一種引入二硫鍵的ω-轉氨酶突變體及其應用
【專利摘要】本發明提供了一種引入二硫鍵的ω?轉氨酶突變體及其應用，所述ω?轉氨酶突變體氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發明ω?轉氨酶突變體由土曲霉(Aspergillus terreus)ω?轉氨酶131位的精氨酸和134位的天冬氨酸分別突變為半胱氨酸獲得，該ω?轉氨酶突變體的半失活溫度比野生型提高了1.6℃；在40℃下的半衰期為10.4min，比野生型延長了3.5min，較野生型提高了50.7％，熱穩定性大大提高。
【專利說明】
一種引入二硫鍵的ω-轉氨酶突變體及其應用
技術領域
[0001] 本發明涉及生物技術領域，特別是涉及一種引入二硫鍵的ω-轉氨酶突變體及其 應用。
【背景技術】
[0002] 轉氨酶能催化氨基由氨基供體向氨基受體的轉移反應，具有較高區域選擇性和立 體選擇性。轉氨酶既可以通過動力學拆分消旋胺，也能通過酮的不對稱合成生成手性胺，比 傳統化學催化方法更具有吸引力和競爭力，已成為工業上用于生產氨基酸、手性胺、氨基醇 和氨基糖等重要農藥或醫藥中間體的常用酶之一。根據PFAM數據庫中的多序列比對，轉氨 酶可以被分為5類:天冬氨酸轉氨酶、芳香族轉氨酶、ω -轉氨酶、支鏈轉氨酶和D-轉氨酶。由 于ω-轉氨酶（ω -transaminase，簡稱ω -ATs)的底物結合口袋大于天冬氨酸轉氨酶、芳香 族轉氨酶，并可以催化一些特定的底物，因此具有更好的工業應用價值。來自于土曲霉 (Aspergillusterreus)的ω -轉氨酶能催化(R)-( + )-a-甲基節胺生成苯乙酮，手性選擇性 為(R)型。ω-轉氨酶的催化過程如下所示：
[0003]
[0004]實驗表明，該酶野生型在40°C下的半衰期僅為6.9min，其熱穩定性有待進一步提 尚。
[0005] 授權公告號為CN103820404B的中國發明專利公開了一種酶活與熱穩定性同時提 高的脂肪氧合酶突變體及制備方法，利用定向進化技術對魚腥藻脂肪氧合酶分子進行定向 改造，經多輪易錯PCR和DNA Shuffling，獲得了酶活與熱穩定性同時提高的脂肪氧合酶突 變體，酶活力為21420U/mL，比野生型提高了 2.17倍，其在50°C的半衰期t1/2提高了 1.9倍。
[0006] 授權公告號為CN102660515B的中國發明專利公開了一種酶活性提高的谷氨酰胺 轉氨酶(microbial transglutaminase，MTG)。該發明以MTG在大腸桿菌中的高效表達為改 造平臺，對MTG成熟酶N端氨基酸進行缺失和飽和突變，得到了酶學性質較好的突變株，比酶 活提高1.85倍，熱穩定性提高2.7倍。
[0007] 授權公告號為CN102876650B的中國發明專利公開了一種具有高比活和高熱穩定 性普魯蘭酶突變體及其制備方法，屬于基因工程和酶工程領域。該發明通過定點突變提高 了普魯蘭酶比活力和熱穩定性，提供了能夠使來源于脫支芽孢桿菌的普魯蘭酶催化比活力 及熱穩定性都得到提高的突變方案。所述普魯蘭酶突變體，至少以下性質之一發生改變:1) 最適反應溫度提高;2)在pH4.0-5.0熱穩定性提高;3)在pH4.0-5.0比活力提高。
[0008] 二硫鍵(Disulfide bond)是2個疏基被氧化所形成的-S-S-形式的硫原子間的共 價鍵。在蛋白質中，兩個半胱氨酸形成二硫鍵，能夠固定蛋白質的三級結構，降低蛋白質解 折疊熵，提高蛋白質的穩定性。根據蛋白質的空間結構，結合二硫鍵形成所需的鍵長、鍵角 信息，通過計算生物學的方法，可以較準確的預測蛋白質中可能形成二硫鍵的位點。溫度因 子(B-f actor)是晶體學中的一個重要參數，反映的是晶體中的各原子受熱運動的影響程 度，如果某一氨基酸殘基的B-factor值越高，則表明該氨基酸殘基所在部位的結構就越不 穩定。通過在蛋白質的不穩定性區域引入額外的二硫鍵更易于提高蛋白質的穩定性。
【發明內容】
[0009]本發明通過在野生型ω-轉氨酶中引入一對額外的二硫鍵，獲得了一個具有更好 熱穩定性的ω -轉氨酶突變體。
[00?0]本發明首先根據ω-轉氨酶(來自土曲霉(Aspergillus terreus))的三維結構模 型并分析蛋白質結構中B-factor數據，結合鍵長、鍵角、能量等生物信息學特征，使用生物 信息學計算軟件 Di sulfide by Design(DbD，http: //cptweb · cpt .wayne · edu/DbD2)以及 Disulfide Bonds in Proteins(MODIP,http://caps.nebs.res.in/dsdbase/modip.html) 對該酶進行引入二硫鍵的理性設計，選出二硫鍵潛在的引入位點；然后結合相應位點B-factor值，選擇該蛋白的不穩定區域引入二硫鍵，設計定點突變引物，以ω -轉氨酶基因為 模板，進行定點突變，PCR擴增、純化后，篩選得到含有一個半胱氨酸的突變體，再以該突變 體為模板，進行定點突變得到同時含有兩個半胱氨酸的突變體，轉化至宿主細胞，獲得定點 突變文庫;最后從所述定點突變文庫中篩選效果較好的ω -轉氨酶突變體。
[0011]以上述方法篩選獲得了一種熱穩定性較高的ω-轉氨酶突變體，由土曲霉 (Aspergillus terreus) ω -轉氨酶131位的精氨酸和134位的天冬氨酸分別突變為半胱氨 酸獲得。兩個突變的半胱氨酸能夠在成熟的ω -轉氨酶突變體蛋白中形成二硫鍵。
[0012]所述的ω-轉氨酶突變體氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0013]本發明又提供了編碼所述ω -轉氨酶突變體的基因。
[0014] 所述的基因，核苷酸序列如SEQ ID Ν0.2所示。原編碼精氨酸的密碼子CGT突變為 編碼半胱氨酸的TGC，原編碼天冬氨酸的密碼子GAT突變為編碼半胱氨酸的TGC。
[0015] 本發明還提供了包含所述基因的表達盒。
[0016] 本發明還提供了包含所述基因的重組載體。重組載體的啟動子可以為常用的T7啟 動子、Lac啟動子或araBAD啟動子。重組載體所選用的原始載體可以是常用的用于蛋白表達 的載體，比如pET28a。
[0017] 本發明還提供了包含所述基因的基因工程菌。
[0018] 本發明還提供了包含所述重組載體的基因工程菌。
[0019] 可以將目的基因片段整合到基因工程菌的基因組上以獲得穩定表達所述ω-轉氨 酶突變體蛋白的重組基因工程菌，也可以是通過質粒的形式存在。可以選擇常用的用于蛋 白表達的基因工程菌，優選為E. co 1 i BL21 (DE3)。
[0020] 本發明還提供了所述ω-轉氨酶突變體在催化(R)-( + )-a-甲基芐胺生成苯乙酮中 的應用。手性選擇性為(R)型。
[0021 ] 本發明ω -轉氨酶突變體由土曲霉(Aspergillus terreus) ω -轉氨酶131位的精 氨酸和134位的天冬氨酸分別突變為半胱氨酸獲得，該ω -轉氨酶突變體的半失活溫度比野 生型提高了 1.6°C;在40°C下的半衰期為10.4min，比野生型延長了 3.5min，較野生型提高了 50.7%，熱穩定性大大提高。
【附圖說明】
[0022]圖1為ω-轉氨酶引入二硫鍵后的局部三維結構示意圖；
[0023]圖2為質粒pET28a( + )-co-AT的基因圖譜示意圖；
[0024]圖3為酶活檢測結果圖；
[0025] 圖4為半失活溫度檢測結果圖，其中，圖A為野生型ω-轉氨酶，圖B為本發明ω-轉 氣酶關變體；
[0026] 圖5為酶活半衰期檢測結果圖，其中，圖Α為野生型ω-轉氨酶，圖Β為本發明ω-轉 氣酶關變體；
[0027] 圖6為本發明ω-轉氨酶突變體酶活最適溫度檢測結果圖。
【具體實施方式】 [0028] 實施例1
[0029] 首先將土曲霉(Aspergillus terreus) ω-轉氨酶的PDB文件（PDB ID:4CE5)上傳 至Disulfide by Design(DbD，http: //cptweb · cpt .wayne · edu/DbD2)以及Disulfide Bonds in Proteins (MOD IP，http://caps .nebs .res · in/dsdbase/modip .html)網址，上述 軟件設計二硫鍵時充分考慮了兩個半胱氨酸的c-s鍵旋轉角度、(：°之間的距離以及ce之間的 距離，利用生物信息學計算分析鍵長、鍵角以及能量來預測可行的引入二硫鍵的位點共有8 個，分別為 R131C 與 D134C、N25C 與 A28C、D113C 與 Y146C、E213C 與 V234C、A44C 與 L48C、M150C 與 M280C、A32C與F142C、R161C與Y201C。根據ω -轉氨酶的晶體結構表明，G129-D134區域氨基 酸殘基的溫度因子(B-factor)值較高，對蛋白質而言，如果某一氨基酸殘基的B-factor值 越高，則表明該氨基酸殘基所在部位的結構就越不穩定。因此，在G129-D134區域(該區域三 維結構如圖1所示）引入額外二硫鍵更容易提高該蛋白的穩定性。所以最終確定R131C與 D134C兩點引入二硫鍵。
[0030] 實施例2
[0031]采用定點突變PCR方法依次對ω -轉氨酶基因位點的R131C和D134C進行定點突變， 定點突變的引物如表1所示，從而得到同時含有兩個半胱氨酸的突變體。該突變體經過測序 驗證其核苷酸序列在第497及499位密碼子處發生突變，由131、134位點編碼精氨酸（R， Arg)、天冬氨酸(D，Asp)的密碼子CGT、GAT都突變為編碼半胱氨酸(C，Cys)的密碼子TGC。 [0032]表1定點突變引物。
[0034]以含有野生型ω-轉氨酶基因的pET28a-co-opt-TA質粒為模板，進行131位的定點 PCR擴增。PCR擴增體系為50yL，包含：Prime STAR Max DNA Polymerase(TaKaRa公司）25yL， lyL上游引物（10μΜ)，lyL下游引物（10μΜ)，lyL質粒模板（100ng/yL)，高溫滅菌的超純水補 至總體積5〇yL。
[0035] PCR擴增程序為：98°C變性lmin;98°C變性15s，55°C退火15s，72°C延伸3min，共循 環30次;72°C延伸TmiruPCR產物經過電泳檢測正確。
[0036]所得定點PCR反應產物用Dpn I在37°C下酶解2h以消除野生模板，酶解產物采用熱 激法轉化入化學感受態細胞E.coli DH5a，轉化液涂布含有卡那霉素(50yg/yL)的LB固體平 板得到定點突變文庫，于37°C培養12h得到帶突變的克隆，提取其質粒并測序，測序結果顯 示為131位的精氨酸突變為半胱氨酸后，再以該突變體為模板進行134位定點突變，突變方 法與131位相同，從而得到131位點和134位點都突變為半胱氨酸的突變體。經測序驗證正 確，將最后所得質粒命名為pET28a( + )-co-AT，該質粒圖譜如圖2所示。
[0037] 實施例3
[0038]將實施例2中測序正確的帶有雙突變ω-轉氨酶突變體基因的質粒轉化到E.coli BL21(DE3)中，挑取單菌落接種至加有5mL LB液體培養基的試管中，37°C、200r/min條件下 培養過夜。將培養好的菌液以1 %比例（體積比）的接種量接種至含50yg/mL卡那霉素的 100mL的LB培養基(胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g，調節pH 7.0)中，37°C、180r/min培 養至OD600值為0.4~0.6時，加入適量體積的IPTG (終濃度為0.5mmol/L)，然后在25°C、150r/ min條件下誘導培養18h后收集菌體。
[0039] 將收集的菌體用磷酸鹽緩沖液洗滌兩次，用破胞緩沖液重懸，超聲波破碎細胞，超 聲破胞工作條件為:功率300W，工作3s，間歇6s，超聲8min。破胞液于12000r/min，4°C條件下 離心處理30min，收集上清液，即得到含有ω-轉氨酶突變體的粗酶液。
[0040] 采用Ni-NTA親和層析對所得的粗酶液進行分離純化。經上樣、清洗和洗脫，收集洗 脫液，透析除去小分子即得到純的ω-轉氨酶突變體蛋白。適當稀釋后，以考馬斯亮藍法測 定純酶的濃度。
[0041] 所用緩沖液配制如下：
[0042] 破胞緩沖液/20mM洗脫緩沖液:50mM磷酸二氫鈉，300mM氯化鈉，20mM咪唑，ρΗ8.0;
[0043] 50mM洗脫緩沖液:50mM磷酸二氫鈉，300mM氯化鈉，50mM咪唑，ρΗ8.0;
[0044] 100mM洗脫緩沖液:50mM磷酸二氫鈉，300mM氯化鈉，100mM咪唑，ρΗ8.0;
[0045] 250mM洗脫緩沖液:50mM磷酸二氫鈉，300mM氯化鈉，250mM咪唑，ρΗ8.0。
[0046] 實施例4
[0047] 對實施例3純化所得的ω-轉氨酶突變體蛋白進行酶活檢測，同時以野生型ω-轉 氨酶作為對比，酶活檢測方法如下：以（R)-( + )_a甲基芐胺和丙酮酸為底物，底物溶液用磷 酸鹽緩沖液（50mM，pH 8.0)配制，200yL的反應體系中包括180yL底物溶液(0.25%DMS0， 2.5mM(R)-(+)-α甲基芐胺，2.5mM丙酮酸），20yL純酶液（約lmg/mL)。利用酶標儀檢測波長 245nm處0D值隨時間的變化曲線，結果如圖3所示，實驗結果表明ω -轉氨酶突變體的活性提 高到野生型的近2倍。
[0048]酶活計算方法如下：
[0050]其中，U為酶活，以每mg酶的量表示;^為終點時間的吸光值;Αο為起始時間的吸光 值;t為時間，單位為min; V為加樣體積，一般為200yL; L為光的路徑長度，為0.6cm; ε為常數， 值為12000Π 1ΟΓ1 · L · cm-SM為酶量，單位為mg。
[0051 ] 實施例5
[0052] 半失活溫度（T5Q1())是指酶在特定溫度下孵育一定時間后，酶活力喪失一半的溫 度，這是表征酶熱穩定性的一個重要參數。分別將野生型ω -轉氨酶和突變體ω -轉氨酶在 25~60°C水浴中保溫lOmin，保溫結束后迅速放置在冰上冷卻，然后測定酶的殘余比活力。 以溫度為橫坐標，以熱處理后與處理前的比活力的比值為縱坐標作圖，計算半失活溫度 (T 501())。結果如圖4所示，實驗結果表明，ω-轉氨酶突變體的T5Q1()為39.6Γ，比野生型酶提高 1.6。。。
[0053] 半衰期（t1/2)是指特定溫度下酶活力喪失一半的時間，是表征酶熱穩定性的另一 個重要參數。將野生型ω -轉氨酶和突變體ω -轉氨酶在40°C下分別保溫2、4、6、8、10、15、 20、25、30、35、40、45、5011^11，保溫結束后迅速放置在冰上冷卻51^11，然后測定酶的殘余比活 力。結果如圖5所示，實驗結果表明，ω-轉氨酶突變體的 tl/2為10.4min，比野生型酶延長 3.5min。由此說明，該突變體增強了該蛋白的熱穩定性，減緩了酶的熱失活速率，使得突變 酶可以耐受更高的溫度而不喪失活力。
[0054] 實施例6
[0055] 以(R)-( + )_a甲基芐胺和丙酮酸為底物，底物溶液用磷酸鹽緩沖液(50mM，pH 8.0) 配制，200yL 的反應體系中包括 180yL 底物溶(0.25%DMS0,2.5mM(R)-( + )-c^S;K，2.5mM 丙酮酸），加入20yL純酶液（約0.3mg/mL)后（并做三組平行對照），放入不同溫度（25°C、30 °C、35 °C、40 °C、45 °C、50 °C、55 °C、60 °C、65 °C、70 °C)的恒溫混勻儀中進行反應(400r/min)， 3min后放入100°C的水浴中煮沸lOmin，最后在冰上放置lOmin后，利用酶標儀檢測波長 245nm處的0D值。結果如圖6所示，野生型ω-轉氨酶和ω-轉氨酶突變體(R131C/D134C)最適 反應溫度均為45 °C。
【主權項】
1. 一種ω-轉氨酶突變體，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2. 編碼如權利要求1所述ω -轉氨酶突變體的基因。3. 如權利要求3所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。4. 包含如權利要求2或3所述基因的表達盒。5. 包含如權利要求2或3所述基因的重組載體。6. 包含如權利要求2或3所述基因的基因工程菌。7. 包含如權利要求5所述重組載體的基因工程菌。8. 如權利要求1所述ω-轉氨酶突變體在催化(R)-( + )-a-甲基芐胺生成苯乙酮中的應 用。
【文檔編號】C12P7/26GK105950581SQ201610456683
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月21日
【發明人】黃 俊, 謝東芳, 梅樂和, 王宏鵬, 胡升, 方卉, 趙偉睿, 呂常江, 李伊瑩
【申請人】浙江科技學院