桃潛隱花葉類病毒分子標準樣品及其制備方法
【專利摘要】本發明提供一種桃潛隱花葉類病毒分子標準樣品及其制備方法，具體包括PLMVd的原料選取、標準樣品的制備、均勻性和穩定性檢查、定性檢定、定值等過程。所述標準樣品的制備方法包括：由PLMVd病毒液中提取病毒RNA、RT?PCR反應擴增并純化目的基因片段、目的片段的連接轉化；回收質粒的步驟。本發明的桃潛隱花葉類病毒標準樣品穩定性高、均勻性好，適用于對桃潛隱花葉類病毒進行快速檢測確證，為桃潛隱花葉類病毒的檢測研究、農藥研究、應用研究提供了標準樣品的需求，可廣泛應用于農業生產及環境中的疫情監控及進出口貿易中該類病毒的監測及檢測。使用本發明的標準樣品可以實現不同實驗室結果的比對，從而保證實驗室的質量控制。
【專利說明】
桃潛隱花葉類病毒分子標準樣品及其制備方法
技術領域
[0001] 本發明屬于檢測用病毒標準品及其制備方法技術領域，具體涉及桃潛隱花葉類病 毒標準樣品及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 桃潛隱花葉類病毒（Peach latent mosaic viroid，PLMVd)屬于Avsunviroidae 科，通常含338個左右核苷酸，無中央保守區。其在世界各地的桃栽培區均有發生，主要侵染 桃、梨、李、杏等核果類果樹:PLMVd在許多的桃樹(Primus persica)品種上為潛伏侵染，潛 隱期可達5~7年，通常沒有明顯得葉部癥狀，但帶毒桃樹生長緩慢，樹勢衰退，抗性降低。感 病品種染病后，在葉片上形成白色或黃色奶油狀的花葉（Peach calico)或印花狀病斑，褪 綠斑駁(Peach blotch)，或者是在小葉上形成邊緣壞死的花葉癥狀(Peach mosaic)。病害 發生于桃樹生長第二年，癥狀包括延遲4-6天長葉、開花、成熟;高溫時，花瓣出現紫色裂紋； 果實不規則、扁狀、色澤暗淡，裂果;芽壞死;桃樹易早衰;有些強毒株系使葉片產生花葉、塊 斑、雜色和壞死;還有的能導致莖痘斑和卷葉。可經嫁接和桃蚜傳染，隨無性繁殖材料遠距 離傳播。據報道，在我國有的果園桃樹PLMVd發生較普遍，其造成的經濟損失相當嚴重。目前 尚未有桃潛隱花葉類病毒的恒溫擴增方面的檢測技術的發明報道。因此，建立簡單實用的 桃潛隱花葉類病毒新型檢測鑒定方法，對于提高桃潛隱花葉類病毒的檢疫檢驗效率、防止 桃潛隱花葉類病毒的傳入、傳出，保護我國農業的安全生產，促進我國農產品的順利出口， 具有十分重要的意義。植物類病毒由于不顯性侵染比較普遍，癥狀表現受環境溫度的影響 較大，而且幾種鑒別植物對不同類病毒的反應癥狀相似，故難于應用生物測定的方法。由于 類病毒不能產生任何蛋白質，所以也不能使用檢測病毒的電鏡、血清學方法。因此，選用分 子生物學方法對桃潛隱花葉類病毒進行檢測。
[0003] 系統內送檢種苗的樣品通常眼觀來看都比較健康，而桃潛隱花葉類病毒通常只有 在適宜的條件下才能發病，而且現在用的PCR方法只能從重度感染表現出癥狀的植物中檢 出病毒，無法檢測潛在的病毒。隨著進出口貿易的增大，檢驗流程時限要求縮減，植物病毒 疫病多數要進行分子生物學檢測，現行的國家和行業標準，都需要標準陽性毒株或陽性對 照質控物進行實驗質控，這些陽性毒株的引進需要辦理復雜的審批手續，購置費用昂貴，難 度較大，因此普通的植物疫病實驗室很難得到該病毒，對實驗室的質量控制及研究帶來了 極大的挑戰。
[0004] 為了幫助實驗室建立規范的質量保證，植物病毒及類病毒的標準樣品研制工作一 直在開展中。目前，國內外還沒有關于該種植物類病毒標準樣品的研究。我們將首次開發可 用于快速檢測桃潛隱花葉類病毒的分子標準樣品及制備技術。本標準樣品的研制成功，不 僅為檢測研究、醫藥研究、應用研究提供了標準樣品的需求，同時為檢驗檢疫機構技術指 導、服務出口企業提供技術上的支持。該發明成果將有望成為植物疫病分子診斷領域的突 破性產品及技術，是植物流行病學檢測技術體系的進一步完善和發展。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種穩定性高、均勻性好的桃潛隱花葉類病毒分子標準樣 品及其制備方法。
[0006] 為了得到所述桃潛隱花葉類病毒分子標準樣品，根據桃潛隱花葉類病毒(PLMVd) 基因全序列，設計全序列及特異性引物，其堿基序列如下：
[0007] SEQ ID N0：1:TTCGCCGTATGTCAACGGCT
[0008] SEQ ID N0：2:CGCTTAGCGCAGACTCTTCA
[0009] SEQ ID N0：3:GAGTGATGACCTCTCAGCCC
[0010] SEQ ID N0：4:TTCTACGGCGGTACCTGGAT
[0011] 本發明的桃潛隱花葉類病毒分子標準樣品，采用如下方法制備：
[0012] (1)采集感染桃潛隱花葉類病毒的植物組織，液氮研磨；
[0013] ⑵步驟⑴得到的植物組織中提取得至I」病毒RNA;
[0014] (3)步驟(2)的病毒RNA作為PCR反應模板，進行RT-PCR擴增反應，其中PCR反應的正 反引物分別為SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2;
[0015] (4)將步驟(3)的PCR擴增產物經純化后連接至PGEM-T載體中，連接產物轉化至感 受態細胞后，LB平板培養，篩選得到陽性克隆；
[0016] (5)陽性克隆中提取得到質粒，即為桃潛隱花葉類病毒的標準樣品；
[0017] (6)取制備的核酸標準樣品，加入50μ1ΤΕ，溶解后作為模板使用，經采用特異性引 物SEQ ID Ν0:3和SEQ ID Ν0:4進行PCR定性分析，確認所制備的核酸標準樣品為目的核酸 樣品。
[0018] 上述制備方法中，在步驟(4)中篩選陽性克隆的方法為RT-PCR方法，其中RT-PCR反 應的正反引物分別為SEQ ID Ν0:1和SEQ ID Ν0:2
[0019] 本發明的桃潛隱花葉類病毒分子標準樣品穩定性高、均勻性好，為桃潛隱花葉類 病毒的檢測研究、醫藥研究、應用研究提供了標準樣品的需求，同時為檢驗檢疫機構技術指 導、服務出口企業提供技術上的支持。使用本發明的標準樣品可以實現不同實驗室結果的 比對，從而保證實驗室的質量控制。
【附圖說明】
[0020] 圖1為實施例1中PLMVd目標基因的PCR擴增反應產物的電泳圖，其中Μ : DL2000Marker，1~2:PCR擴增產物擴增出292bp大小的片段;3~4:陰性對照。
[0021] 圖2是實施例1中PLMVd特異性引物擴增產物電泳結果圖，其中1~4:PCR擴增產物 擴增出16 lbp大小的片段;5、6為陰性對照毒株cDNA。
【具體實施方式】
[0022] 下述非限制性實施例可以使本領域的普通技術人員更全面地理解本發明，但不以 任何方式限制本發明。桃潛隱花葉類病毒分子標準樣品及其制備方法按如下步驟進行： [0023]實施例1桃潛隱花葉類病毒分子標準樣品的制備
[0024] (1)提取病毒 RNA;
[0025]采集O.lg感染桃潛隱花葉類病毒的植物組織加液氮研磨成粉末狀，將研磨物迅速 移入1 · 5mL離心管中，加入lmL Trizol Reagent，顛倒混勾，2°C~8°C，12000g，離心10min〇 取上清，15 °C~30 °C，放置5min;加入0.2mL氯仿，用手劇烈震蕩（勿渦旋振蕩），15s。15 °C~ 30°C，放置2min~3min;2°C~8°C，12000g，離心15min。小心吸取約為600yL的上層水相，勿 擾動中間相和下層相。加500yL異丙醇混合上清液，15°C~30°C，放置lOmin。2°C~8°C， 12000g，離心10min。去除上清液，沉淀中加入lmL 75 %乙醇，洗滌；2 °C~8 °C，7500g，離心 5miη。去除上清液，沉淀自然干燥后，將其溶于30yL~50yL無 RNase的水中，即為待檢模板 RNAJ2)目標基因的擴增
[0026]步驟（1)的病毒RNA作為PCR反應模板，本發明自行設計引物，進行RT-PCR擴增反 應，擴增桃潛隱花葉類病毒基因全序列，大小為292bp的片段，其中PCR反應的正反引物序列 如下：
[0027] SEQ ID NO：1：TTCGCCGTATGTCAACGGCT
[0028] SEQ ID NO：2:CGCTTAGCGCAGACTCTTCA
[0029] 擴增溶液中加入2 X RT-PCR buffer(10倍聚合酶鏈式Mix反應液）12 · 5yL, lOpmol/ yL SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2各0.5yL，將提取的待測樣品RNA加入反應體系中，DEPC水補 足體積至25yL，PCR循環條件為：48 ￡€3〇11^11，94°(：預變性51^11后，進入94°(：變性3〇8,53°(：退 火40s，72°C延伸45s，共循環35次;然后72°C再延伸lOmin.
[0030] 將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，取2g瓊脂糖，于100mL電泳緩沖液中加熱，充分溶 化，加入溴化乙錠貯存液至終濃度為0.5yg/mL，制膠。在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面 剛剛沒過凝膠;將3yL~6yL PCR擴增產物分別和適量加樣緩沖液混合，點樣;9V/cm恒壓電 泳，直至溴酚藍指示劑迀移至凝膠中部;紫外檢測儀下觀察電泳結果，待檢田間樣品能夠擴 增出預期條帶，擴增條帶為292bp，電泳結果見圖1和圖2。
[0031] (3)目標基因的序列測定
[0032]將PCR擴增產物送寶生物（大連)有限公司進行測序，測序結果如SEQ ID N0.5。將 所得序列通過NCBI在線nucleotide blast分析，結果表明：該核苷酸序列與桃潛隱花葉類 病毒(PLMVd)的核酸序列相似性最高達99%，為桃潛隱花葉類病毒基因全序列。
[0033] (4)目標基因的純化
[0034] 將步驟（2)中PCR擴增產物采用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2.0試劑盒(貨號DV805A)，并按其操作說明回收目標分子DNA片段，即SEQ ID NO. 5所示 的PLMVd N基因全序列。
[0035] (5)目的片段的連接轉化
[0036] 在步驟（4)中純化得到的目的片段4yL，2XRapid ligation buffer 5yL，PGEM-T 載體0.5yL，T4DNA Ligase 0.5yL，用無菌水補充至10yL，室溫連接lh。將連接產物加入到制 備好的感受態細胞E. col i JM109中，輕輕用移液器混勻，冰浴20min，42°C熱應激lmin，冰浴 2min，加入800yL S0C培養基，150g搖菌1 · 5h，1000g離心10min，棄去培養液，加入新鮮的S0C 培養基200yL，混勻后涂在含有Amp+的LB平板上，風干后，37°C倒置培養12h-16h。
[0037] 挑取單克隆菌在LB培養液中進行培養，用PCR方法進行陽性克隆的篩選，PCR體系 及反應條件見步驟(2)。將擴增產物進行瓊脂糖電泳鑒定，結果獲得了與預期大小一致的 292bp片段。
[0038] 應用Omega公司質粒提取試劑盒Plasmid Mini Kit I(lOOtest)，提取純化上述步 驟中篩選得到的陽性克隆，獲得重組質粒PGEM-T-PLMVd，每支EP管分裝成1 OOyL，每支重組 質粒含量為lyg，即為桃潛隱花葉類病毒分子標準樣品。
[0039] (6)標準品的鑒定
[0040]取制備的核酸標準樣品，加入50μ1ΤΕ，溶解后作為模板使用，經采用特異性引物 SEQ ID Ν0:3和SEQ ID Ν0:4進行PCR定性分析，擴增產物161bp，確認所制備的核酸標準樣 品為目的核酸樣品。
[0041] SEQ ID N0：3：GAGTGATGACCTCTCAGCCC
[0042] SEQ ID NO：4:TTCTACGGCGGTACCTGGAT
[0043] 擴增溶液中加入2\?〇?131^€61(10倍聚合酶鏈式組1反應液）12.541^1(^111〇1/^1^ SEQIDN0:3和SEQIDN0:4各0.5μL，將PLMVD標準品DNA加入反應體系中，DEPC水補足體積 至25yL，PCR循環條件為：94°C預變性5min后，進入94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸 30s，共循環35次;然后72°C再延伸10min.。
[0044] 實施例2桃潛隱花葉類病毒分子標準樣品的均勻性實驗
[0045]桃潛隱花葉類病毒分子標準樣品的均勻性測定是將如實施例1的方法制備的 PLMVd分子標準樣品隨機分成兩個樣品組，即樣品組A和樣品組B，每個樣品組各有15個標準 樣品，每個樣品按照如下反應條件進行PCR擴增，測定PCR產物濃度(ng/VL)，通過比較PCR產 物的濃度變化，按照統計學方法評價標準樣品的均勻性，
[0046] PCR反應體系：反應管中加入桃潛隱花葉類病毒分子標準樣品lyL(含lXl(r2yg DNA)，2XPCR buffer(10倍聚合酶鏈式Mix反應液）12.5yL，10pmolAiL SEQ ID N0:3和SEQ ID NO: 4各0.5yL，DEPC水補足體積至25yL。
[0047] PCR反應條件:94°C預變性5min后，進入94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s， 共循環35次;然后72°C再延伸10min。
[0048] 結果如表1，2和3。
[0049] 表1桃潛隱花葉類病毒分子標準樣品均勻性測定結果
[0052] 表2桃潛隱花葉類病毒分子標準樣品均勻性評價結果
[0053]
[0054] 表3桃潛隱花葉類病毒分子標準樣品均勻性檢測
[0057] 從表1及其統計結果(表2和表3)的結果可知，兩個樣品組之間不存在顯著差異，可 以認為樣品是均勻的。
[0058] 實施例3桃潛隱花葉類病毒分子標準樣品的穩定性實驗
[0059] 將實施例1的方法制備的桃潛隱花葉類病毒分子標準樣品隨機分組，每個樣品按 照實施例2所述的PCR反應體系和PCR反應條件下進行PCR擴增，測定PCR產物濃度(ng/yL)， 通過比較PCR產物的濃度變化，按照統計學方法評價標準樣品的穩定性。
[0060] 采用兩種類型的穩定性試驗：
[0061] -種是在-20°C下的穩定性試驗，隨機取桃潛隱花葉類病毒分子標準樣品24份，每 個月檢測2份，連續12個月，結果如表4。
[0062] 另一種是在較高的溫度20°C下的穩定性試驗，隨機取桃潛隱花葉類病毒分子標準 樣品12份，每周檢測3份，連續4周，測試結果如表5。
[0063] 表4.穩定性檢驗實驗(-20 °C)
[0064]
[0065] 對表4結果的F檢驗結果為F = 3.4615，F勃.Q5 = 4.2838，F<FCr[Q.()5,5,5]，即樣品間無 顯著性差異。
[0066] 表5.穩定性檢驗實驗(20°C)結果
[0067]
[0068] 表6.方差分析
[0071] 對表6結果方差分析結果為F = 5.7777，F勃.Q5 = 4.066，F<FCr[Q.()5,5,5]，即樣品間無 顯著性差異。
[0072]實施例4定值方法
[0073]由實施例1的方法制備的桃潛隱花葉類病毒分子標準樣品隨機選15個，每個樣品 按照實施例2所述，用桃潛隱花葉類病毒聚合酶鏈反應方法進行定值試驗，結果完全一致， 均為桃潛隱花葉類病毒核酸陽性。
[0074]本桃潛隱花葉類病毒分子標準樣品經福建檢驗檢疫局、煙臺檢驗檢疫局、甘肅檢 驗檢疫局、廣東檢驗檢疫局等協作試驗定值結果統計見表7。
[0075]表7.協作試驗定值結果表
[0076]
[0077] 應用桃潛隱花葉類病毒聚合酶鏈反應方法對本標準樣品的定值實驗結果均為桃 潛隱花葉類病毒核酸陽性。
【主權項】
1. 一種桃潛隱花葉類病毒標準樣品的制備方法，其特征在于，制備步驟如下： (1) 采集感染桃潛隱花葉類病毒的植物組織，液氮研磨； (2) 步驟(1)得到的植物組織中提取得到病毒RNA; (3) 步驟(2)的病毒RNA作為PCR反應模板，進行RT-PCR擴增反應，其中PCR反應的正反引 物分別為SEQ ID NO: 1 和SEQ ID NO:2; (4) 將步驟(3)的PCR擴增產物經純化后連接至PGEM-T載體中，連接產物轉化至感受態 細胞后，LB平板培養，篩選得到陽性克隆； (5) 陽性克隆中提取得到質粒，即為桃潛隱花葉類病毒的標準樣品； 其中所述感受態細胞為E.coli JM109。2. -種利用權利要求1所述方法制備的桃潛隱花葉類病毒標準樣品。
【文檔編號】C12Q1/70GK105950616SQ201610355529
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月25日
【發明人】吳興海, 張成標, 王振華, 李明哲, 邵秀玲, 張京宣, 王英超
【申請人】山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心