質瘤細胞迀移、侵襲能力的關系(A.在膠質瘤U251細胞中予以Ong/ml，lng/ml，10ng/ml，50ng/ml及 100ng/ml的TNF-a刺激24小時，收集細胞蛋白，WesternBlot檢測p_ARP3的表達情況；B.在膠質瘤U251細胞中予以TNF-a 50ng/ml刺激24小時，細胞劃痕實驗檢測細胞迀移能力；C.在膠質瘤U251細胞中予以TNF-a 50ng/ml刺激24小時，Transwell實驗檢測細胞侵襲能力;D.在膠質瘤U251細胞中予以TNF-α刺激，收集細胞蛋白，western blot檢iIlJp-ARP3NE-cadherinNvimentin^.N-cadherin|3tl^ii)
圖7是研究方法步驟I的技術路線圖；
圖8是研究方法步驟2的技術路線圖；
圖9是研究方法步驟3的技術路線圖；
圖10是研究方法步驟4的技術路線圖；
【具體實施方式】
[0012]實施例1:
研究內容:
I，分析TNFRl與MAP4K4的相互作用及其機制，明確膠質瘤炎癥微環境中，TNFRl招募并激活MAP4K4，從而促進膠質瘤侵襲性生長；
2，分析MAP4K4與ARP3的相互作用及其機制，明確在膠質瘤進展中，MAP4K4通過磷酸化ARP3，激活ARP2/3復合物，促進肌動蛋白聚合及偽足形成，增強膠質瘤細胞的侵襲性；
3，分析TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚體的相互作用及其機制，明確膠質瘤炎癥微環境中，TNFRl通過招募并激活MAP4K4，從而磷酸化ARP3，激活ARP2/3復合物，促進肌動蛋白聚合及偽足形成，增強膠質瘤細胞的侵襲性；
4，利用膠質瘤臨床病理標本及構建裸鼠膠質瘤腦內模型，在整體水平全面探討分析TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚體對膠質瘤在體內侵襲性生長的影響。
[0013]實驗方案:
步驟I，分析TNFRl與MAP4K4的相互作用及其機制，明確膠質瘤炎癥微環境中，TNFRl招募并激活MAP4K4，從而促進膠質瘤侵襲性生長；
本部分實驗步驟如圖7:
(1)驗證膠質瘤及正常腦組織中TNFRl與MAP4K4的表達，分析兩者表達的相關性，及與臨床病理因素包括患者病理級別、復發及預后的相關性；
1)收集130例膠質瘤病例的病理組織石蠟標本，病例選擇標準為:①有影像學明確診斷(包括CT及核磁共振)；②有術后病理明確診斷;③術前無放療、化療及激素治療;④組織分型和病理分級參照《2007年WHO中樞神經系統腫瘤分類標準》;收集40組膠質瘤術后新鮮癌組織及癌旁組織，結合臨床作出明確的組織分型和病理分級診斷；另取10例因急性腦外傷行內減壓術所得正常腦組織標本為對照；
2)通過WesternBlot和免疫組化等方法，研究不同病理分級的膠質瘤組織、膠質瘤瘤體中心組織及周邊組織中TNFRl與MAP4K4的蛋白表達情況，將蛋白表達情況與膠質瘤的臨床因素進行相關性統計，分析TNFRl與MAP4K4表達的相關性及其表達與膠質瘤患者病理級另U、復發及預后的相關性；
(2)分別在膠質瘤組織、工具細胞及膠質瘤細胞中驗證并分析TNFRl與MAP4K4的相互作用，并根據各自結構域特點分別構建截短突變質粒，明確其相互作用結構域；
1)在體外，GST-pulldown驗證TNFRl與MAP4K4存在相互作用；
①構建His標記的TNFRl及GST標記的MAP4K4的原核表達載體，誘導體外表達，分離純化His-TNFRl及GST-MAP4K4;
②將耦合有GST-MAP4K4的Glutath1ne Sepharose 4B與純化的His-TNFRl 共孵育，洗滌后予SDS裂解液裂解蛋白，Western Blot檢測His-TNFRl的表達，明確TNFRl在體外可以與MAP4K4相結合形成復合物；
2)HEK293T細胞中驗證TNFRl與MAP4K4存在相互作用；
①構建Myc標記的MAP4K4及HA標記的TNFRl的真核表達載體，共轉入HEK293T細胞，收集細胞蛋白，分別用HA及Myc抗體進行免疫共沉淀,Western Blot檢測Myc_MAP4K4及HA-TNFRl的表達，明確TNFRl與MAP4K4的外源性相互作用；
②根據TNFRl與MAP4K4的分子結構的特征，構建TNFRl及MAP4K4的截短載體，將上述截短載體共轉HEK293T細胞，免疫共沉淀聯合Western Blot分析TNFRl與MAP4K4截短載體的相互作用，明確TNFRl與MAP4K4相互作用的結構域；
3)膠質瘤細胞中驗證TNFRl與MAP4K4存在相互作用；
①收集H4、U87-MG及U251膠質瘤細胞，通過WesternBlot在蛋白水平檢測TNFRl與MAP4K4的表達；收集H4、U87-MG及U251膠質瘤細胞，通過RT-PCR在mRNA水平檢測TNFRl與MAP4K4的表達;選擇低表達的細胞株用于過表達實驗，選擇高表達的細胞株用于小干擾實驗；
②選取TNFRl與MAP4K4表達差異顯著的膠質瘤細胞株，收集細胞蛋白，分別用TNFRl及MAP4K4的抗體進行免疫共沉淀，并以同型IgG作為對照，Western Blot檢測MAP4K4及TNFRl的表達，明確在膠質瘤細胞株中TNFRl與MAP4K4的內源性相互作用；
③固定膠質瘤細胞株，分別用TNFRl與MAP4K4的特異性抗體進行免疫標記，激光共聚焦顯微鏡下觀察膠質瘤細胞中TNFRl與MAP4K4的定位情況，分析膠質瘤細胞株中TNFRl與MAP4K4的相互作用；
(3)在TNF-α刺激下，干預TNFRl表達或TNFRl與MAP4K4相互作用，分別在膠質瘤細胞株及工具細胞中明確TNFRl與MAP4K4相互作用對MAP4K4磷酸化修飾的調節作用；
1)膠質瘤細胞中檢測TNFRI與MAP4K4的相互作用對MAP4K4磷酸化修飾的調節及其機制;
選取高表達TNFRl的膠質瘤細胞系，予以干擾TNFRl表達；低表達TNFRl的膠質瘤細胞系，予以過表達TNFRl，同時予以TNF-a 50 ng/mL刺激48 h，對照組不予TNF-a刺激，收集細胞蛋白，用TNFRl抗體進行免疫共沉淀，Western Blot檢測TNFRl與MAP4K4相互作用的改變，及MAP4K4及P- MAP4K4的表達；
2)HEK293T細胞中檢測TNFRl與MAP4K4的相互作用對MAP4K4磷酸化修飾的調節及其機制;
①將Myc標記的MAP4K4及濃度不同的HA標記的TNFRl表達載體共轉染HEK293T細胞，同時予以TNF-a 50 ng/mL刺激48 h，對照組不予TNF-a刺激，收集細胞蛋白，用HA抗體進行免疫共沉淀，Western Blot檢測TNFRl與MAP4K4相互作用的改變，及MAP4K4及p- MAP4K4的表達；
②將Myc標記的MAP4K4分別與HA標記的TNFRl及其截短突變表達載體共轉染HEK293T細胞，予以TNF-a 50 ng/mL刺激48 h，對照組不予TNF-a刺激，收集細胞蛋白，用HA抗體進行免疫共沉淀，Western Blot檢測MAP4K4及p- MAP4K4的表達；
(4)在TNF-a刺激下，干預TNFRl表達或TNFRl與MAP4K4相互作用，分析TNFRl與MAP4K4相互作用對膠質瘤細胞迀移及侵襲能力的影響；
I)在TNF-a刺激下，檢測TNFRl及MAP4K4各自對膠質瘤細胞迀移和侵襲性的調節作用；
利用先前構建的TNFR及MAP4K4的過表達或小干擾質粒，轉染膠質瘤細胞株，將細胞接種至Lamin包被的培養板上，予或不予TNF-a刺激，利用細胞劃痕實驗構建膠質瘤細胞迀移模型；接種至包被有Matrigel的8um孔徑的TranswelI小室上構建侵襲模型，檢測不同細胞的迀移及侵襲的能力； 2)在TNF-α刺激下，檢測干預TNFRl與MAP4K4的相互作用對MAP4K4及TNFRl各自調節膠質瘤細胞迀移和侵襲能力的影響；
在膠質瘤細胞中共轉TNFRl的過表達載體(或小干擾質粒)及MAP4K4的過表達載體或小干擾質粒，通過細胞劃痕及Transwell侵襲實驗，檢測不同細胞的迀移及侵襲的能力；
(5 )分別構建TNFRl過表達、小干擾及不與MAP4K4相互作用的突變細胞株，利用裸鼠構建膠質瘤腦內模型，明確TNFRl與MAP4K4的相互作用對動物模型中膠質瘤發生發展的影響；
分別構建TNFRl過表達、小干擾及不與MAP4K4相互作用的穩定細胞株，以I X 108密度在腦立體定位儀下注射至裸鼠皮質內，構建裸鼠膠質瘤腦內模型;4周后收集腦組織，檢測腫瘤形成的大小、重量等情況，并比較其與裸鼠生存率的關系，HE染色檢測腫瘤侵襲情況;獲取裸鼠腫瘤組織Western Blot及免疫組化檢測TNFRl及MAP4K4的表達情況;組織消化，原代細胞培養，重復實驗步驟(3)及(4)，驗證并分析TNFRl與MAP4K4的相互作用對裸鼠原代膠質瘤細胞迀移、侵襲能力的影響；
步驟2，分析MAP4K4與ARP3的相互作用及其機制，明確在膠質瘤進展中，MAP4K4通過磷酸化ARP3，激活ARP2/3復合物，促進肌動蛋白聚合及偽足形成，增強膠質瘤細胞的侵襲性；
本部分實驗步驟如圖8:
Cl)驗證膠質瘤及正常腦組織中MAP4K4與ARP3的表達，分析兩者表達的相關性，及與臨床病理因素包括患者病理級別、復發及預后的相關性；
1)收集130例膠質瘤病例的病理組織石蠟標本，病例選擇標準為:①有影像學明確診斷(包括CT及核磁共振)；②有術后病理明確診斷;③術前無放療、化療及激素治療;④組織分型和病理分級參照《2007年WHO中樞神經系統腫瘤分類標準》;收集40組膠質瘤術后新鮮癌組織及癌旁組織，結合臨床作出明確的組織分型和病理分級診斷；另取10例因急性腦外傷行內減壓術所得正常腦組織標本為對照；
2)通過WesternBlot和免疫組化等方法，研究不同病理分級的膠質瘤組織、膠質瘤瘤體中心組織及周邊組織中MAP4K4與ARP3的蛋白表達情況，將蛋白表達情況與膠質瘤的臨床因素進行相關性統計，分析MAP4K4與ARP3表達的相關性及其表達與膠質瘤患者病理級別、復發及預后的相關性；
(2)分別在膠質瘤組織、工具細胞及膠質瘤細胞中驗證并分析MAP4K4與ARP3相互作用，并根據各自結構域特點分別構建截短突變質粒，明確其相互作用結構域；
1)在體外，GST-pulldown驗證MAP4K4與ARP3存在相互作用；
①構建His標記的ARP3及GST標記的MAP4K4的原核表達載體，誘導體外表達，分離純化His- ARP3及GST-MAP4K4;
②將耦合有GST-MAP4K4的Glutath1ne Sepharose 4B與純化的His- ARP3 共孵育，洗滌后予SDS裂解液裂解蛋白，Western Blot檢測His- ARP3的表達，明確ARP3在體外可以與MAP4K4相結合形成復合物；
2)HEK293T細胞中驗證MAP4K4與ARP3存在相互作用；
①構建Myc標記的MAP4K4及Flag標記的ARP3的真核表達載體，共轉入HEK293T細胞，收集細胞蛋白，用Flag及Myc抗體進行免疫共沉淀，Western Blot檢測Myc_MAP4K4及Flag-ARP3的表達，明確MAP4K4與ARP3的外源性相互作用；
②根據MAP4K4與ARP3的分子結構的特征，構建MAP4K4及ARP3的截短載體，將上述截短載體共轉HEK293T細胞，免疫共沉淀聯合Western Blot分析MAP4K4與ARP3截短載體的相互作用，明確MAP4K4與ARP3相互作用的結構域；
3)膠質瘤細胞中驗證MAP4K4與ARP3存在相互作用；
①收集H4、U87-MG及U251膠質瘤細胞，通過WesternBlot在蛋白水平檢測MAP4K4與ARP3的表達;收集H4、U87-MG及U251膠質瘤細胞，通過RT-PCR在mRNA水平檢測MAP4K4與ARP3的表達;選擇低表達的細胞株用于過表達實驗，選擇高表達的細胞株用于小干擾實驗；
②選取MAP4K4與ARP3表達差異顯著的膠質瘤細胞株，收集細胞蛋白，分別用MAP4K4與ARP3的抗體進行免疫共沉淀，并以同型IgG作為對照，Western Blot檢測MAP4K4與ARP3的表達，明確在膠質瘤細胞株中MAP4K4與ARP3的內源性相互作用；
③固定膠質瘤細胞株，分別用MAP4K4與ARP3的特異性抗體進行免疫標記，激光共聚焦顯微鏡下觀察膠質瘤細胞中MAP4K4與ARP3的定位情況，分析膠質瘤細胞株中MAP4K4與ARP3的相互作用；
(3)干預MAP4K4表達或MAP4K4與ARP3相互作用，分別在膠質瘤細胞株及工具細胞中明確MAP4K4與ARP3相互作用對ARP3磷酸化修飾的調節作用；
1)膠質瘤細胞中檢測MAP4K4與ARP3的相互作用對ARP3磷酸化修飾的調節及其機制；
選取高表達MAP4K4的膠質瘤細胞系，予以干擾TNFRl表達;低表達MAP4K4的膠質瘤細胞系，予以過表達MAP4K4，收集細胞蛋白，用MAP4K4抗體進行免疫共沉淀，Western Blot檢測MAP4K4與ARP3相互作用的改變，及ARP3和P- ARP3的表達；
2)HEK293T細胞中檢測MAP4K4與ARP3的相互作用對ARP3磷酸化修飾的調節及其機制；
①將Flag標記的ARP3及濃度不同的Myc標記的MAP4K4表達載體共轉染HEK293T細胞，收集細胞蛋白，用Myc抗體進行免疫共沉淀，Western Blot檢測MAP4K4與ARP3相互作用的改變，及ARP3和P- ARP3的表達；
②將Flag標記的ARP3分別與Myc標記的MAP4K4及其截短突變表達載體共轉染HEK293T細胞，收集細胞蛋白，用Myc抗體進行免疫共沉淀，Western Blot檢測ARP3及p- ARP3的表達；
(4)干預MAP4K4表達或MAP4K4與ARP3相互作用，分析MAP4K4與ARP3相互作用對膠質瘤細胞肌動蛋白聚合、偽足生長及迀移、侵襲能力的調節作用；
1)檢測MAP4K4及ARP3各自對膠質瘤細胞肌動蛋白聚合、偽足生長及迀移、侵襲能力的調節作用；
利用先前構建的MAP4K4及ARP3的過表達或小干擾質粒，轉染膠質瘤細胞株，用免疫熒光檢測肌動蛋白的聚合及其速度的改變;免疫熒光及光鏡技術檢測細胞偽足生長的改變；細胞劃痕TranswelI侵襲實驗，檢測不同細胞的迀移及侵襲的能力；
2)檢測干預MAP4K4及ARP3的表達對ARP3及MAP4K4各自調節膠質瘤細胞肌動蛋白聚合、偽足生長及迀移、侵襲能力的影響；
在膠質瘤細胞中共轉MAP4K4的過表達載體(或小干擾質粒)及ARP3的過表達載體及小干擾質粒，用免疫熒光檢測肌動蛋白的聚合及其速度的改變;免疫熒光及光鏡技術檢測細胞偽足生長的改變;細胞劃痕Transwel I侵襲實驗，檢測不同細胞的迀移及侵襲的能力；
(5)分別構建MAP4K4過表達、小干擾及不與ARP3相互作用的突變細胞株，利用裸鼠構建膠質瘤腦內模型，明確MAP4K4與ARP3的相互作用對動物模型中膠質瘤發生發展的影響； 分別構建MAP4K4過表達、小干擾及不與ARP3相互作用的穩定細胞株，以I X 108密度在腦立體定位儀下注射至裸鼠皮質內，構建裸鼠膠質瘤腦內模型;4周后收集腦組織，檢測腫瘤形成的大小、重量等情況，并比較其與裸鼠生存率的關系，HE染色檢測腫瘤侵襲情況;獲取裸鼠腫瘤組織Western Blot及免疫組化檢測MAP4K4及ARP3的表達情況;組織消化，原代細胞培養，重復實驗步驟(3)及(4)，驗證并分析MAP4K4與ARP3的相互作用對裸鼠原代膠質瘤細胞迀移、侵襲能力的影響；
步驟3，分析TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚體的相互作用及其機制，明確膠質瘤炎癥微環境中，TNFRl通過招募并激活MAP4K4，從而磷酸化ARP3，激活ARP2/3復合物，促進肌動蛋白聚合及偽足形成，增強膠質瘤細胞的侵襲性；
本部分實驗步驟如圖9:
(1)工具細胞及膠質瘤細胞中驗證TNFRl、MAP4K4及ARP3三者兩兩相互作用，并明確TNFRl與ARP3相互作用的結構域(在步驟I及步驟2中，已驗證TNFR1/MAP4K4及MAP4K4/ARP3的相互作用)；
1)在體外，GST-pulldown驗證TNFRl與ARP3存在相互作用；
①構建His標記的ARP3及GST標記的TNFRl的原核表達載體，誘導體外表達，分離純化His- ARP3及GST-TNFR1;
②將耦合有GST-TNFRl的Glutath1ne Sepharose 4B與純化的His- ARP3共孵育，洗滌后予SDS裂解液裂解蛋白，Western Blot檢測His- ARP3的表達，明確ARP3在體外可以與TNFRl相結合形成復合物；
2)HEK293T細胞中驗證TNFRl與ARP3存在相互作用；
①構建HA標記的TNFRl及Flag標記的ARP3的真核表達載體，共轉入HEK293T細胞，收集細胞蛋白，用Flag及HA抗體進行免疫共沉淀，Western Blot檢測HA-TNFR1及Flag_ARP3的表達，明確TNFRl與ARP3的外源性相互作用；
②根據TNFRl與ARP3的分子結構的特征，構建TNFRl及ARP3的截短載體，將上述截短載體共轉HEK293T細胞，免疫共沉淀聯合Western Blot分析TNFRl與ARP3截短載體的相互作用，明確TNFRl與ARP3相互作用的結構域；
3)膠質瘤細胞中驗證TNFRl與ARP3存在相互作用；
①選取TNFRl與ARP3表達差異顯著的膠質瘤細胞株，收集細胞蛋白，分別用TNFRl與ARP3的抗體進行免疫共沉淀，并以同型IgG作為對照，Western Blot檢測TNFRl與ARP3的表達，明確在膠質瘤細胞株中TNFRl與ARP3的內源性相互作用；
③固定膠質瘤細胞株，分別用TNFRl與ARP3的特異性抗體進行免疫標記，激光共聚焦顯微鏡下觀察膠質瘤細胞中TNFRl與ARP3的定位情況，分析膠質瘤細胞株中TNFRl與ARP3的相互作用；
(2)分別在膠質瘤細胞及工具細胞中干預TNFR1/MAP4K4、MAP4K4/ARP3復合物形成，明確TNFRl影響MAP4K4對APR3的磷酸化作用；
I)膠質瘤細胞中檢測TNFR1、ARP3及MAP4K4的相互作用對MAP4K4及ARP3磷酸化修飾的調節及其機制；
①選取高表達TNFRl的膠質瘤細胞系，干擾TNFRl表達;低表達TNFRl的膠質瘤細胞系，過表達TNFRl，予或不予TNF-α刺激，收集細胞蛋白，用TNFRl抗體進行免疫共沉淀，WesternBlot檢測ARP3及p-ARP3的表達；
②選取高表達TNFRl的膠質瘤細胞系，干擾TNFRl表達;低表達TNFRl的膠質瘤細胞系，過表達TNFRl，予或不予TNF-α刺激，收集細胞蛋白，檢測MAP4K4及p- MAP4K4表達的變化；
③若步驟②中MAP4K4的表達有變化，在②的基礎上，干預MAP4K4的表達，用TNFRl抗體進行免疫共沉淀，Western Blot檢測ARP3及p_ARP3的表達是否改變；
2)HEK293T細胞中檢測TNFR1、ARP3及MAP4K4的相互作用對MAP4K4及ARP3磷酸化修飾的調節及其機制；
①將Flag標記的ARP3及濃度不同的HA標記的TNFRl表達載體共轉染HEK293T細胞，予或不予TNF-α刺激，收集細胞蛋白，用HA抗體進行免疫共沉淀，Western Blot檢測ARP3及p-ARP3的表達；
②將Flag標記的ARP3分別與HA標記的TNFRl及其截短突變表達載體共轉染HEK293T細胞，予或不予TNF-α刺激，收集細胞蛋白，用HA抗體進行免疫共沉淀，Western Blot檢測ARP3及P-ARP3的表達；
③將Flag標記的ARP3及濃度不同的HA標記的TNFRl表達載體共轉染HEK293T細胞，予或不予TNF-α刺激，收集細胞蛋白，檢測MAP4K4及P- MAP4K4表達的變化；
④若步驟③中MAP4K4的表達有變化，在③的基礎上，干預MAP4K4的表達，用HA抗體進行免疫共沉淀，Western Blot檢測ARP3及p_ARP3的表達是否改變；
(3)分別在膠質瘤細胞及工具細胞中干預TNFR1/MAP4K4、TNFR1/ARP3及MAP4K4/ARP3復合物形成，明確TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚體對膠質瘤細胞肌動蛋白聚合、細胞偽足形成及細胞迀移、侵襲能力的影響；
1)在研究方案步驟I及步驟2中，已檢測TNFRl、MAP4K4及ARP3各自對膠質瘤細胞肌動蛋白聚合、偽足生長及迀移、侵襲能力的調節作用；
2)在TNF-a刺激下，檢測干預TNFR1/ARP3復合物的形成對TNFRl促進ARP3磷酸化，調節膠質瘤細胞肌動蛋白聚合、偽足生長及迀移、侵襲能力的影響，明確TNFRl通過促進ARP3磷酸化，來促進膠質瘤侵襲性生長；
在膠質瘤細胞中共轉TNFRl的過表達載體(或小干擾質粒)及ARP3的過表達載體及小干擾質粒，予或不予TNF-a刺激，用Western Blot檢測ARP3及p_ARP3的表達;免疫熒光檢測肌動蛋白的聚合及其速度的改變;光鏡技術檢測細胞偽足生長的改變;細胞劃痕及Transwel I侵襲實驗，檢測不同細胞的迀移及侵襲的能力；
3)在TNF-α刺激下，檢測干預MAP4K4/ARP3復合物的形成對MAP4K4調節ARP3磷酸化及膠質瘤細胞肌動蛋白聚合、偽足生長及迀移、侵襲能力的影響，明確MAP4K4通過磷酸化ARP3，從而促進膠質瘤侵襲性生長；
在膠質瘤細胞中共轉ARP3的過表達載體(或小干擾質粒)及MAP4K4的過表達載體及小干擾質粒，予或不予TNF-a刺激，用Western Blot檢測ARP3及p_ARP3的表達;免疫熒光檢測肌動蛋白的聚合及其速度的改變；光鏡技術檢測細胞偽足生長的改變；細胞劃痕及TranswelI侵襲實驗，檢測不同細胞的迀移及侵襲的能力；
4)在TNF-α刺激下，檢測干預TNFR1/MAP4K4復合物的形成對MAP4K4磷酸化ARP3，從而調節膠質瘤細胞肌動蛋白聚合、偽足生長及迀移、侵襲能力的影響，明確TNFRl通過招募MAP4K4，從而磷酸化ARP3，促進膠質瘤侵襲性生長； 在膠質瘤細胞中共轉TNFRl的過表達載體(或小干擾質粒)及MAP4K4的過表達載體或小干擾載體，予或不予TNF-α刺激，用Western Blot檢測ARP3及p_ARP3的表達;免疫熒光檢測肌動蛋白的聚合及其速度的改變；光鏡技術檢測細胞偽足生長的改變；細胞劃痕及TranswelI侵襲實驗，檢測不同細胞的迀移及侵襲的能力；
綜合分析上述結果，明確TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚體復合物對膠質瘤細胞肌動蛋白聚合、偽足生長及迀移、侵襲能力的調節作用及機制；
步驟4，利用膠質瘤臨床病理標本及構建裸鼠膠質瘤腦內模型，在整體水平全面探討分析TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚體對膠質瘤在體內侵襲性生長的影響；
本部分實驗步驟如圖10:
Cl)綜合分析膠質瘤及正常腦組織中TNFRUMAP4K4與ARP3表達的相關性及與臨床相關因素包括患者病理級別、復發及預后的相關性；
1)收集130例膠質瘤病例的病理組織石蠟標本，病例選擇標準為:①有影像學明確診斷(包括CT及核磁共振)；②有術后病理明確診斷;③術前無放療、化療及激素治療;④組織分型和病理分級參照《2007年WHO中樞神經系統腫瘤分類標準》;收集40組膠質瘤手術新鮮組織及瘤旁組織，結合臨床作出明確的組織分型和病理分級診斷；另取10例因急性腦外傷行內減壓術所得正常腦組織標本為對照；
2)通過WesternBlot和免疫組化等方法，研究不同病理分級的膠質瘤組織、膠質瘤瘤體中心組織及周邊組織中TNFRl、MAP4K4與ARP3的蛋白表達情況，將蛋白表達情況與膠質瘤的臨床因素進行相關性統計，分析TNFRl、MAP4K4與ARP3表達的相關性及其表達與膠質瘤患者病理級別、復發及預后的相關性；
(2)分別構建TNFRUMAP4K4與ARP3過表達、小干擾的穩定細胞株，以IX 108密度在腦立體定位儀下注射至裸鼠皮質內，構建裸鼠膠質瘤腦內模型；
(3)4周后收集腦組織，檢測腫瘤形成的大小、重量等情況，并比較其與裸鼠生存率的關系，HE染色檢測腫瘤侵襲情況；
(4)獲取裸鼠腫瘤組織WesternBlot及免疫組化檢測TNFRl、MAP4K4與ARP3的表達情況；
(5)組織消化，原代細胞培養，重復步驟3，分析并驗證TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚體對裸鼠原代膠質瘤細胞肌動蛋白聚合、細胞偽足形成及細胞迀移、侵襲能力的影響。
[0014]實驗結果:
TNF-α是腫瘤炎癥微環境中重要的炎癥因子，主要通過其受體腫瘤壞死因子受體I(tumor necrosis factor receptor I，TNFR1)傳導信號，在腫瘤的發生發展中發揮關鍵作用;TNFRl由胞外區、跨膜區和胞內區三個部分構成，其胞外區與配體TNF-α結合后，TNFRl通過招募死亡結構域相關蛋白TRADD(TNF receptor-associated death domain)與其胞內區的死亡結構域相結合，募集一系列相關蛋白，如:腫瘤壞死因子受體相關因子2(TNF_areceptor-associated factor 2，TRAF2)、FADD(Fas_associated death domain)及受體相互作用蛋白Ureceptor interacting protein I，RIP1)等形成復合體，來實現信號傳遞及細胞生物學功能調控；研究顯示，TNFRl的活化在膠質瘤的發生發展過程中有重要作用；TNFRl活化后，募集TRAF2及RIPl形成復合物，通過活化NF-kB途徑抑制膠質瘤細胞的凋亡，促進膠質瘤的發生發展;TNFRl活化后也可通過激活下游ERK途徑，從而促進膠質瘤細胞增殖;實驗發現，TNFRl的蛋白表達水平與膠質瘤病例的病理分級呈正相關，且免疫組化結果顯示其在復發的膠質瘤患者中有異常高表達，并對膠質瘤細胞的迀移及侵襲有促進作用(見圖1，2，4)，提示TNFRl的表達與膠質瘤的侵襲性生長有關;通過蛋白質譜分析發現TNFRl與調節細胞迀移和侵襲的肌動蛋白相關蛋白3(actin-related protein 3，ARP3)有相互作用，并在膠質瘤組織中通過免疫共沉淀實驗得到進一步驗證(見圖5)。
[0015]ARP3是一個重要的肌動蛋白相關蛋白，和其他6種肌動蛋白相關蛋白共同組成ARP2/3復合物;ARP2/3復合物作為Rho GTP酶-WASP下游的一個重要效應器可以直接調節肌動蛋白的聚合及偽足的形成，在細胞運動及腫瘤侵襲性生長過程中起到不可或缺的作用；在侵襲性生長的膠質瘤細胞中，ARP3的蛋白水平顯著增加，其表達水平與膠質瘤組織的惡性程度成正比，并且侵襲能力越強的膠質瘤細胞中，ARP3的表達越高，促進偽足生長的能力越強;實驗結果顯示，ARP3的蛋白水平與膠質瘤病例的病理分級呈正相關，且免疫組化結果顯示其在復發的膠質瘤患者中有異常高表達，進一步統計分析發現ARP3與TNFRl在膠質瘤中的表達呈正相關(見圖1，2，3);ARP3的異常高表達是TNFRl促進膠質瘤侵襲性生長的重要因素之一。
[0016]實驗發現，在TNF-α的刺激下，膠質瘤細胞的迀移、侵襲能力增強，ARP3的磷酸化表達增加，且ARP3的磷酸化水平與細胞侵襲相關指標的表達呈正相關(見圖6) ;ARP3的磷酸化是膠質瘤侵襲性生長的重要因素之一。
[0017]在膠質瘤中，MAP4K4與富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(proline_rich tyrosinekinase 2，Pyk2)結合，促進膠質瘤的侵襲;實驗結果顯示，在膠質瘤細胞中TNFRl及ARP3均與MAP4K4有相互作用(見圖5)，由此可以推測，活化的TNFRl可以招募MAP4K4，并與ARP3形成復合體，但在膠質瘤中TNFRl招募的MAP4K4是否可以磷酸化ARP3，從而激活ARP2/3復合物，增強腫瘤細胞的侵襲性。
[0018]綜上所述，炎癥微環境中，活化的TNFRl可以招募TRAF2形成復合體結構，而TRAF2可與MAP4K4結合，調節MAP4K4的活性;MAP4K4的活化可磷酸化ARP3，激活ARP2/3復合物；ARP2/3復合物的激活可促進肌動蛋白聚合，促進偽足形成，增強細胞的運動能力;在膠質瘤中，ARP2/3復合物的活性與膠質瘤細胞的偽足形成及侵襲性成正相關；結合預實驗發現TNFRl可以與ARP3相互作用，并且二者在膠質瘤組織中的表達具有相關性，同時與腫瘤病理等級、復發及膠質瘤細胞的侵襲能力呈正相關;在TNF-α的刺激下，ARP3的磷酸化表達增加，且與細胞侵襲相關指標的表達呈正相關;而且TNFRl及ARP3均與MAP4K4有相互作用，這提示在膠質瘤發生發展過程中，TNFRl與ARP3的相互作用具有重要的生物學意義。
【主權項】
1.研究TNFR1/MAP4K4/ARP3復合物在膠質瘤侵襲性生長機制的實驗方法，其特征為，包括以下步驟: 步驟I，分析TNFRl與MAP4K4的相互作用及其機制，明確膠質瘤炎癥微環境中，TNFRl招募并激活MAP4K4，從而促進膠質瘤侵襲性生長； 步驟2，分析MAP4K4與ARP3的相互作用及其機制，明確在膠質瘤進展中，MAP4K4通過磷酸化ARP3，激活ARP2/3復合物，促進肌動蛋白聚合及偽足形成，增強膠質瘤細胞的侵襲性； 步驟3，分析TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚體的相互作用及其機制，明確膠質瘤炎癥微環境中，TNFRl通過招募并激活MAP4K4，從而磷酸化ARP3，激活ARP2/3復合物，促進肌動蛋白聚合及偽足形成，增強膠質瘤細胞的侵襲性； 步驟4，利用膠質瘤臨床病理標本及構建裸鼠膠質瘤腦內模型，在整體水平全面探討分析TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚體對膠質瘤在體內侵襲性生長的影響。2.如權利要求1所述研究TNFR1/MAP4K4/ARP3復合物在膠質瘤侵襲性生長機制的實驗方法，其特征為，所述步驟I包括: (1)驗證膠質瘤及正常腦組織中TNFRl與MAP4K4的表達，分析兩者表達的相關性，及與臨床病理因素包括患者病理級別、復發及預后的相關性； (2)分別在膠質瘤組織、工具細胞及膠質瘤細胞中驗證并分析TNFRl與MAP4K4的相互作用，并根據各自結構域特點分別構建截短突變質粒，明確其相互作用結構域； (3)在TNF-α刺激下，干預TNFRl表達或TNFRl與MAP4K4相互作用，分別在膠質瘤細胞株及工具細胞中明確TNFRl與MAP4K4相互作用對MAP4K4磷酸化修飾的調節作用； (4)在TNF-a刺激下，干預TNFRl表達或TNFRl與MAP4K4相互作用，分析TNFRl與MAP4K4相互作用對膠質瘤細胞迀移及侵襲能力的影響； (5)分別構建TNFRl過表達、小干擾及不與MAP4K4相互作用的突變細胞株，利用裸鼠構建膠質瘤腦內模型，明確TNFRl與MAP4K4的相互作用對動物模型中膠質瘤發生發展的影響； 所述步驟2包括: Cl)驗證膠質瘤及正常腦組織中MAP4K4與ARP3的表達，分析兩者表達的相關性，及與臨床病理因素包括患者病理級別、復發及預后的相關性； (2)分別在膠質瘤組織、工具細胞及膠質瘤細胞中驗證并分析MAP4K4與ARP3相互作用，并根據各自結構域特點分別構建截短突變質粒，明確其相互作用結構域； (3 )干預MAP4K4表達或MAP4K4與ARP3相互作用，分別在膠質瘤細胞株及工具細胞中明確MAP4K4與ARP3相互作用對ARP3磷酸化修飾的調節作用； (4)干預MAP4K4表達或MAP4K4與ARP3相互作用，分析MAP4K4與ARP3相互作用對膠質瘤細胞肌動蛋白聚合、偽足生長及迀移、侵襲能力的調節作用； (5)分別構建MAP4K4過表達、小干擾及不與ARP3相互作用的突變細胞株，利用裸鼠構建膠質瘤腦內模型，明確MAP4K4與ARP3的相互作用對動物模型中膠質瘤發生發展的影響； 所述步驟3包括: (1)工具細胞及膠質瘤細胞中驗證TNFR1、MAP4K4及ARP3三者兩兩相互作用，并明確TNFRl與ARP3相互作用的結構域； (2)分別在膠質瘤細胞及工具細胞中干預TNFR1/MAP4K4、MAP4K4/ARP3復合物形成，明確TNFRl影響MAP4K4對APR3的磷酸化作用； (3)分別在膠質瘤細胞及工具細胞中干預TNFR1/MAP4K4、TNFR1/ARP3及MAP4K4/ARP3復合物形成，明確TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚體對膠質瘤細胞肌動蛋白聚合、細胞偽足形成及細胞迀移、侵襲能力的影響； 所述步驟4包括: (1)綜合分析膠質瘤及正常腦組織中TNFRl、MAP4K4與ARP3表達的相關性及與臨床相關因素包括患者病理級別、復發及預后的相關性； (2)分別構建TNFRl、MAP4K4與ARP3過表達、小干擾的穩定細胞株，以IX 108密度在腦立體定位儀下注射至裸鼠皮質內，構建裸鼠膠質瘤腦內模型； (3)4周后收集腦組織，檢測腫瘤形成的大小、重量等情況，并比較其與裸鼠生存率的關系，HE染色檢測腫瘤侵襲情況； (4)獲取裸鼠腫瘤組織WesternBlot及免疫組化檢測TNFRl、MAP4K4與ARP3的表達情況； (5)組織消化，原代細胞培養，重復步驟3，分析并驗證TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚體對裸鼠原代膠質瘤細胞肌動蛋白聚合、細胞偽足形成及細胞迀移、侵襲能力的影響。3.如權利要求2所述研究TNFR1/MAP4K4/ARP3復合物在膠質瘤侵襲性生長機制的實驗方法，其特征為，所述步驟I還包括: .1)收集130例膠質瘤病例的病理組織石蠟標本，病例選擇標準為:①有影像學明確診斷(包括CT及核磁共振)；②有術后病理明確診斷;③術前無放療、化療及激素治療;④組織分型和病理分級參照《2007年WHO中樞神經系統腫瘤分類標準》;收集40組膠質瘤術后新鮮癌組織及癌旁組織，結合臨床作出明確的組織分型和病理分級診斷；另取10例因急性腦外傷行內減壓術所得正常腦組織標本為對照； . 2)通過WesternBlot和免疫組化等方法，研究不同病理分級的膠質瘤組織、膠質瘤瘤體中心組織及周邊組織中TNFRl與MAP4K4的蛋白表達情況，將蛋白表達情況與膠質瘤的臨床因素進行相關性統計，分析TNFRl與MAP4K4表達的相關性及其表達與膠質瘤患者病理級另U、復發及預后的相關性； . 3)在體外，GST-pulldown驗證TNFRl與MAP4K4存在相互作用； ①構建His標記的TNFRl及GST標記的MAP4K4的原核表達載體，誘導體外表達，分離純化His-TNFRl及GST-MAP4K4; ②將耦合有GST-MAP4K4的Glutath1ne Sepharose 4B與純化的His-TNFRl 共孵育，洗滌后予SDS裂解液裂解蛋白，Western Blot檢測His-TNFRl的表達，明確TNFRl在體外可以與MAP4K4相結合形成復合物； . 4)HEK293T細胞中驗證TNFRl與MAP4K4存在相互作用； ①構建Myc標記的MAP4K4及HA標記的TNFRl的真核表達載體，共轉入HEK293T細胞，收集細胞蛋白，分別用HA及Myc抗體進行免疫共沉淀,Western Blot檢測Myc_MAP4K4及HA-TNFRl的表達，明確TNFRl與MAP4K4的外源性相互作用； ②根據TNFRl與MAP4K4的分子結構的特征，構建TNFRl及MAP4K4的截短載體，將上述截短載體共轉HEK293T細胞，免疫共沉淀聯合Western Blot分析TNFRl與MAP4K4截短載體的相互作用，明確TNFRl與MAP4K4相互作用的結構域； .5)膠質瘤細胞中驗證TNFRl與MAP4K4存在相互作用； ①收集H4、U87-MG及U251膠質瘤細胞，通過WesternBlot在蛋白水平檢測TNFRl與MAP4K4的表達；收集H4、U87-MG及U251膠質瘤細胞，通過RT-PCR在mRNA水平檢測TNFRl與MAP4K4的表達;選擇低表達的細胞株用于過表達實驗，選擇高表達的細胞株用于小干擾實驗； ②選取TNFRl與MAP4K4表達差異顯著的膠質瘤細胞株，收集細胞蛋白，分別用TNFRl及MAP4K4的抗體進行免疫共沉淀，并以同型IgG作為對照，Western Blot檢測MAP4K4及TNFRl的表達，明確在膠質瘤細胞株中TNFRl與MAP4K4的內源性相互作用； ③固定膠質瘤細胞株，分別用TNFRl與MAP4K4的特異性抗體進行免疫標記，激光共聚焦顯微鏡下觀察膠質瘤細胞中TNFRl與MAP4K4的定位情況，分析膠質瘤細胞株中TNFRl與MAP4K4的相互作用； . 6)膠質瘤細胞中檢測TNFRl與MAP4K4的相互作用對MAP4K4磷酸化修飾的調節及其機制;選取高表達TNFRl的膠質瘤細胞系，予以干擾TNFRl表達;低表達TNFRl的膠質瘤細胞系，予以過表達TNFRl，同時予以TNF-a 50 ng/mL刺激48 h，對照組不予TNF-a刺激，收集細胞蛋白，用TNFRl抗體進行免疫共沉淀，Western Blot檢測TNFRl與MAP4K4相互作用的改變，及MAP4K4及P- MAP4K4的表達； .7)HEK293T細胞中檢測TNFRl與MAP4K4的相互作用對MAP4K4磷酸化修飾的調節及其機制; ①將Myc標記的MAP4K4及濃度不同的HA標記的TNFRl表達載體共轉染HEK293T細胞，同時予以TNF-a 50 ng/mL刺激48 h，對照組不予TNF-a刺激，收集細胞蛋白，用HA抗體進行免疫共沉淀，Western Blot檢測TNFRl與MAP4K4相互作用的改變，及MAP4K4及p- MAP4K4的表達； ②將Myc標記的MAP4K4分別與HA標記的TNFRl及其截短突變表達載體共轉染HEK293T細胞，予以TNF-a 50 ng/mL刺激48 h，對照組不予TNF-a刺激，收集細胞蛋白，用HA抗體進行免疫共沉淀，Western Blot檢測MAP4K4及p- MAP4K4的表達； . 8)在TNF-a刺激下，檢測TNFRl及MAP4K4各自對膠質瘤細胞迀移和侵襲性的調節作用；利用先前構建的TNFR及MAP4K4的過表達或小干擾質粒，轉染膠質瘤細胞株，將細胞接種至Lamin包被的培養板上，予或不予TNF-a刺激，利用細胞劃痕實驗構建膠質瘤細胞迀移模型；接種至包被有Matrigel的8um孔徑的Transwel I小室上構建侵襲模型，檢測不同細胞的迀移及侵襲的能力； .9)在TNF-α刺激下，檢測干預TNFRl與MAP4K4的相互作用對MAP4K4及TNFRl各自調節膠質瘤細胞迀移和侵襲能力的影響；在膠質瘤細胞中共轉TNFRl的過表達載體(或小干擾質粒)及MAP4K4的過表達載體或小干擾質粒，通過細胞劃痕及Transwell侵襲實驗，檢測不同細胞的迀移及侵襲的能力； . 10)分別構建TNFRl過表達、小干擾及不與MAP4K4相互作用的穩定細胞株，以IX 108密度在腦立體定位儀下注射至裸鼠皮質內，構建裸鼠膠質瘤腦內模型;4周后收集腦組織，檢測腫瘤形成的大小、重量等情況，并比較其與裸鼠生存率的關系，HE染色檢測腫瘤侵襲情況;獲取裸鼠腫瘤組織Western Blot及免疫組化檢測TNFRl及MAP4K4的表達情況;組織消化，原代細胞培養，重復實驗步驟I中(3)及(4)，驗證并分析TNFRl與MAP4K4的相互作用對裸鼠原代膠質瘤細胞迀移、侵襲能力的影響； 所述步驟2還包括:1)收集130例膠質瘤病例的病理組織石蠟標本，病例選擇標準為:①有影像學明確診斷(包括CT及核磁共振);②有術后病理明確診斷;③術前無放療、化療及激素治療;④組織分型和病理分級參照《2007年WHO中樞神經系統腫瘤分類標準》;收集40組膠質瘤術后新鮮癌組織及癌旁組織，結合臨床作出明確的組織分型和病理分級診斷；另取.10例因急性腦外傷行內減壓術所得正常腦組織標本為對照； . 2)通過WesternBlot和免疫組化等方法，研究不同病理分級的膠質瘤組織、膠質瘤瘤體中心組織及周邊組織中MAP4K4與ARP3的蛋白表達情況，將蛋白表達情況與膠質瘤的臨床因素進行相關性統計，分析MAP4K4與ARP3表達的相關性及其表達與膠質瘤患者病理級別、復發及預后的相關性； . 3)在體外，GST-pulldown驗證MAP4K4與ARP3存在相互作用； ①構建His標記的ARP3及GST標記的MAP4K4的原核表達載體，誘導體外表達，分離純化His- ARP3及GST-MAP4K4; ②將耦合有GST-MAP4K4的Glutath1ne Sepharose 4B與純化的His- ARP3 共孵育，洗滌后予SDS裂解液裂解蛋白，Western Blot檢測His- ARP3的表達，明確ARP3在體外可以與MAP4K4相結合形成復合物； .4)HEK293T細胞中驗證MAP4K4與ARP3存在相互作用； ①構建Myc標記的MAP4K4及Flag標記的ARP3的真核表達載體，共轉入HEK293T細胞，收集細胞蛋白，用Flag及Myc抗體進行免疫共沉淀，Western Blot檢測Myc_MAP4K4及Flag-ARP3的表達，明確MAP4K4與ARP3的外源性相互作用； ②根據MAP4K4與ARP3的分子結構的特征，構建MAP4K4及ARP3的截短載體，將上述截短載體共轉HEK293T細胞，免疫共沉淀聯合Western Blot分析MAP4K4與ARP3截短載體的相互作用，明確MAP4K4與ARP3相互作用的結構域； . 5)膠質瘤細胞中驗證MAP4K4與ARP3存在相互作用； ①收集H4、U87-MG及U251膠質瘤細胞，通過WesternBlot在蛋白水平檢測MAP4K4與ARP3的表達;收集H4、U87-MG及U251膠質瘤細胞，通過RT-PCR在mRNA水平檢測MAP4K4與ARP3的表達;選擇低表達的細胞株用于過表達實驗，選擇高表達的細胞株用于小干擾實驗； ②選取MAP4K4與ARP3表達差異顯著的膠質瘤細胞株，收集細胞蛋白，分別用MAP4K4與ARP3的抗體進行免疫共沉淀，并以同型IgG作為對照，Western Blot檢測MAP4K4與ARP3的表達，明確在膠質瘤細胞株中MAP4K4與ARP3的內源性相互作用； ③固定膠質瘤細胞株，分別用MAP4K4與ARP3的特異性抗體進行免疫標記，激光共聚焦顯微鏡下觀察膠質瘤細胞中MAP4K4與ARP3的定位情況，分析膠質瘤細胞株中MAP4K4與ARP3的相互作用； .6)膠質瘤細胞中檢測MAP4K4與ARP3的相互作用對ARP3磷酸化修飾的調節及其機制； 選取高表達MAP4K4的膠質瘤細胞系，予以干擾TNFRl表達;低表達MAP4K4的膠質瘤細胞系，予以過表達MAP4K4，收集細胞蛋白，用MAP4K4抗體進行免疫共沉淀，Western Blot檢測MAP4K4與ARP3相互作用的改變，及ARP3和P- ARP3的表達； .7)HEK293T細胞中檢測MAP4K4與ARP3的相互作用對ARP3磷酸化修飾的調節及其機制； ①將Flag標記的ARP3及濃度不同的Myc標記的MAP4K4表達載體共轉染HEK293T細胞，收集細胞蛋白，用Myc抗體進行免疫共沉淀，Western Blot檢測MAP4K4與ARP3相互作用的改變，及ARP3和p- ARP3的表達； ②將Flag標記的ARP3分別與Myc標記的MAP4K4及其截短突變表達載體共轉染HEK293T細胞，收集細胞蛋白，用Myc抗體進行免疫共沉淀，Western Blot檢測ARP3及p- ARP3的表達； .8)檢測MAP4K4及ARP3各自對膠質瘤細胞肌動蛋白聚合、偽足生長及迀移、侵襲能力的調節作用； 利用先前構建的MAP4K4及ARP3的過表達或小干擾質粒，轉染膠質瘤細胞株，用免疫熒光檢測肌動蛋白的聚合及其速度的改變;免疫熒光及光鏡技術檢測細胞偽足生長的改變；細胞劃痕TranswelI侵襲實驗，檢測不同細胞的迀移及侵襲的能力； . 9)檢測干預MAP4K4及ARP3的表達對ARP3及MAP4K4各自調節膠質瘤細胞肌動蛋白聚合、偽足生長及迀移、侵襲能力的影響； 在膠質瘤細胞中共轉MAP4K4的過表達載體(或小干擾質粒)及ARP3的過表達載體及小干擾質粒，用免疫熒光檢測肌動蛋白的聚合及其速度的改變;免疫熒光及光鏡技術檢測細胞偽足生長的改變;細胞劃痕Transwel I侵襲實驗，檢測不同細胞的迀移及侵襲的能力； .10)分別構建MAP4K4過表達、小干擾及不與ARP3相互作用的穩定細胞株，以IX 108密度在腦立體定位儀下注射至裸鼠皮質內，構建裸鼠膠質瘤腦內模型;4周后收集腦組織，檢測腫瘤形成的大小、重量等情況，并比較其與裸鼠生存率的關系，HE染色檢測腫瘤侵襲情況；獲取裸鼠腫瘤組織Western Blot及免疫組化檢測MAP4K4及ARP3的表達情況;組織消化，原代細胞培養，重復實驗步驟2中(3)及(4)，驗證并分析MAP4K4與ARP3的相互作用對裸鼠原代膠質瘤細胞迀移、侵襲能力的影響； 所述步驟3還包括:1)在體外，GST-pull down驗證TNFRl與ARP3存在相互作用； ①構建His標記的ARP3及GST標記的TNFRl的原核表達載體，誘導體外表達，分離純化His- ARP3及GST-TNFR1; ②將耦合有GST-TNFRl的Glutath1ne Sepharose 4B與純化的His- ARP3共孵育，洗滌后予SDS裂解液裂解蛋白，Western Blot檢測His- ARP3的表達，明確ARP3在體外可以與TNFRl相結合形成復合物；. 2 )HEK293T細胞中驗證TNFRl與ARP3存在相互作用； ①構建HA標記的TNFRl及Flag標記的ARP3的真核表達載體，共轉入HEK293T細胞，收集細胞蛋白，用Flag及HA抗體進行免疫共沉淀，Western Blot檢測HA-TNFR1及Flag_ARP3的表達，明確TNFRl與ARP3的外源性相互作用； ②根據TNFRl與ARP3的分子結構的特征，構建TNFRl及ARP3的截短載體，將上述截短載體共轉HEK293T細胞，免疫共沉淀聯合Western Blot分析TNFRl與ARP3截短載體的相互作用，明確TNFRl與ARP3相互作用的結構域； . 3)膠質瘤細胞中驗證TNFRl與ARP3存在相互作用； ①選取TNFRl與ARP3表達差異顯著的膠質瘤細胞株，收集細胞蛋白，分別用TNFRl與ARP3的抗體進行免疫共沉淀，并以同型IgG作為對照，Western Blot檢測TNFRl與ARP3的表達，明確在膠質瘤細胞株中TNFRl與ARP3的內源性相互作用； ③固定膠質瘤細胞株，分別用TNFRl與ARP3的特異性抗體進行免疫標記，激光共聚焦顯微鏡下觀察膠質瘤細胞中TNFRl與ARP3的定位情況，分析膠質瘤細胞株中TNFRl與ARP3的相互作用； .4)膠質瘤細胞中檢測TNFR1、ARP3及MAP4K4的相互作用對MAP4K4及ARP3磷酸化修飾的調節及其機制； ①選取高表達TNFRl的膠質瘤細胞系，干擾TNFRl表達;低表達TNFRl的膠質瘤細胞系，過表達TNFRl，予或不予TNF-α刺激，收集細胞蛋白，用TNFRl抗體進行免疫共沉淀，WesternBlot檢測ARP3及p-ARP3的表達； ②選取高表達TNFRl的膠質瘤細胞系，干擾TNFRl表達;低表達TNFRl的膠質瘤細胞系，過表達TNFRl，予或不予TNF-a刺激，收集細胞蛋白，檢測MAP4K4及p- MAP4K4表達的變化； ③若上一個步驟②中MAP4K4的表達有變化，在②的基礎上，干預MAP4K4的表達，用TNFRl抗體進行免疫共沉淀，Western Blot檢測ARP3及p_ARP3的表達是否改變； . 5)HEK293T細胞中檢測TNFRl、ARP3及MAP4K4的相互作用對MAP4K4及ARP3磷酸化修飾的調節及其機制； ①將Flag標記的ARP3及濃度不同的HA標記的TNFRl表達載體共轉染HEK293T細胞，予或不予TNF-α刺激，收集細胞蛋白，用HA抗體進行免疫共沉淀，Western Blot檢測ARP3及p-ARP3的表達； ②將Flag標記的ARP3分別與HA標記的TNFRl及其截短突變表達載體共轉染HEK293T細胞，予或不予TNF-α刺激，收集細胞蛋白，用HA抗體進行免疫共沉淀，Western Blot檢測ARP3及P-ARP3的表達； ③將Flag標記的ARP3及濃度不同的HA標記的TNFRl表達載體共轉染HEK293T細胞，予或不予TNF-α刺激，收集細胞蛋白，檢測MAP4K4及P- MAP4K4表達的變化； ④若上一個步驟③中MAP4K4的表達有變化，在③的基礎上，干預MAP4K4的表達，用HA抗體進行免疫共沉淀，Western Blot檢測ARP3及p_ARP3的表達是否改變； . 6)在步驟I及步驟2中，已檢測TNFRl、MAP4K4及ARP3各自對膠質瘤細胞肌動蛋白聚合、偽足生長及迀移、侵襲能力的調節作用； . 7)在TNF-a刺激下，檢測干預TNFR1/ARP3復合物的形成對TNFRl促進ARP3磷酸化，調節膠質瘤細胞肌動蛋白聚合、偽足生長及迀移、侵襲能力的影響，明確TNFRl通過促進ARP3磷酸化，來促進膠質瘤侵襲性生長； 在膠質瘤細胞中共轉TNFRl的過表達載體(或小干擾質粒)及ARP3的過表達載體及小干擾質粒，予或不予TNF-a刺激，用Western Blot檢測ARP3及p_ARP3的表達;免疫熒光檢測肌動蛋白的聚合及其速度的改變;光鏡技術檢測細胞偽足生長的改變;細胞劃痕及Transwel I侵襲實驗，檢測不同細胞的迀移及侵襲的能力； . 8)在TNF-α刺激下，檢測干預MAP4K4/ARP3復合物的形成對MAP4K4調節ARP3磷酸化及膠質瘤細胞肌動蛋白聚合、偽足生長及迀移、侵襲能力的影響，明確MAP4K4通過磷酸化ARP3，從而促進膠質瘤侵襲性生長； 在膠質瘤細胞中共轉ARP3的過表達載體(或小干擾質粒)及MAP4K4的過表達載體及小干擾質粒，予或不予TNF-a刺激，用Western Blot檢測ARP3及p_ARP3的表達;免疫熒光檢測肌動蛋白的聚合及其速度的改變；光鏡技術檢測細胞偽足生長的改變；細胞劃痕及TranswelI侵襲實驗，檢測不同細胞的迀移及侵襲的能力； .9)在TNF-α刺激下，檢測干預TNFR1/MAP4K4復合物的形成對MAP4K4磷酸化ARP3，從而調節膠質瘤細胞肌動蛋白聚合、偽足生長及迀移、侵襲能力的影響，明確TNFRl通過招募MAP4K4，從而磷酸化ARP3，促進膠質瘤侵襲性生長； 在膠質瘤細胞中共轉TNFRl的過表達載體(或小干擾質粒)及MAP4K4的過表達載體或小干擾載體，予或不予TNF-α刺激，用Western Blot檢測ARP3及p_ARP3的表達;免疫熒光檢測肌動蛋白的聚合及其速度的改變；光鏡技術檢測細胞偽足生長的改變；細胞劃痕及TranswelI侵襲實驗，檢測不同細胞的迀移及侵襲的能力； 所述步驟4還包括:1)收集130例膠質瘤病例的病理組織石蠟標本，病例選擇標準為:①有影像學明確診斷(包括CT及核磁共振);②有術后病理明確診斷;③術前無放療、化療及激素治療;④組織分型和病理分級參照《2007年WHO中樞神經系統腫瘤分類標準》;收集40組膠質瘤手術新鮮組織及瘤旁組織，結合臨床作出明確的組織分型和病理分級診斷；另取10例因急性腦外傷行內減壓術所得正常腦組織標本為對照； .2)通過Western Blot和免疫組化等方法，研究不同病理分級的膠質瘤組織、膠質瘤瘤體中心組織及周邊組織中TNFRl、MAP4K4與ARP3的蛋白表達情況，將蛋白表達情況與膠質瘤的臨床因素進行相關性統計，分析TNFRl、MAP4K4與ARP3表達的相關性及其表達與膠質瘤患者病理級別、復發及預后的相關性。
【文檔編號】C12Q1/68GK105950658SQ201610398216
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月7日
【發明人】藺玉昌, 張敬寧, 張燕
【申請人】無錫市第二人民醫院