一種固定酶載體材料及其制備方法
【專利摘要】本發明公開一種固定酶載體材料及其制備方法，具體涉及一種硅膠表面經過兩親性物質修飾的載體材料，包括硅膠材料和修飾形成于所述硅膠材料表面的兩親性物質；其制備方法為將硅膠粉末加入甲基磺酸水溶液中進行活化，然后加入乙醇水溶液和3?(甲基丙烯酸酰氧)丙基三甲氧基硅烷制備成MPS?硅膠，最后加入可聚合溶劑水溶液制成表面形成兩親性物質的固定酶載體材料。本發明的固定化酶載體提高了酶的操作穩定性、提高載體材料、酶與底物的相適應性，且其制備工藝較簡單、成本低容易實現工業化。
【專利說明】
一種固定酶載體材料及其制備方法
技術領域
[0001] 本發明涉及催化材料與化學合成技術，具體涉及一種固定酶載體材料及其制備方 法。
【背景技術】
[0002] 酶作為具有特殊催化功能的生物催化劑，由于其催化高效性、高專一性及反應條 件溫和等性質被廣泛用于生物工程、食品工業、醫藥、精細化學工業等領域。脂肪酶是各種 生物酶反應包括:對映選擇性水解和酯化、手性拆分、對映體單體制備及大分子聚合反應 等，普遍存在的酶。但是游離酶在水溶液中很不穩定，重復使用性差，同時對熱、高離子濃 度、強酸、強堿及部分有機溶劑等均不夠穩定，容易降低甚至喪失其催化能力。另外，酶促反 應后酶與底物和產物不易分離，產物中或多或少有酶的殘留，導致產品純度不高及酶回收 重復使用性變差。游離酶的這些不足極大制約了其實際生產中的應用。為了解決酶存在的 問題，人們將酶固定于載體材料中。目前固定酶的方法主要有物理法(吸附和包埋)和化學 法(交聯和共價結合）。共價結合主要是通過載體的活性官能團與酶分子中的部分官能團形 成共價鍵，由于這種共價結合力度強，從而大大提高了酶的穩定性，但這種共價結合的有可 能會對造成酶變形而導致酶活性降低。包埋主要是將酶捕獲到聚合物內部空隙中，但這種 孔內部結構易使傳質受到限制;吸附主要是通過氫鍵、靜電吸附、范德華力等微弱的分子間 作用力將酶吸附到載體表面，但吸附力弱，酶與載體易脫落，污染產物，不利于回收。然而吸 附法固定酶操作簡單且成本低，易于產業化生產，是目前使用較多的一種固定酶方法。
[0003] 目前，吸附法固定酶的載體材料主要是采用無機材料如:介孔碳材料、磁性Fe203/ Fe304、水滑石、Ti02、介孔二氧化硅及硅膠、聚合物材料、多糖、苯乙烯樹脂、聚羥基丁酸戊 酯等來固定酶。其中多孔結構材料包括介孔碳材料和介孔娃氧化物微球，但介孔材料如氧 化石墨烯、碳納米管、有序介孔碳CMK-3等價格高昂，不利于產業化。目前研究硅膠及其相關 的報道有很多，介孔硅材料由于其如具有較高的比表面積、孔隙率、表面具有較活波官能團 而被廣泛研究。但是介孔硅材料制備工藝復雜繁瑣，且制備成本較高，不利于固定酶的大規 模生產及商業化。相比之下，硅膠材料廉價易得，表面的多羥基官能團能夠對酶進行吸附且 易進行相關的改性修飾使其功能化，為酶的固定提供了很好的條件，同時制備工藝簡單，容 易大規模產業化。但是，現有的硅膠材料的吸附固定的穩定性較低，且不利于提高酶的活 性。
[0004]
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于克服上述技術不足，提出一種固定酶載體材料，本發明的固定 酶載體材料利用硅膠表面的多羥基部分吸附酶，同時采用兩親性物質對表面進行修飾改性 靜電吸附酶，提高酶的操作穩定性;同時使得硅膠表面具有兩親性，能夠促使固定酶對底物 環境相適應，提供酶促反應所需要的界面環境，從而提高酶的催化效率。而且，本發明還提 供一種固定酶載體材料的制備方法。
[0006] 為達到上述技術目的，本發明的技術方案一方面提供一種固定酶載體材料，包括 硅膠材料和修飾形成于所述硅膠材料表面的兩親性物質。
[0007] 優選的，所述兩親性物質為聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、聚氧乙烯或聚乙烯 醇。
[0008] 本發明另一方面還提供一種固定酶載體材料的制備方法，包括如下步驟， a、 將硅膠粉末置于質量百分比為5%的甲基磺酸水溶液中，在102°C下攪拌4小時后過 濾，將過濾得到的固體通過去離子水進行多次清洗后真空干燥24小時，即得活化的硅膠； b、 在活化后的硅膠中加入乙醇水溶液和3-(甲基丙烯酸酰氧)丙基三甲氧基硅烷，并在 氮氣氣氛、50°C的條件下反應24小時后過濾，過濾后的固體顆粒通過乙醇清洗多次，真空干 燥即得表面活化的MPS-硅膠； c、 將步驟b所得的MPS-硅膠中加入可聚合溶劑水溶液，并在氮氣條件下充分反應，過 濾、干燥即得表面形成兩親性物質的固定酶載體材料。
[0009] 優選的，所述兩親性物質為PVP，所述可聚合溶劑水溶液由N-乙烯基吡咯烷酮、過 硫酸銨、三乙胺加入去離子水中形成。
[0010] 優選的，所述步驟C還包括在氮氣條件下攪拌1小時后，升高溫度至70°C繼續攪拌8 小時，過濾、干燥即得硅膠表面接枝聚合有PVP的固定化酶載體。
[0011] 優選的，所述步驟c包括將MPS-硅膠分散于乙二醇和氫氧化鈉的混合溶液中，在氮 氣條件下升溫至120°c，滴加環氧乙烷反應30分鐘，冷卻、過濾、洗滌、干燥即得硅膠表面聚 合有ΡΕ0的固定化酶載體。
[0012] 優選的，所述兩親性物質為聚乙烯醇。
[0013] 優選的，所述可聚合溶劑水溶液中N-乙烯基吡咯烷酮、過硫酸銨、三乙胺的質量百 分比分別為15%、2%、3%。
[0014] 優選的，所述步驟B中活化后的硅膠中加入的乙醇水溶液中乙醇與水的體積比為 6:1〇
[0015] 與現有技術相比，本發明的有益效果包括： 1、 該固定酶載體材料，具有較大比表面積，與酶結合率較高且能夠將酶牢固的固定在 載體表面，提高了酶的操作穩定性； 2、 該固定酶載體材料，其兩親性能夠為酶促反應提供良好的催化界面環境，提高載體 材料、酶與底物的相適應性。
[0016] 3、該固體酶載體材料，制備工藝較簡單，成本低容易實現工業化。
【附圖說明】
[0017] 圖1是本發明的硅膠-PVP載體固定CRL酶與游離CRL酶的熱穩定性曲線對比圖； 圖2是本發明的硅膠-PVP載體固定CRL酶的重復實用性曲線； 圖3是本發明的硅膠-PVP載體固定CRL酶的掃描電鏡圖。
[0018]
【具體實施方式】
[0019] 為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對 本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并 不用于限定本發明。
[0020] 實施例1 取7.5ml的甲基磺酸配成質量百分比為5%的水溶液，將30g的硅膠粉末分散在甲基磺酸 水溶液中，在l〇2°C下攪拌4h，過濾后用去離子水洗滌多次，然后再真空干燥24h，得到活化 后的硅膠。
[0021] 將上述活化后的硅膠中加入140ml乙醇水溶液，然后再加入15.01g3-(甲基丙烯酸 酰氧）丙基三甲氧基硅烷，氮氣氣氛下，50°C反應24h;反應結束后過濾，并用乙醇反復洗滌 去除多余MPS，真空干燥得到表面活化的MPS-硅膠;其中，本實施例中采用的MPS為3-(甲基 丙烯酸酰氧)丙基三甲氧基硅烷的簡稱。
[0022] 將21mgN-乙烯基吡咯烷酮、2.8mg過硫酸銨、4.2mg三乙胺分散于140ml去離子水 中，將上述制備的MPS-硅膠顆粒分散其中，反復充放氮氣后，在氮氣氣氛下攪拌lh。然后將 溫度升至70 °C攪拌8h，使得N-乙烯基吡咯烷酮在MPS-硅膠表面進行接枝聚合，并形成表面 具有聚乙烯吡咯烷酮的固定化酶載體;為了便于后續描述，實施例中N-乙烯基吡咯烷酮和 聚乙烯吡咯烷酮分別采用簡稱，具體為N-乙烯基吡咯烷酮的簡稱是NVP、聚乙烯吡咯烷酮的 簡稱為PVP，相對應的，上述制備的固定酶載體為硅膠-PVP載體。
[0023] 將1.17g CRL分散于50ml的0.1M、PH=7.0的PBS緩沖溶液中，然后加入0.5g上述制 備的硅膠-PVP載體材料充分分散，將硅膠-PVP載體與酶的混合物置于37 °C的搖床中，在 160rpm的搖速下反應3小時，過濾，并采用去離子水洗滌5次后，離心凍干干燥后即得固定化 酶，具體為硅膠-PVP載體固定CRL，將上述固定化酶保存在4°C環境下。其中，本實施例中的 CRL為皺褶假絲酵母脂肪酶的簡稱。
[0024]固定化酶的熱穩定性、重復使用率結果如附圖1、圖2所示。將制備的固定化酶通過 PNPP顯色法測定催化活力，結果顯示:在固定化酶重復多次使用后，固定化酶催化活性保持 穩定;在50°C下，隨反應時間的增加，固定化酶的相對活性較游離酶穩定，這說明酶固定在 本發明的載體材料上，其熱穩定性有所提高。
[0025] 實施例2 取7.5ml的甲基磺酸配成質量百分比為5%的水溶液，將30g的硅膠粉末分散在甲基磺酸 水溶液中，在l〇2°C下攪拌4h，過濾后用去離子水洗滌多次，然后再真空干燥24h，得到活化 后的硅膠。
[0026] 將上述活化后的硅膠中加入140ml乙醇水溶液，然后再加入15. OlgMPS，氮氣氣氛 下，50°C反應24h;反應結束后過濾，并用乙醇反復洗滌去除多余MPS，真空干燥得到表面活 化的MPS-硅膠;其中，本實施例中采用的MPS為3-(甲基丙烯酸酰氧)丙基三甲氧基硅烷的簡 稱。
[0027]稱取起始劑乙二醇和NaOH放入500ml反應釜內，將上述MPS-硅膠顆粒分散其中，然 后用氮氣置換3次后，升溫至115°C，抽真空脫水lmin，然后向反應釜內充氮氣，當溫度升至 120°C時，緩慢滴加適量還氧乙燒，并保證溫度不能超過140°C。反應30min后，通入冷卻水使 之冷卻，過濾、洗滌、干燥，制得硅膠-ΡΕ0材料。其中，本實施例中ΡΕ0為聚氧乙烯的簡稱。 [0028] 將1.17g CRL分散于50ml的0.1M、PH=7.0的PBS緩沖溶液中，然后加入0.5g上述制 備的硅膠-PEO載體材料充分分散，將硅膠-PEO載體與酶的混合物置于37 °C的搖床中，在 160rpm的搖速下反應3小時，過濾，并采用去離子水洗滌5次后，離心凍干干燥后即得固定化 酶，具體為硅膠-PE0載體固定CRL，將上述固定化酶保存在4°C環境下。其中，本實施例中的 CRL為皺褶假絲酵母脂肪酶的簡稱。
[0029] 實施例3 根據實施例1制備硅膠-PVP載體。
[0030] 將l.OgPPL分散于50ml的0.1M、PH=7.0的PBS緩沖溶液中，然后加入0.5g上述制備 的硅膠-PVP載體材料充分分散，將硅膠-PVP載體與酶的混合物置于37 °C的搖床中，在 160rpm的搖速下反應3小時，過濾，并采用去離子水洗滌5次后，離心凍干干燥后即得固定化 酶，具體為硅膠-PVP載體固定PPL，將上述固定化酶保存在4°C環境下。其中，本實施例中的 PPL為豬胰脂肪酶的簡稱。
[0031] 測定實施例1~3所得的固定化酶的催化活性、熱穩定性和重復使用率，同時測定相 對應的CRL和PPL的游離酶的催化活性、熱穩定性和重復使用率，具體如表1所示： 表1
從表1可見，在溫度為50°C，反應時間為240min時，將游離酶與其相對應的固定化酶比 較，固定化酶的活性得到明顯提升，且對應固定酶熱穩定性值均大于游離酶，這說明固定化 酶的熱穩定性得到了很大的提升。
[0032] 從圖2可見，隨著重復使用次數的增加，固定化酶的活性趨于穩定。
[0033]由圖3可知，從固定化酶硅膠-PVP0CRL固定酶的電鏡圖可以看出，CRL成功吸附在 載體材料表面。
[0034]本發明所提出的利用兩親性物質修飾硅膠表面，一方面通過硅膠表面的羥基物理 吸附酶;另一方面通過表面的兩親性物質靜電吸附酶;進一步，表面兩親性物質能與底物良 好接觸，從而為酶的催化提供了合適的反應界面環境。
[0035]以上所述本發明的【具體實施方式】，并不構成對本發明保護范圍的限定。任何根據 本發明的技術構思所做出的各種其他相應的改變與變形，均應包含在本發明權利要求的保 護范圍內。
【主權項】
1. 一種固定酶載體材料，其特征在于，包括硅膠材料和修飾形成于所述硅膠材料表面 的兩親性物質。2. 根據權利要求1所述的固定酶載體材料，其特征在于，所述兩親性物質為聚乙烯吡咯 烷酮、聚氧乙烯或聚乙烯醇。3. -種根據權利要求1所述的固定酶載體材料的制備方法，其特征在于，包括如下步 驟， a、 將硅膠粉末置于質量百分比為5%的甲基磺酸水溶液中，在102°C下攪拌4小時后過 濾，將過濾得到的固體通過去離子水進行多次清洗后真空干燥24小時，即得活化的硅膠； b、 在活化后的硅膠中加入乙醇水溶液和3-(甲基丙烯酸酰氧）丙基三甲氧基硅烷，并在 氮氣氣氛、50°C的條件下反應24小時后過濾，過濾后的固體顆粒通過乙醇清洗多次，真空干 燥即得表面活化的MPS-硅膠； c、 將步驟b所得的MPS-硅膠中加入可聚合溶劑水溶液，并在氮氣條件下充分反應，過 濾、干燥即得表面形成兩親性物質的固定酶載體材料。4. 根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述兩親性物質為PVP，所述可聚合溶 劑水溶液由N-乙烯基吡咯烷酮、過硫酸銨、三乙胺加入去離子水中形成。5. 根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述步驟C還包括在氮氣條件下攪拌1 小時后，升高溫度至70 °C繼續攪拌8小時，過濾、干燥即得硅膠表面接枝聚合有PVP的固定化 酶載體。6. 根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟C包括將MPS-硅膠分散于乙 二醇和氫氧化鈉的混合溶液中，在氮氣條件下升溫至120°C，滴加環氧乙烷反應30分鐘，冷 卻、過濾、洗滌、干燥即得硅膠表面聚合有PEO的固定化酶載體。7. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述兩親性物質為聚乙烯醇。8. 根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述可聚合溶劑水溶液中N-乙烯基吡 咯烷酮、過硫酸銨、三乙胺的質量百分比分別為15%、2%、3%。9. 根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟B中活化后的硅膠中加入的 乙醇水溶液中乙醇與水的體積比為6:1。
【文檔編號】C08G83/00GK105950603SQ201610322517
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月16日
【發明人】黃鳳洪, 時杰, 張珊, 鄭明明, 鄧乾春
【申請人】中國農業科學院油料作物研究所