一種高效分離小鼠動脈血管平滑肌的組合酶及方法
【專利摘要】本發明公開了一種高效分離小鼠動脈血管平滑肌的組合酶及方法。組合酶由羅氏膠原混合酶和彈性蛋白酶組成，其混合比例為羅氏膠原混合酶0.5～0.7U、彈性蛋白酶 40～70μg。本發明的組合酶，可以快速地將血管組織分離為較多的單細胞及疏松的小組織塊，處理得到的細胞具有很高的活力，常規條件下培養2～3天幾乎所有細胞和疏松的小組織塊都牢固貼壁生長，開始呈現放射狀生長和增殖，5天后細胞呈現典型峰谷樣生長模式，可進行傳代操作。
【專利說明】
一種高效分離小鼠動脈血管平滑肌的組合酶及方法
技術領域
[0001]本發明涉及一種組合酶，特別涉及一種高效分離小鼠動脈血管平滑肌的組合酶，以及使用該組合酶高效分離小鼠動脈血管平滑肌的方法。
【背景技術】
[0002]高血壓、冠心病是目前世界范圍內發病率高、致死致殘率高的心血管疾病。其病理特點主要表現為大動脈及外周小動脈血管中層平滑肌增生，管腔狹窄，或同時伴隨脂質沉積和粥樣斑塊，增加血流阻力，最終可出現不可逆的進行性血壓升高、腦卒中、心梗等嚴重并發癥。
[0003]血管平滑肌不僅是血管壁中層的主要細胞結構，維持和形成血管壁張力。此外，血管平滑肌還主動參與動脈粥樣硬化及高血壓進程并表現出多種不同功能的表型(如合成型和收縮型)和分泌炎癥性細胞因子。因此，對于血管平滑肌功能及其相關分子機制的研究顯的尤為重要。
[0004]目前有大量文獻報道多種分離和培養大鼠大/小動脈血管平滑肌的方法如組織塊貼壁法14和膠原酶法及胰消化法酶等6—1(3對大鼠主動脈血管平滑肌的分離效果都較好，細胞傳代增殖力較高。
[0005]但隨著研究深入的需要，更多相關分子機制研究需要在轉基因小鼠來源的組織細胞上進行，如何快速分離和培養高活性小鼠的大/小動脈血管平滑肌一直有爭議。文獻報道的針對小鼠的血管平滑肌分離培養方法主要沿用大鼠血管平滑肌分離方法:I)組織塊貼壁法n，12;無菌條件下取出胸主動脈，用鑷子輕輕刮除血管內膜，并分離血管中膜(血管平滑肌層)，用眼科剪將中膜剪成I X Imm3組織塊，小心將組織塊用吸管置于培養瓶底部均勻分布，倒置培養瓶并放入培養液，培養箱中靜置40min左右，待組織塊貼壁牢固后，小心翻轉培養瓶，靜置培養5天，觀察是否有血管平滑肌從組織塊中爬出。該方法缺點在于不是所有組織塊都能貼壁成功和有細胞爬出，細胞爬出至貼壁所需時間長，且操作過程技術要求較高。細胞生長緩慢，數量少，不能很快的進入對數增長階段從而影響實驗進程;2)膠原酶消化法:文獻報道的小鼠分離采用的膠原酶濃度不一，大部分采用膠原酶I13或胰酶12用于去除血管壁內皮等其他細胞，再進行組織塊貼壁法操作，但我們實際操作發現分離的原代細胞活性差，貼壁慢。因此，非常迫切需要進一步找到能快速分離和穩定傳代的小鼠動脈血管平滑肌分禺培養方法。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在于提供一種高效分離小鼠動脈血管平滑肌的組合酶及方法。
[0007]本發明所采取的技術方案是:
一種高效分離小鼠動脈血管平滑肌的組合酶，組合酶由羅氏膠原混合酶和彈性蛋白酶組成，其混合比例為羅氏膠原混合酶0.5?0.7U、彈性蛋白酶40?70yg。
[0008]羅氏膠原混合酶型號為Liberase TM Research，貨號為05401119001。[0009 ]彈性蛋白酶為S i gma公司的豬彈性蛋白酶。
[0010]組合酶由羅氏膠原混合酶為Liberase TM Research和Sigma豬彈性蛋白酶按
0.6U: 50yg的比例混合而成。
[0011 ] 一種高效分離小鼠動脈血管平滑肌的方法，包括如下步驟:
1)將分離得到的小鼠動脈血管中膜剪成小塊，置于組合酶液中消化；
2)消化結束后，將酶液離心，棄上清，得到小鼠動脈血管平滑肌細胞；
其中，組合酶如上所述。
[0012]組合酶液中，羅氏膠原混合酶為Liberase TM Research的濃度為0.6 U/ml，Sigma豬彈性蛋白酶的濃度為50yg/ml。
[0013]本發明的有益效果是:
本發明的組合酶，可以快速地將血管組織分離為較多的單細胞及疏松的小組織塊，處理得到的細胞具有很高的活力，常規條件下培養2?3天幾乎所有細胞和疏松的小組織塊都牢固貼壁生長，開始呈現放射狀生長和增殖，5天后細胞呈現典型峰谷樣生長模式，可進行傳代操作。
[0014]本發明的組合酶無論對于小鼠胸主動脈還是腸系膜等不同部位血管平滑肌分離效果都非常好。操作方法簡單，不需要再翻轉瓶，組織塊貼壁，對操作人員技術要求不高，且細胞貼壁快，增殖力強。
【附圖說明】
[0015]圖1是分離得到的平滑肌細胞培養5d后的顯微照片；
圖2和圖3分別是平滑肌細胞傳代培養至第二代和第4代的顯微照片；
圖4和圖5:傳統膠原酶和胰酶組合后接種培養結果。
【具體實施方式】
[0016]—種高效分離小鼠動脈血管平滑肌的組合酶，組合酶由羅氏膠原混合酶和彈性蛋白酶組成，其混合比例為羅氏膠原混合酶0.5?0.7U、彈性蛋白酶40?70yg。
[0017]羅氏膠原混合酶型號為Liberase TM Research，貨號為05401119001。
[0018]彈性蛋白酶為Sigma公司的豬彈性蛋白酶。
[0019]組合酶由羅氏膠原混合酶為Liberase TM Research和Sigma豬彈性蛋白酶按
0.6U: 50yg的比例混合而成。
[0020]—種高效分離小鼠動脈血管平滑肌的方法，包括如下步驟:
1)將分離得到的小鼠動脈血管中膜剪成小塊，置于組合酶液中消化；
2)消化結束后，將酶液離心，棄上清，得到小鼠動脈血管平滑肌細胞；
其中，組合酶如上所述。
[0021 ] 組合酶液中，羅氏膠原混合酶為Liberase TM Research的濃度為0.6 U/ml，Sigma豬彈性蛋白酶的濃度為50yg/ml。
[0022]下面結合實驗，進一步說明本發明的技術方案。
[0023]以下實施例使用的羅氏膠原混合酶的貨號為05401119001。
[0024]實施例1: 1)配制混合酶:取羅氏的膠原混合酶(LiberaseTM Research，0.6unit)+豬彈性蛋白酶(Sigma，50ug)加入到Iml的PBS中，混勾后置于冰上備用；
2)取6-8周齡小鼠2只，脫臼法處死后，快速浸沒入70%乙醇溶液約2min中；
3)取出小鼠后，置于超凈臺的手術操作臺上，用滅菌眼科剪小心打開胸腔，分離胸主動脈，置于冰預冷的PBS中；
4)在體式顯微鏡下，用顯微鑷去除動脈周圍脂肪組織，體式顯微鏡下快速分離血管中膜，PBS沖洗兩次后，轉入EP管內，加入配制好的混合消化酶500ul，用顯微剪剪碎動脈中層成約I X Imm3組織塊，放入37°C孵箱中消化45min，期間每隔10-15分鐘取出振搖10s_20s ；
5)消化結束后，4°C1400rpm離心10分鐘。棄上清，用含20%胎牛血清的DMEM/F12培養基輕輕吹打混勻成細胞懸液及疏松的組織小塊。
[0025]6)將消化得到的細胞懸液及疏松的組織小塊接種于35mm培養皿中，約2天后可見細胞貼壁生長，疏松組織塊周圍大量血管平滑肌呈放射狀生長;4天后可出現典型的峰谷樣生長表現，5-6天后即可以傳代，2-8代細胞可滿足隨后的大量細胞實驗需求。
[0026]接種培養5d后的細胞如圖1所示，第二代和第四代細胞分別如圖2和3所示。
[0027]從圖中可以看出，圖1(接種第五天)即可見到消化的單細胞及微小組織塊貼壁，且組織塊周圍有大量平滑肌爬出呈放射狀生長，說明此混合酶作用溫和，對細胞/組織塊的生長沒有影響，細胞已經開始增殖；圖2(傳代后第二天)代表接種第6天即傳代后第二天原代細胞經常規胰酶消化后24小時內即可貼壁生長，增殖力良好；圖3代表第四次傳代后原代細胞仍然保持長梭形的細胞形態，且呈現峰谷樣生長方式，提示本發明的混合酶消化后，原代細胞增殖及傳代不受影響且生長旺盛。
[0028]對比例:
為了進一步比較傳統的膠原酶混合胰酶消化法與本申請所采用的新型膠原酶和豬彈力蛋白酶消化法分離腸系膜血管平滑肌及原代培養的效果，我們采用既往文獻報道的方法:利用膠原酶/分散劑(2g/L)組合胰酶(25ug/ml)，采用上述同樣的操作方法進行同基因型小鼠腸系膜平滑肌細胞原代培養。
[0029]結果如圖3和圖4顯示，消化接種5d后，顯微鏡下可見散在零星分布的貼壁血管平滑肌細胞，鏡下同樣可見散在多數未貼壁的細胞呈圓形具有較高折光性。
[0030]本申請采用的新型組合酶消化靜置貼壁3天后，視野內即可見大量貼壁及增殖的平滑肌細胞圍繞在組織塊周圍，且開始呈現峰谷樣生長趨勢。與對比例的組合酶消化和培養的結果對比，本發明新型的組合酶消化效果好，細胞活力強，易貼壁，且接種5天后即可傳代消化生長。而傳統組合酶消化雖然可以得到單個分離的原代平滑肌細胞，但接種5天后才有散在少量細胞貼壁，其余消化的細胞不貼壁。說明傳統組合酶對血管平滑肌消化時有較大的損傷效果，分離的細胞活力差，貼壁慢，且大量細胞尚未貼壁。因此，對比結果顯示新型組合酶對小鼠腸系膜血管平滑肌具有很好的分離及保護細胞活力的作用，非常適合小鼠原代血管平滑肌培養及傳代。
[0031]參考文獻:
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【主權項】
1.一種高效分離小鼠動脈血管平滑肌的組合酶，其特征在于:組合酶由羅氏膠原混合酶和彈性蛋白酶組成，其混合比例為羅氏膠原混合酶0.5?0.7U、彈性蛋白酶40?70yg。2.根據權利要求1所述的高效分離小鼠動脈血管平滑肌的組合酶，其特征在于:羅氏膠原混合酶型號為Liberase TM Research，貨號為05401119001。3.根據權利要求1所述的組合酶，其特征在于:彈性蛋白酶為Sigma公司的豬彈性蛋白酶。4.根據權利要求1所述的組合酶，其特征在于:組合酶由羅氏膠原混合酶為LiberaseTM Research和Sigma豬彈性蛋白酶按0.6U: 50yg的比例混合而成。5.—種高效分離小鼠動脈血管平滑肌的方法，包括如下步驟: I)將分離得到的小鼠動脈血管中膜剪成小塊，置于組合酶液中消化； 2 )消化結束后，將酶液離心，棄上清，得到小鼠動脈血管平滑肌細胞； 3)其中，組合酶如權利要求1?4任意一項所述。6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于:組合酶液中，羅氏膠原混合酶為LiberaseTM Research的濃度為0.6 U/ml，Sigma豬彈性蛋白酶的濃度為50yg/ml。
【文檔編號】C12N9/64GK105950594SQ201610404507
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月8日
【發明人】鄭凌云, 王麗京, 李香莉
【申請人】廣東藥學院