一個水稻休眠性相關蛋白及其編碼基因與應用
【專利摘要】本發明公開了一個水稻休眠相關蛋白及其編碼的基因與應用。本發明提供的蛋白質，是如下(a)或(b)的蛋白質：(a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與水稻種子休眠性相關的由SEQ ID NO.1衍生的蛋白質。本發明的水稻種子休眠相關蛋白影響種子成熟后的休眠性。過表達該蛋白編碼基因的可導致轉基因植株種子休眠性增強，從而可以培育具有適度休眠性的轉基因植物，以降低不良環境對水稻產量的影響。所述蛋白及其編碼基因可以應用于植物遺傳改良。
【專利說明】
一個水稻休眠性相關蛋白及其編碼基因與應用
技術領域
[0001] 本發明屬于基因工程領域，涉及一個水稻休眠性相關蛋白及其編碼基因與應用。
【背景技術】
[0002] 種子休眠是普遍存在的，可以使物種逃避自然災害，減少種內個體間競爭及防止 種子在不合時宜的季節萌發，是物種在長期進化過程中獲得的一種對環境及季節性變化的 適應性，是高等植物受基因和環境因子共同影響的復雜性狀，具有普遍的生物學意義。水稻 種子休眠是由多基因控制的復雜性狀，也是水稻進化過程中重要的農藝性狀，在栽培過程 中種子休眠具有雙重性:一方面，要求播種后種子能發芽迅速、整齊;另一方面，需要種子具 有一定的休眠性，防止種子在收獲季節遇到不適宜的氣候而產生穗發芽，影響產量和品質。
[0003] 在種子成熟過程中，隨著種子儲藏物質的積累、脫水耐性的獲得及代謝活動的停 止，種子休眠得以形成。種子休眠的形成由很多調控因子共同調控，這些調控因子的作用方 式及調控水平是不一樣的。植物激素 ΑΒΑ和GA是種子休眠的主要調控因子，且它們的作用是 相互拮抗的。ΑΒΑ和GA的含量平衡及信號途徑的響應對于種子休眠的形成、維持具有重要的 調控作用。在植物種子中，ΑΒΑ參與休眠的形成與休眠的維持，GA等激素則參與種子休眠的 破除和促進種子發芽。種子休眠和萌發是典型的受多基因調控的數量性狀，非常容易受到 外界環境條件影響，而數量性狀位點(QTL)定位是研究復雜數量性狀的有效方法。對于水稻 休眠的研究，首先通過一個強休眠材料和一個弱休眠材料構建的分離群體，對群體內各單 株休眠性進行檢測，并結合分子標記分析對控制休眠性的位點進行初定位。然后選擇貢獻 率高的位點進行后續研究。主要通過與其中一個親本進行多代回交，獲得只含有目標位點 的近等基因系(NIL)，通過對NIL與背景親本回交獲得的F2分離群體進行重組體篩選，并對 重組體的后代進行表型驗證，結合重組體的基因型對QTL位點進行精細定位，從而獲得影響 休眠表型的相關基因。近年來，利用分子標記對不同的遺傳群體進行分析，已初步定位了 100多個與水稻休眠性相關的QTL，廣泛分布于12條染色體上。但由于種子休眠的復雜性及 易受外界環境影響，檢測到的QTL往往效應值不高或表達不穩定，給進一步的精細定位和圖 位克隆帶來困難，到目前為止，只有兩個QTL被克隆，但其對種子休眠的調控機理仍不清楚。 野生稻和雜草稻有極強的種子休眠性，往往被用于種子休眠的研究，但這種休眠性很難破 除，加之連鎖累贅現象的存在，使得這些QTL難于利用于生產實際。因此挖掘優良的休眠 QTL，并對相關基因進行研究，對水稻生產尤為重要。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一個水稻休眠相關的蛋白。
[0005] 本發明的另一目的是提供該蛋白的編碼基因與應用。
[0006] 與水稻種子休眠相關的蛋白qSdn-Ι，來源于稻屬水稻(Oryza sativa var.N22)， 具有如(a)或(b)所示的氨基酸殘基序列：
[0007] (a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；
[0008] (b)將SEQ ID NO. 1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失 和/或添加衍生得到的與水稻種子休眠相關的蛋白質。
[0009] 序列表中的序列1由966個氨基酸殘基組成，為磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶家族蛋 白。
[0010]為了使(a)中的qSdn-l便于純化，可在由SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列組成的蛋 白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。
[0011] 表1標簽的序列
[0013] 上述(b)中的qSdn-l可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。 上述(b)中的qSdn-l的編碼基因可通過將SEQ ID勵.2所示的0嫩序列中缺失一個或幾個氨 基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連 上表1所示的標簽的編碼序列得到。
[0014] 編碼上述與水稻種子休眠相關的蛋白的基因〇SqSdn-l(N22)也屬于本發明的保護 范圍。
[0015] 所述基因優選為如下1)或2)或3)所述的DNA分子：
[0016] 1)SEQ ID從).2所示的0嫩分子；
[0017] 2)SEQ ID NO .3所示的DNA分子；
[0018] 3)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；
[0019] 4)與1)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼植物休眠相關蛋白 的DNA分子。
[0020] 含有以上任一所述基因的重組表達載體也屬于本發明的保護范圍。
[0021 ]可用現有的植物表達載體構建含有所述基因的重組表達載體。
[0022] 所述植物表達載體可構建雙元農桿菌載體。所述植物表達載體還可包含外源基因 的3'端非翻譯區域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。 所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的3'端，如農桿菌冠癭瘤誘導(Ti)質粒 基因（如胭脂合成酶Nos基因）、植物基因（如大豆貯存蛋白基因）3'端轉錄的非翻譯區均具 有類似功能。
[0023] 使用所述基因構建重組植物表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種 增強型啟動子或組成型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動子、玉米的泛素啟動子 (Ubiquitin)，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結合使用;此外，使用本發明的基因 構建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄增強子，這些增強子區域可 以是ATG起始密碼子或鄰接區域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整 個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可 以是合成的。翻譯起始區域可以來自轉錄起始區域或結構基因。
[0024]為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行 加工，如加入可在植物中表達編碼可產生顏色變化的酶或發光化合物的基因（GUS基因、螢 光素酶基因等）、具有抗性的抗生素標記物(潮霉素標記物、卡那霉素標記物等)或是抗化學 試劑標記基因（如抗除莠劑基因）等。從轉基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記 基因，直接以逆境篩選轉化植株。
[0025] 所述重組表達載體可為在pCUbi 1390載體的EcoRI重組位點插入所述基因（qSdn- 1)得到的重組質粒。將含有qSdn-1的pCUbi 1390命名為pCUbi 1390-qSdn-l。
[0026] 含有以上任一所述基因（qSdn-1)的表達盒、轉基因細胞系及重組菌均屬于本發明 的保護范圍。
[0027] 擴增所述基因（qSdn-Ι)全長或任一片段的引物對也屬于本發明的保護范圍，所述 的引物對優選 Primer 1/Primer2、Primer3/Primer4 和 Primer5/Primer6〇
[0028] 一種水稻休眠性位點qSdn-1，其該位點定位于Indel標記F19和F18之間，29.8kb范 圍內；所述的Indel標記F19的上游引物如序列表中SEQ ID N0.36所示，下游引物如序列表 中SEQ ID N0.37所示；Indel標記F18的上游引物如序列表中SEQ ID N0.34所示，下游引物 如序列表中SEQ ID N0.35所示。
[0029] 在精細定位此基因過程中涉及到的定位引物（見表2)，除引物RM11669和RM11694 外，其余SSR引物和InDel引物為本實驗需要而自行設計的引物，這些自行設計的引物也屬 于本發明的保護范圍。
[0030] 有益效果：
[0031] 本發明的水稻休眠性相關蛋白影響水稻種子的休眠性。過表達該蛋白可導致種子 休眠性增強。所述蛋白及其編碼基因可以應用于植物遺傳改良，以獲得具有適度休眠性的 品種，保證惡劣條件下水稻產量和品質不受或少受影響。
【附圖說明】
[0032]圖1為N22和南粳35的表型分析。
[0033] a為N22和南粳35的株型圖；b為兩者的發芽率;c為兩者的灌漿速率;d為兩者的發 芽表型圖；e為兩者不同吸脹階段的胚變化情況。
[0034] 圖2為NIL構建過程。
[0035]圖3為NIL和南粳35的表型分析
[0036] a為NIL和南粳35的株型圖；b為兩者的抽穗期情況;c、d為兩者的發芽情況;e為兩 者不同吸脹階段的胚變化情況;f-Ι為兩者部分農藝性狀考察情況。
[0037]圖4為NIL、南粳35和它們的F1的表型分析。
[0038]圖5為qSdn-Ι的精細定位和交換單株驗證。
[0039] a為qSdn-Ι的精細定位;b為交換單株驗證
[0040] 圖6為過表達載體pCUbil390質粒圖譜。
[0041 ]圖7為轉基因植株進行PCR分子檢測結果。
[0042] 泳道1為未轉入0sqSdn_l(N22)的cDNA為模板擴增作為負對照，除了2、25、26、30 外，其余為轉化獲得的35株轉pCUbil390-qSdn-l(N22)陽性植株。
[0043]圖8為部分轉基因植株發芽情況。
[0044] 對照的發芽率約為99%，T〇-15的發芽率為71%，T〇-9的發芽率為64%。
【具體實施方式】
[0045] 以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。
[0046] 實施例1、水稻休眠性相關位點及其編碼基因的發現
[0047] -、水稻休眠性鑒定、近等基因系構建及遺傳分析
[0048] Ν22為具有極強休眠性的秈稻品種，南粳35為無休眠的粳稻品種。抽穗35天后分別 收取Ν22和南粳35種子，選取成熟飽滿籽粒進行休眠性檢測。每個重復50粒，共三個重復，盛 于鋪有兩層濾紙的l〇cm培養皿中，加入10ml水，30°C暗培養7天后記錄發芽情況。以根或芽 長度超過籽粒一半記為發芽。N22的發芽率為0%，南粳35的發芽率接近100%。利用體視顯 微鏡對吸脹時期的種胚進行觀察，南粳35的胚在吸脹36h后出現胚根和胚芽伸長的現象，而 N22的胚在吸脹48h后仍無明顯變化。但對兩者的吸脹速率進行檢測則未見明顯差異（見圖 1)。對N22與南粳35雜交獲得的分離群體進行休眠表型鑒定，并結合分子標記分析對影響種 子休眠性的位點進行分析后，選取貢獻率較高的qSdn-Ι進行分析。構建以南粳35為背景親 本，N22(qSdn-l)為插入片段的近等基因系(NIL)(見圖2)。對NIL和南粳35進行分析，NIL休 眠性強于南粳35外，在株高、抽穗期、灌漿速率、吸脹速率、分蘗數、結實率和千粒重等農藝 性狀上無明顯差異。對吸脹時期種胚進行觀察，NIL的種胚在吸脹60h后開始出現胚根和胚 芽的變化，且NIL的發芽率約為40% (見圖3)。對NIL與南粳35回交獲得的F1進行分析，其種 子休眠性接近NIL的種子休眠性，所以我們認為水稻種子休眠性是由顯性基因控制的（見圖 4)
[0049] 二、水稻休眠位點及其相關基因的獲得
[0050] 1、水稻休眠位點及其相關基因的精細定位
[00511用NIL與南粳35回交獲得的？2分離群體4826株，分單株取各株的葉片，分別提取 DNA，用初定位的SSR標記RM11669和RM11694進行交換單株篩選，同時對各個單株進行休眠 性檢測，選取極端表型的交換單株用于后續試驗。次年選取分離群體8248株，分單株去葉片 并提取DNA，用自行開發Indel標記Y25和Y37進行交換單株篩選，結合各單株的休眠表型，選 取極端交換單株用于后續試驗。通過這種方法，將水稻休眠性位點qSdn-Ι定位在自行開發 的Indel標記Y78和Y75之間。對這些篩選到的交換單株后代進行休眠性檢測，并結合該交換 單株的基因型，進一步精細定位。最終，將水稻休眠性位點 -qSdn-l定位于Indel標記F19和 F18之間，29.8kb范圍內（見圖5)。
[0052]上述交換單株后代驗證方法如下：
[0053] (1)每個用于分析的交換單株進行種植，每個種植40株
[0054] (2)對交換單株產生的后代，分單株考察各單株的休眠性
[0055] (3)統計每個交換單株的所有后代的表型分布，及無休眠記為H，強休眠記為L，后 代表型出現分離記為S。
[0056] 上述SSR標記分析的方法如下所述：
[0057] (1)提取上述選取單株的總DNA作為模板，具體方法如下：
[0058] ①取0.2克左右的水稻幼嫩葉片，置于2.0ml Eppendorf管中，管中放置一粒鋼珠， 把裝好樣品的Eppendorf管在液氮中冷凍5min，置于2000型GEN0/GRINDER儀器上粉碎樣品 lmin〇
[0059] ②加入660μ1 提取液（含 100mM Tris-Hcl(PH 8.0)，20mM EDTA(PH 8·0)，1·4Μ NaCl，0.2g/ml CTAB的溶液），漩渦器上劇烈渦旋混勻，冰浴30min。
[0060] ③加入40μ1 20%SDS，65°C溫浴lOmin，每隔兩分鐘輕輕上下顛倒混勻。
[0061] ④加入100μ1 5M NaCl，溫和混勻。
[0062] ⑤加入100μ1 10XCTAB，65°C溫浴10min，間斷輕輕上下顛倒混勻。
[0063] ⑥加入900μ1氯仿，充分混勾，12000rpm離心3min。
[0064] ⑦轉移上清液至1 · 5mL Eppendorf管中，加入600μ1異丙醇，混勾，12000rpm離心 5min〇
[0065] ⑧棄上清液，沉淀用70% (體積百分含量)乙醇漂洗一次，室溫涼干。
[0066] ⑨加入100μ1 1 XTE(121克Tris溶于1升水中，用鹽酸調PH值至8.0得到的溶液)溶 解 DNA。
[0067] ⑩取2μ1電泳檢測DNA質量，并用DU800分光光度儀測定濃度(Beckman Instrument Inc.U.S.A)〇
[0068] (2)將上述提取的DNA稀釋成約20ngAU，作為模板進行PCR擴增；
[0069] PCR反應體系（10μ1): DNA(20ng/ul) lul，上游引物（2pmol/ul) lul，下游引物 (2pmol/ul)lul,lOxBuffer(MgCl2free)lul,dNTP(10mM)0.2ul ,MgCl2(25mM)0.6ul,rTaq (5u/ul)0.1ul，ddH2〇 5.1ul，共10ul。
[0070] PCR 反應程序：94.0°(：變性5111丨11;94.0°(：變性3〇8、55°(：退火3〇8、72°(：延伸1111丨11，共 循環35次;72°C延伸7min;10°C保存。PCR反應在MJ Research PTC-225熱循環儀中進行。
[0071] 上述引物開發過程如下：
[0072] (l)SSR標記開發
[0073]將公共圖譜的SSR標記與水稻基因組序列進行整合，下載突變位點附近的BAC/PAC 克隆序列。用SSRHunter(李強等，遺傳，2005，27(5): 808-810)或SSRIT軟件搜索克隆中潛在 的SSR序列（重復次數多6);將這些SSR及其鄰近400~500bp的序列在NCBI通過BLAST程序在 線與相應的秈稻序列進行比較，如果兩者的SSR重復次數有差異，初步推斷該SSR引物的PCR 產物在秈、粳間存在多態性;再利用Primer Premier 5·0軟件設計SSR引物，并由上海英俊 生物技術有限公司合成。將自行設計的SSR成對引物等比例混合，檢測其在N22和南粳35之 間的多態性，表現多態者用作精細定位qSdn-Ι的分子標記。用于精細定位的分子標記見表 2〇
[0074] SSR標記的PCR產物檢測：
[0075]擴增產物用8%非變性聚丙稀酰胺凝膠電泳分析。以50bp的DNA Ladder為對照比 較擴增產物的分子量大小，銀染顯色。
[0076] (2)InDel 標記開發
[0077] InDel引物設計:對N22和南粳35在qSdn-Ι所在位置附近的部分區段進行測序，并 進行比對，發現兩者之間存在的SNPs，以這些SNPs為基礎用軟件設計InDel標記，同時運用 Primer Premier 5.0軟件設計對應的另一條引物，見表2。
[0078] InDel標記分析的PCR反應體系：DNA(20ng/ul )2ul，Primerl (10pmol/ul )2ul， Primer2(lOpmol/ul)2ul,lOxBuffer(MgCl2free)2ul,dNTP(10mM)0.4ul,MgCl2( 25mM) 1 · 2ul，rTaq(5u/ul)0 · 4ul，ddH2〇 lOul，總體積20ul。
[0079] 擴增反應在PTC-200(MJ Research Inc. )PCR儀上進行：94°C3min;94°C30sec，55 °C (引物不同，有所調整)4586(3,721€2.511^11，35個循環;721€511^11。
[0080] PCR產物純化回收，按試劑盒(北京Tiangen公司）步驟進行。PCR產物酶切消化過夜 后，用1-4%的瓊脂糖凝膠中電泳分離，經EB染色后于紫外燈下觀察拍照。dCAPS用8%的非 變性PAGE膠分離，銀染。
[0081 ]表2用于精細定位的分子標記
[0084] (3)突變基因的獲得
[0085] 根據定位的位點設計引物，序列如下所述：
[0086] primerl ：
[0087] 5'一AGAAGGGGGAAAAGGA-3'（SEQ ID N0.4)
[0088] primer2：
[0089] 5'一CTTAGCATCCCCTTATTTAC-3'（SEQ ID N0.5)
[0090] 以primerl和primer2為引物，分別以N22和南粳35的cDNA為模板，進行PCR擴增獲 得目的基因。該對引物位于SEQ ID如.3上游4仙?和下游10仙？，擴增產物包含了該基因的 全部編碼區
[0091]擴增反應用K0D酶擴增（購自Τ0Υ0Β0公司），在PTC-200(MJ Research Inc.)PCR儀 上進行：941€2111丨11;98°(：1086。，601€3086。，68°(：10111丨11，35個循環 ；681€20111丨11。將？〇?產物回 收純化后連接到載體pMbl8T載體上(購自TAKARA公司），轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞(購 自Tiangen公司），挑選陽性克隆，進行測序。
[0092]序列測定結果表明，PCR反應獲得的片段包含SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列，編 碼966個氨基酸殘基組成的蛋白質（見SEQ ID N0.1)。將SEQ ID NO. 1所示的蛋白命名為 0sqSdn_l(N22)，將編碼SEQ ID N0.1所示的蛋白的基因命名為0sqSdn_l(N22)。
[0093]實施例2、轉基因植物的獲得和鑒定 [0094] 一、重組表達載體構建
[0095] 以N22的cDNA為模板，進行PCR擴增獲得0sqSdn_l(N22)基因，PCR引物序列如下： [0096] Primer3(下劃線所示的序列為EcoRI重組位點）：
[0097] 5'一CCATGATTACGAATTCATGGCGCGCAATGCGGCGGAC-3'（SEQ ID NO.6)
[0098] Primer4(下劃線所示的序列為EcoRI重組位點）：
[0099] 5'-TACCGAGCTCGAATTCCCCAGTGTTCTGCATACCAGCAG-3'(SEQ ID NO.7)
[0100] 上述引物位于SEQ ID NO. 2所示基因的編碼區起始的21bp和編碼區終止子前 23bp，擴增產物包含了該基因的完整編碼區，將PCR產物回收純化。采用In-Fusion?HD Cloning Kit重組試劑盒(Takara公司）將PCR產物克隆到載體pCUbi 1390(圖6)中。
[0101] In-Fusion 重組反應體系（10yL):PCR 產物 10-200ng，經 EcoRI 酶切回收 pCUbi 1390 載體50_200ng，5 X In-Fusion HD Enzyme Premix 2yL，Deionized water to 10yL。槍頭吹 打混勻后將混合體系50°C反應15min后置于冰上，取2yL反應體系用熱激法轉化大腸桿菌 DH5a感受態細胞(Tiangen公司）。將全部轉化細胞均勻涂布在含100mg/L卡那霉素的LB固體 培養基上。37°C培養12-16h，挑取克隆陽性克隆，進行測序。測序結果表明，得到了含有SEQ 1〇勵.3所示〇895(111-1022)基因的重組表達載體，將含有〇895(111-1022)的口〇]1^139〇命 名為 pCUbi 1390-qSdn-l(N22)。
[0102] 二、重組農桿菌的獲得
[0103] 用電擊法將pCUbi 1390-qSdn_l(N22)轉化農桿菌EHA105菌株(購自美國英俊公 司），得到重組菌株，提取質粒進行PCR及酶切鑒定。將PCR及酶切鑒定正確的重組菌株命名 為EH-pCUbi 1390-qSdn-l(N22)。
[0104]三、轉基因植物的獲得
[0105] 將EH-pCUbi 1390-qSdn_l(N22)轉化水稻南粳35,具體方法為：
[0106] (1)28°C 培養 EH-pCUbi 1390-qSdn-l(N22) 16 小時，收集菌體，并稀釋到含有 100μ mo 1 /L的Ν6液體培養基(S i gma公司，Cl 416)中至濃度為0D6QQ~0.5，獲得菌液；
[0107] (2)將培養至一個月的南粳35水稻成熟胚胚性愈傷組織與步驟（1)的菌液混合侵 染30min，濾紙吸干菌液后轉入共培養培養基(N6固體共培養培養基，Sigma公司）中，24°C共 培養3天；
[0108] (3)將步驟（2)的愈傷接種在含有100mg/L潮霉素 （Phyto Technology Laboratories公司）的N6固體篩選培養基上第一次篩選(16天）；
[0109] (4)挑取健康愈傷轉入含有lOOmg/L潮霉素的N6固體篩選培養基上第二次篩選，每 15天繼代一次；
[0110] (5)挑取健康愈傷轉入含有50mg/L潮霉素的N6固體篩選培養基上第三次篩選，每 15天繼代一次；
[0111] (6)挑取抗性愈傷轉入分化培養基上分化；
[0112] 得到分化成苗的To代陽性植株。以轉pCUbi 1390空載體的南粳35為陰性對照。
[0113] 四、轉基因植株的鑒定
[0114] 1、PCR分子鑒定
[0115] 將步驟三獲得的T 〇代陽性植株提取基因組DNA，以基因組DNA為模板，利用 pCUbil390上SEQIDN0.3插入位點左邊界附近的引物Primer5和SEQIDN0.3上的引物 Primer6作為引物對進行擴增（Primer5:5 ' -TTTGTCGGGTCATCTTTTC-3 '（ SEQ ID N0 · 8)和 Primer6:5 ' -TCAGCCAAGTTTGCCAG-3 '（ SEQ ID NO · 9))，擴增長度 1018bp。JCR反應體系：DNA (20ng/ul)2ul,Primer5(lOpmol/ul)2ul,Primer6(lOpmol/ul)2ul,10xBuffer(MgCl2free) 2ul，dNTP( 10mM)0 ·4ul，MgCl2(25mM) 1 · 2ul，rTaq(5u/ul)0 · 4ul，ddH20 lOul，總體積20ul。擴 增反應在PTC-200(MJ Research Inc · )PCR儀上進行：94°C3min; 94°C30sec，55°C45sec，72 °(：111^11，35個循環;721€511^11。
[0116] 用試劑盒(北京Tiangen公司）純化回收PCR產物。PCR產物用1%的瓊脂糖電泳檢 測。結果表明獲得35株PCR檢測陽性的植株。見圖7，圖7中泳道1為以南粳35DNA為模板擴增 作為陰性對照，除了2、25、26和30外，其余為轉化獲得的35株轉pCUbi 1390-qSdn-l(N22)植 株。
[0117] 2、表型鑒定
[0118] 分別將Το代轉Hl-pCUbi 1390-qSdn-l(N22)植株、南粳35和N22種植在南京農業大 學水稻試驗站，對抽穗35天的轉基因植株進行收種，進行休眠表型的鑒定。轉空載的南粳35 轉基因植株發芽率約為99%，轉入轉EH-pCUbi 1390-qSdn-l(N22)的轉基因植株發芽率出 現分離，其中To-15的發芽率約為71%，T〇-9的發芽率約為64%。說明0sqSdn-l(N22)確實可 以影響種子的休眠性(見圖8)。
【主權項】
1. 一種與水稻種子休眠相關的蛋白，其特征在于:選自（a)或(b)所示的蛋白： (a) 由SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列組成的蛋白質； (b) 將SEQ ID NO. 1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或 添加衍生得到的與水稻種子休眠相關的蛋白質。2. 編碼權利要求1所述蛋白的基因。3. 根據權利要求2所述的基因，其特征在于:所述基因是如下1)或2)或3)或4)的DNA分 子： 1. SEQ ID NO.2所示的DNA分子； 2. SEQ ID NO.3所示的DNA分子； 3) 在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼權利要求1所述蛋白的DNA分子； 4) 與1)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼水稻種子休眠性蛋白的 DNA分子。4. 含有權利要求2或3所述基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。5. 根據權利要求4所述的重組表達載體，其特征在于：所述重組表達載體是在pCUbi 1390載體的EcoRI重組位點之間插入權利要求2或3所述基因得到的重組質粒。6. 擴增權利要求2或3所述基因的全長或其任意片段的引物對，優選Primer 1/Primer2、 Primer3/Pr imer4或Primer5/Pr imer6 ;其中，Pr imer 1 如序列表中 SEQ ID NO · 4所不， Primer2如序列表中SEQ ID N0.5所不，Primer3如序列表中SEQ ID N0.6所不，Primer4如序 列表中SEQIDN0.7所示，Primer5如序列表中SEQIDN0.8所示，Primer6如序列表中SEQ ID NO .9所示。7. 權利要求1所述的蛋白，權利要求2或3所述基因，權利要求4所述重組表達載體、表達 盒、轉基因細胞系或重組菌中的至少一種在植物育種中的應用。8. -種培育水稻種子適度休眠性的方法，是將權利要求2或3所述基因導入無休眠水稻 品種中，得到休眠性增強的轉基因水稻;所述無休眠水稻品種為發芽率接近100%的水稻品 種;所述休眠性增強的轉基因水稻為發芽率低于80%的轉基因水稻。9. 根據權利要求8所述的方法，其特征在于:權利要求2或3所述基因通過權利要求4或5 所述重組表達載體導入無休眠水稻中。10. -種培育種子休眠性增強的轉基因植物的方法，是過表達目的植物中權利要求2或 3所述基因的表達，得到休眠性增強的轉基因植物;所述目的植物為攜帶權利要求2或3所述 基因的植物。11. 一種水稻休眠性基因 qSdn-Ι，其特征在于定位于Indel標記F19和F18之間，29.8kb 范圍內；所述的Indel標記F19的上游引物如序列表中SEQ ID NO.36所示，下游引物如序列 表中SEQ ID NO.37所示；Indel標記F18的上游引物如序列表中SEQ ID NO.34所示，下游引 物如序列表中SEQ ID NO.35所示。12. 權利要求11中所述的水稻休眠性基因 qSdn-Ι的定位引物，其特征在于選自表2所示 的除RMl 1669和RMl 1694之外的所有引物均為自行設計。
【文檔編號】A01H5/00GK105950598SQ201610567000
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年7月19日
【發明人】萬建民, 江玲, 楊春艷, 吳濤, 朱星潔, 王茜, 劉世家, 劉喜, 陳亮明, 田云錄, 趙志剛
【申請人】南京農業大學