一種體外快速組裝非磷酸化dna片段的方法
【專利摘要】本發明公開了一種體外快速組裝非磷酸化DNA片段的方法，屬于基因工程技術領域。本發明在需要組裝構建的目標片段兩末端引入同源臂序列，采用熱循環進行變性?退火?切割?連接的方式，實現快速體外DNA組裝構建。在1.5h內一次可以實現2?4個非磷酸化DNA片段的高效快速的無縫組裝。本發明可用于常規的DNA重組構建，并實現高通量操作，特別適合于對酶基因和合成途徑的體外高效組裝上，可引入豐富的組合突變多樣性，進行快速定向進化和合成生物學操作。
【專利說明】
一種體外快速組裝非磷酸化DNA片段的方法
技術領域
[0001] 本發明涉及一種體外快速組裝非磷酸化DNA片段的方法，屬于基因工程技術領域。
【背景技術】
[0002] 上個世紀分子生物學領域顯著的成就是限制性內切酶和DNA連接酶的發現，奠定 了體外DNA重組構建的基礎技術。DNA重組技術極大的促進了人們在基因的結構、功能領域 的認識，為酶工程、代謝工程和合成生物學的快速發展奠定了基礎。然而，在實際的操作過 程中，由于受制于限制性酶切位點，DNA片段的重組構建，特別是多個片段的組裝構建，傳統 的常規酶切連接技術就顯得捉襟見肘。酶切位點的數量限制，特別是繁瑣緩慢的分步克隆 重組操作根本難以滿足現代代謝工程和合成生物學中復雜的代謝途徑和調控元件的快速 組裝構建。因此，構建一種不依賴序列的DNA快速重組技術顯得尤為迫切。
[0003] 隨著分子生物學技術和基因工程技術的發展，能夠產生粘性末端的單鏈核酸外切 酶被發現，由此建立起來的不依賴序列和連接的克隆重組技術(SLIC)應運而生并且在代謝 工程和合成生物領域快速發展和應用。例如，最經典的方法，是基于T5核酸外切酶和T4DNA 聚合酶的LIC系統，該系統作為一種高效的方法被應用于大規模的基因克隆及載體構建。該 方法在設計PCR擴增引物時需添加特定長度（多15nt)的與鄰近重組的DNA片段(載體)末端 同源的序列作為重組區段，這段區域可以不受序列的限制。PCR擴增制備好需要組裝構建的 片段后，利用T4DNA聚合酶或者T 5核酸外切酶的3 '-5 '和5 ' -3 '外切酶活性，水解單鏈使載 體和克隆片段末端產生5'或者3'末端突出的單鏈粘性末端。該反應產物在退火條件下而不 需要連接酶的作用即可通過突出的粘性末端發生較為穩定的配對復性，并借助于宿主大腸 桿菌內的DNA修復系統重新環化成新的質粒。隨后在此基礎上改進的技術，例如一步等溫組 裝反應等，通過在反應中加入DNA聚合酶(聚合活性補齊缺口）和DNA連接酶(缺口補平），由T 5核酸外切酶產生的單鏈DNA突出端，相互結合并由DNA聚合酶延伸補齊缺口，最后由連接酶 把缺口修復補平形成完整的DNA雙鏈，這使得不依賴序列的克隆技術效率進一步顯著提高。 然而，上述方法中，核酸外切酶產生的單鏈長度不可精確地控制，導致短片段不適宜組裝， 并且4個片段以上的組裝效率急劇下降;并且涉及三種酶。
[0004] 與此同時，大量的利用其它序列特異性的核酸內切酶接到的組裝方法也發展迅 速，例如Golden Gate組裝和單鏈缺口切割酶組裝，盡管這種組裝技術可以快速實現一步組 裝6-10個基因片段，然而依然受到限制性酶切位點的限制，特別是組裝構建的片段重組區 域會留下一段6-10bp疤痕序列，這極大限制了它在應用。再者，酵母介導的體內同源重組技 術也相應發展起來，該方法在設計PCR引物擴增目標片段時，需添加一定長度（多40nt)的與 鄰近重組的DNA片段(載體)末端同源的序列作為同源重組區段，這段區域可以不受序列的 限制。所有帶有同源末端序列的片段和酵母載體一同電轉釀酒酵母，可以在酵母體內一次 實現多達25個基因片段的組裝，并且無序列依賴性和無痕重組。這一技術對合成生物學和 代謝工程的發展相當有吸引力。但是，由于需要的同源區域較長，極大的增加了引物的合成 費用，特別是對于非釀酒酵母途徑的構建，比較復雜和耗時(長達10-15天）。近期，一種基于 耐熱DNA聚合酶和連接酶體外快速組裝DNA的方法DATEL被提出，在需要組裝構建的目標片 段兩末端引入同源臂序列，采用熱循環進行變性-退火-切割-連接的方式，實現快速體外 DNA組裝構建。在2h內一次可以實現2-6個片段的高效快速的無縫組裝。此外，可通過在引物 中引入兼并突變序列實現PCR擴增后獲得含有不同突變區域的DNA片段，進而通過該組裝方 法實現對基因 DNA的組裝突變構建。然而，這一技術不僅需要對各片段預先進行磷酸化處 理，增加了實驗的步驟，且三種酶在Taq DNA連接酶緩沖液體系中無法同時達到較高的反應 速率從而加長了反應的時間。因此，迫切需要開發一種操作簡單、節省時間的體外不依賴序 列且可以高通量操作和無痕的組裝技術以滿足現代快速發展的合成生物學。
【發明內容】
[0005] 為了解決上述問題，本發明提供了一種體外快速組裝非磷酸化DNA片段的方法，可 快速組裝2-4個基因片段。
[0006] 本發明的方法，首先對需要組裝的DNA片段進行PCR以獲得具有重疊末端的亞片 段，所得亞片段經包括變性、退火、切割、連接的熱循環反應進行重組。
[0007] 所述對需要組裝的DNA片段進行PCR，是根據設定的DNA片段的組裝順序，針對每個 需要重組的DNA片段(靶基因）分別設計正反向兩條引物，用于擴增相鄰的需要重組的DNA片 段的引物之間有20-40bp的序列完全匹配，使擴增得到的各亞片段之間具備體外組裝的同 源臂。
[0008] 所述熱循環反應在緩沖液中進行；緩沖液的pH為7.2-7.6，含有終濃度為1. Ο-?.δπιΜ NAD+、2.0-10.0mM Mg2+〇
[0009] 所述熱循環反應在MTL緩沖液(Modified Taq DNALigase Buffer)中進行；10 X MTL緩沖液含有200mM ρΗ7·2的Tris-HCl、250mM KCl、50mM MgCl2、15mM NAD+、l%Triton X-100(即含有終濃度20.0mM的Tris-HCl、25.0mM KCl、5.0mM MgCl2、1.5mM NAD+、0.1%Triton X-100)。所述的切割由具有5 ' -3 '外切酶活性的耐熱DNA聚合酶Taq DNA聚合酶催化;所述的 連接由具有單鏈無間隙缺口連接功能的耐熱DNA連接酶催化;所述方法中不需要對DNA片段 和PCR所用的引物進行磷酸化處理。
[0010] 在本發明的一種實施方式中，所述的DNA連接酶為Taq DNA連接酶。
[0011]所述熱循環反應中變性溫度為94°C，退火溫度為50°C ;切割溫度為68°C，切割時間 5-30min;連接溫度50 °C，連接時間5min;熱循環數為1-5個循環。
[0012]在本發明的一種實施方式中，所述熱循環反應中變性溫度為94°C，退火溫度為50 °C;切割溫度為68°C，切割時間lOmin;連接溫度50°C，連接反應時間5min;熱循環數為3。
[0013] 在本發明的一種實施方式中，所述用于擴增相鄰的需要重組的DNA片段的引物之 間有30bp的序列完全匹配。
[0014] 在本發明的一種實施方式中，所述熱循環反應具體是:取制備好的亞片段各50ng， 同時加入 1·5μ1 10XMTL緩沖液，0·2μ1 Taq DNApolymerase，lyl Taq DNAligase，補足水 至1541體系；按如下程序反應：941€2111丨11，（94 1€308,50°(：1111丨11，68°(：10111丨11，501€5111丨11)\3， 66°C10min。
[0015] 本發明方法，與DATEL相比，由于無需pfu DNA聚合酶，減少了將DNA片段或引物進 行磷酸化處理的步驟，且通過對反應緩沖液的優化將切割時間由30min減少至lOmin，大大 節約了時間。
[0016] 本發明方法可用于DNA重組構建、合成途徑的組裝、蛋白組裝進化和代謝途徑組合 改造等，所得產物可以保存在_20°C或者直接進行轉化感受態細胞。
[0017] 所述的亞片段可以是結構基因、載體。
[0018] 本技術采用耐熱缺口連接酶和DNA聚合酶介導的體外重組DNA片段技術。根據設定 的組裝順序，向合成引物中引入相應的同源序列，借助變性退火溫度循環，DNA聚合酶的外 切酶活性和連接酶活性實現DNA的無痕組裝。參見圖1，用于組裝的片段兩端分別含有20-30bp的同源序列與鄰近組裝的片段一致，采用PCR熱循環反應體系，DNA經94°C變性后退火 至50-60°C，同源臂互補匹配結合，隨后形成如圖中所示的"flap"結構，"flap"可以為5'或 者3'末端序列，此時每個結合部位有1/2的概率出現全為5'末端序列，這時此部分多出的 "flap"序列借助Taq DNA聚合酶5 '-3 '外切酶活性在68 °C下反應進行切除，形成具有缺口的 契合鏈，再借助耐熱Taq DNA連接酶在50°C進行缺口補平連接，從而形成完整的重組片段。 此技術由于采用的均為耐熱酶，可以進行多次熱循環反應(變性-退火-切割-連接）以增加 重組體。
[0019] 本發明克服了已有報道的組裝技術序列限制，效率低，耗時長和成本高等因素，在 1.5h內一次可以實現2-4個片段的高效快速的無縫組裝。本發明可用于常規的DNA重組構 建，并實現高通量操作，特別適合于對酶基因和合成途徑的體外高效進化改造上，引入豐富 的組合突變多樣性。
【附圖說明】
[0020]圖1所示為本體外組裝技術的原理示意圖，是利用耐熱Taq連接酶和Taq DNA聚合 酶，體外快速組裝多個非磷酸化片段。
[0021] 圖2所示為PCR驗證兩個片段(gfp和PUC19)組裝的正確率，箭頭所示為正確組裝的 gfp目標條帶。
[0022] 圖3所示為本組裝技術中不同成分緩沖液對組裝效率的影響。
[0023]圖4所示為PCR驗證三個片段(gfp、kan和pUC19)組裝的正確率，箭頭所示為正確組 裝的目標條帶（1.5kb)。
[0024]圖5所示為本組裝技術快速組裝四個DNA片段示意圖。
[0025] 圖6所示為PCR驗證四個片段(C〇aA、dfp、C〇aD和pUC19)組裝的正確率，箭頭所示為 正確組裝的目標條帶(2.5kb)。
[0026]序列表中為核苷酸序列信息說明
[0027] (l)SEQ ID NO. 1為綠色熒光蛋白編碼基因 gfp的核苷酸序列；
[0028] (2)SEQ ID從).2為卡那霉素編碼基因 1?111的核苷酸序列；
[0029] (3)SEQ ID NO.3為大腸桿菌來源的輔酶A合成途徑基因 coaA編碼序列；
[0030] (4)SEQ ID N0.4為大腸桿菌來源的輔酶A合成途徑基因 dfp編碼序列；
[0031] (5)SEQ ID N0.5為大腸桿菌來源的輔酶A合成途徑基因 coaD編碼序列。
【具體實施方式】
[0032]實施例1對組裝技術的反應系統優化
[0033] 以綠色熒光蛋白基因 gfp(序列如SEQ ID N0:1所示）和pUC19載體為例，進行組裝 反應緩沖液優化。首先對組裝反應的pH、Mg2+和NAD+這三種組分進行優化，根據gfp片段和載 體序列設計帶有30bp同源臂的gfp擴增引物，和一對載體pUC19擴增引物。引物如下所示：
[0038] 以引物pucl9-F(序列如SEQ ID N0:6所示）和pucl9-R PCR(序列如SEQ ID N0:7所 示)擴增制備組裝反應用的載體片段pUC19;采用引物gfp-P30F(序列如SEQIDN0:8所示） 和gfp-P30R(序列如SEQ ID N0:9所示)擴增gfp基因片段，PCR反應體系如下：2X預混super pfu mix(杭州寶賽生物)25μ1，上下游引物各ΙμΙ(ΙΟμΜ)，模板核酸lyl(10ng)，加水補足50μ 1。反應程序為：94 1€41^11預變性；【941€3〇8變性，581€3〇8,72°(：】\32 ;721€51^11。？0?結束 后，反應液各添加 lylDpnl限制性內切酶，混勻后在37 °C孵育30min消化模板DNA1CR產物以 1%瓊脂糖凝膠電泳切膠回收。采用凝膠回收試劑盒按說明書推薦方法回收PCR產物。上述 制備的載體和PCR片段采用NaNoDrop 2000測定核酸濃度。
[0039] 組裝反應操作，按如下體系配置組裝反應液15μ1體系：1.5μ1 10 X反應緩沖液， 50ng gfp片段，50ng pUC19載體，0·2μ1 Taq DNApolymerase，lyl Taq DNAligase，補足水 至 15μ1 體系。按如下熱循環程序反應：94°C2min，【94°C30s，45°Clmin，68°C10min，50°C 5min】X3,60°C10min。熱循環反應結束后。產物可以保存在-20°C，或者直接轉化感受態細 胞，涂布含l〇〇μg/ml氨芐霉素的LB平板，37°C過夜培養后，對長出的克隆進行菌落PCR驗證 和測序。
[0040] 分別對不同緩沖液下（不同pH、Mg2+濃度和NAD+濃度)轉化長出的克隆進行計數和 PCR驗證，隨機挑取部分轉化重組子送樣測序。結果如圖2所示，對每個組裝反應的轉化子中 隨機選取的192個菌落PCR結果顯示，所有的轉化子均成功的組裝，進一步測序結果也證實 了本發明的組裝技術實現了兩個片段的100%正確率的重組。進一步對長出的克隆數量進 行統計分析，結果如圖3所示，加入pH 7. Ο-pH 8.0不同反應緩沖液，發現組裝反應在加入 pH7.2的反應緩沖液時的組裝效率最高（其中pH 7.6的緩沖液為原始Taq DNA連接酶緩沖 液）；1〇Χ緩沖液中加入不同濃度的NAD+(為Taq DNA連接酶的輔因子），發現組裝反應在 15mM NAD+的反應緩沖液時的組裝效率最高；10 X緩沖液中加入不同濃度的Mg2+(為Taq DNA 聚合酶的依賴性離子），發現組裝反應在50mM Mg2+的反應緩沖液時的組裝效率最高。我們將 ρΗ7·2,含有15mM NAD+，50mM Mg2+的優化后緩沖液命名為10XMTL緩沖液(Modified Taq DNALigase Buffer)，即熱循環反應的初始體系中含有終濃度20.0 mM的Tris-HCl、25 . OmM KCl、5.0mM MgCl2、1.5mM NAD+、0.1%Triton X-100)。在此緩沖液中，組裝效率最高，為每微 克DNA產生12460個菌落形成單位(CFU)。
[0041] 實施例2應用本發明的組裝技術快速組裝3個片段
[0042]為了驗證組裝多個片段的效率和正確率，以綠色熒光蛋白基因 gfp、卡那霉素基因 kan(序列如SEQ ID N0:2所示）和pUC19載體為例，進行3個片段的組裝（圖4)。引物信息如 下：
[0043] GK/pUC19-F:ATGAGTTCTTCTAAGTCATAGCTGTTTCCT
[0049] 以引物GK/pUC19-F(序列如SEQIDN0:10所示）和GK/pUC19-R(序列如SEQIDN0: 11所示)PCR擴增制備組裝反應用的載體片段PUC19;采用引物GK/gfp-F(序列如SEQ ID NO: 12所示)和GK/gfp-R(序列如SEQ ID NO: 13所示)擴增gfp基因片段;采用引物GK/kan-F (序 列如SEQ ID NO: 14所示)和GK/kan-R(序列如SEQ ID NO: 15所示)擴增kan基因片段，按上述 PCR反應體系和程序操作，結束后反應液各添加 lylDpnl限制性內切酶，混勻后在37°C孵育 30min消化模板DNAWCR產物以1%瓊脂糖凝膠電泳切膠回收。采用凝膠回收試劑盒按說明 書推薦方法回收PCR產物。上述制備的載體和PCR片段采用NaNoDrop 2000測定核酸濃度。
[0050] 組裝反應操作，按如下體系配置組裝反應液15μ1體系：1.5μ1 10 XMTL緩沖液，DNA 插入片段和相應的載體各50ng(3個片段組裝：pUC19載體、gfp和kan)，0.2yl Taq DNA polymerase，ΙμL Taq DNA1 igase，補足水至 15μ1 體系。按如下PCR程序反應：94°C2min，【94 °C 30s，50 °C lmin，68 °C 10min，50 °C 5min】X 3，60 °C 10min。熱循環反應結束后。產物直接轉化 感受態細胞，涂布含l〇〇μg/ml氨芐卡那霉素的LB平板，37°C過夜培養后，對長出的克隆進行 統計分析，3個片段的組裝效率達到每微克DNA產生830個菌落形成單位數(CFU)。經過隨機 挑去部分轉化子進行PCR驗證和DNA測序分析，結果顯示，3個片段的組裝正確率達到75% (圖4)。本部分實施例說明，本發明技術可以快速高效的無痕組裝三個DNA片段。
[0051 ]實施例3應用本組裝技術快速組裝4個片段
[0052]為了驗證本組裝方法多個片段的組裝能力，采用大腸桿菌來源的輔酶A途徑基因 進行4個片段的組裝應用。將該途徑的3個基因 coaA(序列如SEQ ID N0:3所示）、dfp(序列如 SEQ ID NO:4所示）、coaD(序列如SEQ ID NO:5所示)進行串聯表達，表達載體為（如圖5所 示），并按此順序設計組裝進載體PUC19中。本實施例的引物信息如下：
[0061 ]載體pUC19采用引物C0A/pucl9-F(序列如SEQ ID 如：16所示）和0^/^11(319-1?(序 列如SEQ ID勵:17所示)進行?0財廣增。三個0嫩片段〇〇&4、(^?、(3〇&0分別采用相應的引物對 (序列分別如SEQ ID N0:18、SEQ ID N0:19、SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22、 SEQ ID N0:23所示)進行擴增制備。按上述PCR反應體系和程序操作，結束后反應液各添加1 ylDpnl限制性內切酶，混勻后在37°C孵育30min消化模板DNAWCR產物以1%瓊脂糖凝膠電 泳切膠回收。采用凝膠回收試劑盒按說明書推薦方法回收PCR產物。上述制備的載體和PCR 片段采用NaNoDrop 2000測定核酸濃度。
[0062] 組裝反應操作，按如下體系配置組裝反應液15μ1體系：1.5μ1 10XMTL緩沖液，三 個DNA片段coaA、dfp、coaD各50ng，50ng pUC19載體，0·2μ1 Taq DNApolymerase，lyl Taq 0嫩1丨8386，補足水至15以1體系。按如下？0?程序反應:941€2111丨11，【94 1€3〇8,50°(：11^11，681€ 10min，50°C5min】X3,60°C10min。熱循環反應結束后。產物直接轉化感受態細胞，涂布含 l〇〇μg/ml氨芐霉素的LB平板，37°C過夜培養后，對長出的克隆進行統計分析，對4個片段的 組裝(5.1kb)效率達到每微克DNA產生450個菌落形成單位(CFU)。進行菌落PCR驗證和測序。 如圖6所示，PCR驗證結果顯示，大約55%左右的克隆顯示組裝插入的片段條帶偏小或無條 帶（不正確的組裝），而45%的克隆顯示正確大小的目標條帶。進一步測序分析顯示，所有 PCR驗證的正確條帶的克隆均成功實現了正確無誤的組裝。
[0063]雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技 術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護范 圍應該以權利要求書所界定的為準。
【主權項】
1. 一種體外快速組裝非磷酸化DNA片段的方法，其特征在于，所述方法首先對需要組裝 的DNA片段進行PCR以獲得具有重疊末端的亞片段，所得亞片段經包括變性、退火、切割、連 接的熱循環反應進行重組;所述熱循環反應在緩沖液中進行;緩沖液的PH為7.2-7.6，含有 終濃度1.0-1.5mM的NAD+、2.0-10.0 mM的Mg2+;所述的切割由具有5 '-3 '外切酶活性的耐熱 DNA聚合酶Taq DNA聚合酶催化;所述的連接由具有單鏈無間隙缺口連接功能的耐熱DNA連 接酶催化;所述方法中不需要對DNA片段和PCR所用的引物進行磷酸化處理。2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述熱循環反應在MTL緩沖液中進行；IOX MTL緩沖液含有200mM ρΗ7·2的Tris-HCl、250mM KCl、50mM MgCl2、15mM NAD+、l%Triton X-IOO03. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述對需要組裝的DNA片段進行PCR，是根 據設定的DNA片段的組裝順序，針對每個需要重組的DNA片段分別設計正反向兩條引物，用 于擴增相鄰的需要重組的DNA片段的引物之間有20-40bp的序列完全匹配，使擴增得到的各 亞片段之間具備體外組裝的同源臂。4. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述熱循環反應中變性溫度為94°C，退火 溫度為50°C ;切割溫度為68°C，切割時間5-30min;連接溫度50°C，連接時間5min;熱循環數 為1-5個循環。5. 根據權利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述熱循環反應中變性溫度為94 °C，退火溫度為50°C ;切割溫度為68°C，切割時間IOmin;連接溫度50°C，連接反應時間5min; 熱循環數為3。6. 根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述所述用于擴增相鄰的需要重組的DNA 片段的引物之間有30bp的序列完全匹配。7. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述熱循環反應具體是:取制備好的亞片 段各 50ng，同時加入 1·5μ1 IOx MTL 緩沖液，0·2μ1 Taq DNApolymerase，lyl Taq 0財1丨8386，補足水至15以1體系；按如下程序反應：941€2111丨11，（94 1€3〇8,50°(：1111丨11，681€ IOmin，50°C5min) X3，66cClOmin。8. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述亞片段為結構基因或者載體。9. 權利要求1-8任一所述的方法在DNA重組構建、合成途徑的組裝、蛋白組裝進化或者 代謝途徑組合改造方面的應用。
【文檔編號】C12N15/10GK105950613SQ201610543258
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年7月11日
【發明人】康振, 陳堅, 堵國成, 丁雯雯, 金鵬
【申請人】江南大學