一種抑制人AEBP1基因表達的shRNA分子的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種抑制人AEBP1基因表達的shRNA分子，依據Genbank中人AEBP1基因(基因序列號：NM_001129.4)；設計4條shRNA分子，針對shRNA序列進行合成，將合成的兩條互補單鏈shRNA分子經退火形成雙鏈后，連接到慢病毒載體上，構建4個慢病毒干擾RNA質粒。將shRNA質粒轉染含AEBP1的Huh7細胞系，通過實時定量PCR對AEBP1基因進行相對定量分析，評價對AEBP1基因表達的抑制效果。通過相對定量分析得出：AEBP1?shRNA1能夠有效抑制82.3%的AEBP1的轉錄，AEBP1?shRNA2能夠抑制75.7%的AEBP1的轉錄。
【專利說明】
一種抑制人AEBP1基因表達的shRNA分子
技術領域
[0001]本發明涉及能夠對脂肪細胞增強結合蛋白l(Adipocyte Enhancer-bindingProtein I，AEBP1)基因產生顯著抑制作用的shRNA分子的設計、合成和抑制作用在肝細胞上的評價方法。
【背景技術】
[0002]脂肪細胞增強結合蛋白l(Adipocyte enhancer-binding protein I，AEBPl)是一種轉錄抑制因子，分子量82kDa，在脂肪組織中高表達，參與前脂細胞中的脂肪形成。另外AEBPl肝臟、肺、脾、腦及原代巨噬細胞中表達水平也較高。
[0003]已有研究證明AEBPl參與小鼠巨噬細胞的膽固醇平衡、泡沫細胞形成及巨噬細胞、肝細胞炎癥反應。AEBPI高表達促進小鼠體內炎性因子的釋放。其具體機制是AEBPI通過激活NF-κΒ通路，促進炎性因子IL-6、TNF-α、MCP-1和iNOS等的釋放。這一過程主要依賴于AEBPl與ΙκΒα的蛋白-蛋白相互作用，AEBPl與ΙκΒα結合后，促進ΙκΒα的Ser32/Ser36磷酸化，導致IicBa的磷酸化降解，從而使NF-κΒ磷酸化并轉入細胞核，啟動靶基因(如炎性因子)的轉錄。
[0004]另外實驗還發現AEBPl介導LPS誘導的巨噬細胞向泡沫細胞的分化，AEBPl過表達的小鼠更易產生肥胖。進一步研究發現，AEBPl的過表達能夠抑制巨噬細胞PPARy I(peroxisome proliferator-activated receptor γ?)和 LXRa(liver X receptor a)，以及二者的革巴基因ABCAl (ATP-binding cassette Al)、ABCG1 (ATP-binding cassetteGl),ApoE (apolipoprotein E)和CD36的表達，這些蛋白是膽固醇向高密度脂蛋白轉移的重要參與者。在小鼠體內敲除AEBPl的表達，有助于降低體重。LPS刺激巨噬細胞，誘導細胞內AEBPl表達上調。抑制AEBPl的表達能夠抵抗LPS導致的感染性休克和革蘭氏陰性菌感染引起的動脈粥樣硬化。
[0005]因此可以看出AEBPl參與炎癥和脂代謝相關的疾病病理反應，干擾AEBPl的表達有助于疾病的預防和治療。然而目前尚沒有抑制人AEBPl表達的shRNA分子。
【發明內容】
[0006]本發明提供一種抑制人AEBPl基因表達的shRNA分子，對人AEBPl基因表達有顯著抑制作用，為AEBPl過表達相關疾病的治療提供了應用基礎。
[0007]本發明是采用如下技術方案實現的:
一種抑制人AEBPl基因表達的shRNA分子，所述AEBPl基因在GenBank中序列號為NM_001129.4。所述shRNA分子包括shRNAl和shRNA2兩種;其中，shRNAl分子的正義鏈模板序列為:
5’-GATCCGCTATGAGGAAATGACCTTTCTTCAAGAGAGAAAGGTCATTTCCTCATAGCTTTTTTG-3’，反義鏈模板序列為:
5’-AATTCAAAAAAGCTATGAGGAAATGACCTTTCTCTCTTGAAGAAAGGTCATTTCCTCATAGCG-3’；shRNA2分子的正義鏈模板序列為:5 ’-GATCCGGTGGTGATTACTGGCGAATCTTCAAGAGAGATTCGCCAGTAATCACCACCTTTTTTG-3 ’， 反義鏈模板序列為:AATTCAAAAAAGGTGGTGATTACTGGCGAATCTCTCTTGAAGATTCGCCAGTAATCACCACCG。
[0008] 本發明針對人的AEBP1基因序列合成一組shRNA分子，篩選出兩個shRNAl和 shRNA2，經qRT-PCR法檢測，可以有效降低AEBP1基因的表達，從而顯著降低AEBP1蛋白水平的表達，并在人肝癌細胞株Huh7上進行了驗證。通過定量分析得出，AEBPl-shRNAl能夠有效抑制82.3%的AEBP1的轉錄，AEBPl-shRNA2能夠抑制75.7%的AEBP1的轉錄。
[0009]本發明具有如下應用意義:一些感染性疾病如革蘭氏陰性菌感染、病毒感染(乙肝病毒、丙肝病毒)等通過引起細胞內AEBP1表達升高，引起持續的炎癥反應和脂代謝紊亂，促進病毒性肝炎、感染性休克及動脈粥樣硬化等疾病的發展進程。抑制AEBP1的表達能夠減弱上述疾病的發展進程。本發明篩選出的shRNA分子能夠顯著降低AEBP1的表達。【附圖說明】
[0010]附圖1是本發明實施例中采用實時定量PCR法檢測本發明的shRNA轉染對AEBP1表達的抑制效果的結果圖。【具體實施方式】
[0011]下面將結合具體實施例對本發明的技術方案進行清楚、完整地描述。[0〇12]本發明中抑制人AEBP1基因的shRNA分子合成方法如下:依據Genbank中人AEBP 1基因，基因序列號:匪_001129.4;設計4條shRNA分子，針對 shRNA序列進行合成得到兩條互補單鏈shRNA分子，即shRNAl和shRNA2,此兩個shRNA分子經退火形成雙鏈后，連接到慢病毒載體上，構建4個慢病毒干擾RNA質粒。[0〇13]為了測試合成的shRNA分子對人AEBP1基因表達的抑制效果，采用如下方法將 shRNA質粒轉染含AEBP1的Huh7細胞系:將表達AEBP1的Huh7細胞接種24孔板，1.5 X 105個/ 孔的密度，用500ul含有10%胎牛血清的DMEM培養液培養細胞，24h后細胞達到約75%的匯合度，取100ul opt1-MEM，將2ul脂質體1 ipofectamin2000與0 ? 8ug質粒預混，室溫靜置20min 后，加到培養的Huh7細胞上清中。6h后更換為含有10%胎牛血清的DMEM完全培養液，再培養 48h后，用Trizol法抽提總RNA。
[0014] 上述轉染細胞的總RNA，通過實時定量PCR對AEBP1基因進行相對定量分析，評價對 AEBP1基因表達的抑制效果；定量分析方法如下:一步法Real time PCR檢測試劑盒購自 TAKARA公司，進行Real Time PCR反應體系為:2X0ne Step RT-PCR Buffer III 12.5ul， Takara Ex Taq HS 0.5ul，PrimerScript RT enzyme Mix II 0.5ul，上下游引物(lOuM)各 0.5ul，TaqMan probe lul，total RNA 2ul，RNase free dH20 7.5111。卩0?反應條件為:hold 42°C 5min，hold 95°C 10s，cycle 95°C 5s、60°C 20s，40個循環。通過相對定量分析得出:六￡8?1-8111?財1能夠有效抑制82.3%的4￡8?1的轉錄4￡8?1-8111?財2能夠抑制75.7%的 AEBP1的轉錄，如附圖1所示。
[0015]上述實施例中選用的〇pt1-MEM培養液、DMEM培養液、購自美國Gibco公司，脂質體 lipofectamin2000購自美國Invitrogen公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；RNA抽提試劑Trizol、定量PCR試劑盒購自TAKARA公司；shRNA由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。
[0016]
以上實施例僅僅是本發明的優選實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其它實施例，都屬于本發明保護的范圍。同時，以上實施例的說明只是用于幫助理解本發明的方法及其核心思想，對于本領域的一般技術人員，依據本發明的思想，在【具體實施方式】及應用范圍上均會有改變之處，綜上所述，本說明書內容不應理解為對本發明的限制。
【主權項】
1.一種抑制人AEBP1基因表達的shRNA分子，所述AEBP1基因在GenBank中序列號為NM_ 001129.4，其特征在于，所述shRNA分子包括shRNAl和shRNA2兩種;其中， shRNAl分子的正義鏈模板序列為.5 ’-GATCCGCTATGAGGAAATGACCTTTCTTCAAGAGAGAAAGGTCATTTCCTCATAGCTTTTTTG-3 ’，反義鏈模板序列為.5 ’-AATTCAAAAAAGCTATGAGGAAATGACCTTTCTCTCTTGAAGAAAGGTCATTTCCTCATAGCG-3 ’； shRNA2分子的正義鏈模板序列為.5 ’-GATCCGGTGGTGATTACTGGCGAATCTTCAAGAGAGATTCGCCAGTAATCACCACCTTTTTTG-3 ’，反義鏈模板序列為AATTCAAAAAAGGTGGTGATTACTGGCGAATCTCTCTTGAAGATTCGCCAGTAATCACCACCG。
【文檔編號】C12N15/113GK105950619SQ201610246220
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年4月20日
【發明人】劉媛
【申請人】劉媛