熱穩定性提高的葡萄糖氧化酶突變體及其編碼基因和應用

熱穩定性提高的葡萄糖氧化酶突變體及其編碼基因和應用
【專利摘要】本發明提供了熱穩定性提高的葡萄糖氧化酶突變體及其編碼基因和應用，本發明使用易錯PCR 方法對野生型葡萄糖氧化酶基因進行突變，再通過高通量篩選方法將正突變檢出。經上述突變文庫構建、篩選方法，獲得3個熱穩定性顯著提高的葡萄糖氧化酶突變體，熱穩定性比野生型提高1?3 倍，具有良好的市場應用前景和工業價值。
【專利說明】
熱穩定性提高的葡萄糖氧化酶突變體及其編碼基因和應用
技術領域
[0001] 本發明屬于基因工程和酶工程領域，具體內容涉及熱穩定性提高的葡萄糖氧化酶 突變體及其編碼基因和應用。
【背景技術】
[0002] 葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,E.C. 1.1.3.4，G0D)有氧條件下能專一性地催化 β-D-葡糖生成葡萄糖酸和過氧化氫。葡萄糖氧化酶是目前主要的工具酶之一，被廣泛應用 于在食品工業、畜牧養殖和醫療檢測等領域。葡萄糖氧化酶作為公認的安全抗氧劑應用于 食品加工工藝中，在醫療產業中，葡萄糖氧化酶可以用于血糖測定等方向，作為一種飼料添 加劑，葡萄糖氧化酶可以改善動物腸道環境，促進動物生長。隨著葡萄糖氧化酶越來越多的 被應用于各個領域，工業上尤其是飼料工業對其現有性能有了越來越高的要求，如在常溫 下較長時間保持酶活力不下降，對熱和極端pH條件具有耐受性，對消化酶具有耐受性。其中 酶的熱穩定性對于葡萄糖氧化酶的應用非常關鍵，在酶的制備過程中和極端反應條件下 (高溫），耐熱性強的酶有著比較大的優勢。
[0003] 易錯PCR(error-prone PCR)技術是一種在DNA序列中制造隨機突變的方法，其基 本原理是在PCR擴增目的基因時，通過改變傳統PCR過程的反應條件(如提高酶離子濃度，改 變體系中4種dNTP的濃度等），使用較低保真度的Taq酶，從而以一定頻率隨機引入錯誤堿 基，從而形成序列不同的突變體庫。

【發明內容】

[0004] 本發明提供了熱穩定性提高的葡萄糖氧化酶突變體及其編碼基因和應用，本發明 提供的葡萄糖氧化酶突變體熱穩定性有了顯著的提升。
[0005] 為實現上述發明目的，本發明采用以下技術方案予以實現：
[0006] 本發明提供了 一種熱穩定性提高的葡萄糖氧化酶突變體G0D-H-2，所述的葡萄糖 氧化酶突變體G0D-H-2的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示，所述的突變體G0D-H-2序列由氨 基酸序列為SEQ ID NO: 1的葡萄糖氧化酶的第143位氨基酸由丙氨酸變為脯氨酸、第461位 氨基酸由苯丙氨酸變為異亮氨酸獲得。
[0007] 本發明提供了所述的葡萄糖氧化酶突變體G0D-H-2的葡萄糖氧化酶編碼基因。
[0008] 本發明提供了含有所述的葡萄糖氧化酶編碼基因的重組菌株。
[0009] 本發明提供了 一種熱穩定性提高的葡萄糖氧化酶突變體G0D-H-5，所述的葡萄糖 氧化酶突變體G0D-H-5的氨基酸序列如SEQ ID勵:7所示，所述的突變體600-!1-5序列由氨 基酸序列為SEQ ID NO: 1的葡萄糖氧化酶的第29位氨基酸由異亮氨酸變為亮氨酸、第143位 氨基酸由丙氨酸變為脯氨酸、第390位氨基酸由甘氨酸變為精氨酸、第461位氨基酸由苯丙 氨酸變為異亮氨酸獲得。
[0010] 本發明提供了所述的葡萄糖氧化酶突變體G0D-H-5的葡萄糖氧化酶編碼基因。
[0011] 本發明提供了含有所述的葡萄糖氧化酶編碼基因的重組菌株。
[0012] 本發明提供了 一種熱穩定性提高的葡萄糖氧化酶突變體G0D-H-6，所述的葡萄糖 氧化酶突變體G0D-H-6的氨基酸序列如SEQ ID N0:8所示，所述的突變體G0D-H-6序列由氨 基酸序列為SEQ ID NO: 1的葡萄糖氧化酶的第143位氨基酸由丙氨酸變為脯氨酸、第241位 氨基酸由脯氨酸變為天門冬氨酸、第359位氨基酸由蘇氨酸變為絲氨酸、第461位氨基酸由 苯丙氨酸變為異亮氨酸獲得。
[0013] 本發明提供了所述的葡萄糖氧化酶突變體G0D-H-6的葡萄糖氧化酶編碼基因。
[0014] 本發明提供了含有所述的葡萄糖氧化酶編碼基因的重組菌株。
[0015] 本發明提供了葡萄糖氧化酶突變體G0D-H-2、G0D-H-5和G0D-H-6在用于制備動物 飼料添加劑中的應用。
[0016] 本發明的優點和技術效果是:本發明的目的是采用定向進化技術對來源于黑曲霉 (Aspergillus niger)的葡萄糖氧化酶進行蛋白質工程改造，為達到上述發明目的，本發明 使用易錯PCR方法對葡萄糖氧化酶基因進行突變，再通過高通量篩選方法將正突變檢出，得 到熱穩定性提高的突變體，相比野生型葡萄糖氧化酶GOD-1，本發明的6個突變體G0D-H-1、 600-!1-2、600-!1-3、600-!1-4、600-!1-5、600-!1-6熱穩定性明顯提高，在80°(：處理3111丨11后，殘余 酶活分別提高了 1.3、1.6、1.9、2.1、2.5、2.3倍。本發明提供的突變體具有良好的市場應用 前景和工業價值
【附圖說明】
[0017]圖1是葡萄糖氧化酶突變體G0D-H-1與野生型氨基酸序列比對圖；
[0018] 圖2是葡萄糖氧化酶突變體G0D-H-2與野生型氨基酸序列比對圖；
[0019] 圖3是葡萄糖氧化酶突變體G0D-H-3與野生型氨基酸序列比對圖；
[0020] 圖4是葡萄糖氧化酶突變體G0D-H-4與野生型氨基酸序列比對圖；
[0021 ]圖5是葡萄糖氧化酶突變體G0D-H-5與野生型氨基酸序列比對圖；
[0022] 圖6是葡萄糖氧化酶突變體G0D-H-6與野生型氨基酸序列比對圖；
[0023] 圖 7為葡萄糖氧化酶突變體 G0D-H-1、G0D-H-2、G0D-H-3、G0D-H-4、G0D-H-5、G0D-H-6在不同溫度下的殘余酶活。
【具體實施方式】
[0024]下面結合附圖和具體實施例對本發明的技術方案做進一步詳細的說明。
[0025] 本發明用到了分子生物學領域使用的常規技術和方法。實施例僅是用于解釋本發 明，不限制本發明的保護范圍。
[0026] 實施例1:易錯PCR(err〇r-pr〇ne PCR)方法構建葡萄糖氧化酶G0D-1突變文庫
[0027] 來源于黑曲霉(Aspergillus niger)的葡萄糖氧化酶基因 G0D-1由589個氨基酸構 成(如SEQ ID N0:1所示），采用全基因合成的方法合成了該葡萄糖氧化酶基因 G0D-1(如SEQ ID N0:2所示），合成的基因兩端還帶有EcoR I和Not I酶切位點。以合成的該基因為模板擴 增葡萄糖氧化酶G0D-1基因，使用GeneMorph II隨機突變PCR試劑盒(Stratagene)隨機引入 突變。
[0028] 所用引物為：5' -GCGCGAATTCCGCTGCGGCCCTGCCACACTAC-3' (SEQ ID No：9),
[0029] 57-TAAAGCGGCCGCTCACTGCATGGAAGCATAATCTTCCAAGATAGCATCC-3 7(SEQ ID No： 10)〇
[0030]下劃線處分別為EcoR I和Not頂每切位點。
[0031] 反應條件為:94°C預變性10min，94°C變性60s，58°C退火60s和72°C延伸2min，共30 個循環，回收目的基因片段。
[0032] 將目的片段用EcoR I和Not I雙酶切消化后，與經過相同酶切的pET 21a( + )載體 (氨芐抗性基因）用Ligase進行連接反應。將連接好的片段轉化至大腸桿菌BL21-DE3,涂布 含有氨芐青霉素的LB平板，37°C倒置培養，待平板上出現轉化子后，挑取單克隆至96孔板， 每孔中含有150uL LB培養基(含有ImM IPTG，50ng/mL氨芐青霉素），30°C220rpm震蕩培養 12h，將孔板置于-20°C，反復凍融破壁，獲得含有葡萄糖氧化酶的粗酶液。分別取出5ul裂解 液至兩塊新的96孔板，其中一塊于80°C處理3min，兩塊96孔板都加入含有鄰聯茴香胺甲醇 緩沖液、葡萄糖緩沖液、辣根過氧化物酶溶液的顯色液，37 °C反應3min后加入100uL2M硫酸 終止反應，根據顯色反應測定殘余酶活。
[0033]取殘余活性比野生型G0D-1高的菌株到新的96孔培養板中，進行重復篩選。篩選到 2個突變體，分別為G0D-H-1和G0D-H-2，殘余活性是野生型對照的1-3倍，對這兩個突變體進 行DNA測序。
[0034] 測序結果顯示，如圖1和圖2所示，本輪易錯PCR獲得了一個含K122N和G492E的兩點 突變的突變體G0D-H-1，其氨基酸序列為SEQ ID N0:3,一個含A143P和F461I的兩點突變的 突變體G0D-H-2,其氨基酸序列為SEQ ID N0:4。
[0035] G0D-H-1:該酶的第122位的賴氨酸K變為天冬酰胺N(AAG變為AAC)，第492位的甘氨 酸G變為谷氨酸E(GGG變為GAG)。
[0036] G0D-H-2:該酶的第143位的丙氨酸A變為脯氨酸P(GCC變為CCC)，第461位的苯丙氨 酸F變為異亮氨酸I(TTC變為ATC)。
[0037]實施例2:第二輪易錯PCR突變文庫的構建和篩選突變文庫的構建 [0038]將第一輪易錯PCR方法篩選到的耐熱性提高的兩個突變體G0D-H01和G0D-H02分別 提取質粒作第二輪易錯PCR的模板，突變文庫的構建過程，使用的引物，PCR反應條件，同實 施例1。
[0039]通過第二輪易錯PCR，同樣獲得了大量的突變體基因片段。將構建得到的突變體轉 入大腸桿菌表達菌株BL21-DE3，篩選耐熱性正突變時以G0D-H-1和G0D-H-2為對照，其余操 作與實施例2相同，取殘余活性比突變型G0D-H-1和G0D-H-2高的菌株到新的96孔培養板中， 進行重復篩選。
[0040] 本輪篩選共獲得4個突變體，分別命名為G0D-H-3、G0D-H-4，G0D-H-5和G0D-H-6。其 中G0D-H-3和G0D-H-4是以G0D-H01為模板獲得的突變體，其熱穩定性高于G0D-H01，G0D-H-5 和G0D-H-6是以G0D-H02為模板獲得的突變體，其熱穩定性高于G0D-H02,挑取突變體菌株送 測序公司測序。
[0041 ] 測序結果顯示，如圖3、圖4、圖5和圖6所示，本輪易錯PCR獲得一個含D70Q、K122N和 G492E的三點突變的突變體G0D-H-3,其氨基酸序列為SEQ ID N0:5。一個含K122N、Q263P、 R341S和G492E的四點突變的突變體G0D-H-4,其氨基酸序列為SEQ ID N0:6。一個含I29L、 A143P、G390R和F461I的四點突變的突變體G0D-H-5，其氨基酸序列為SEQIDN0:7。一個含 A143P、P241D、T359S和F4611的四點突變的突變體G0D-H-6，其氨基酸序列為SEQ ID NO: 8。
[0042] G0D-H-3:該酶的第70位天冬氨酸D變為谷氨酸Q(DNA序列由GAC變為GAA)，第122位 的賴氨酸K變為天冬酰胺N(AAG變為AAC)，第492位的甘氨酸G變為谷氨酸E(GGG變為GAG)。 [0043] G0D-H-4:該酶的第122位的賴氨酸K變為天冬酰胺N(AAG變為AAC)，第263為的谷氨 酰胺Q變為脯氨酸P(CAG變為CCG)，第341位的精氨酸R變為絲氨酸S(CGC變為AGC)，第492位 的甘氨酸G變為谷氨酸E(GGG變為GAG)。
[0044] G0D-H-5:該酶的第29位的異亮氨酸I變為亮氨酸L(AUC變為CUC)，第143位的丙氨 酸A變為脯氨酸P(GCC變為CCC)，第390位的甘氨酸G變為精氨酸R(GGC變為CGC)，第461位的 苯丙氨酸F變為異亮氨酸I(TTC變為ATC)。
[0045] G0D-H-6:該酶的第143位的丙氨酸A變為脯氨酸P(GCC變為CCC)，第241位的脯氨酸 P變為天門冬氨酸D(CCC變為GAC)，第359位的蘇氨酸T變為絲氨酸S(ACC變為UCC)，第461位 的苯丙氨酸F變為異亮氨酸I(TTC變為ATC)。
[0046] 實施例3:畢赤酵母工程菌株的構建
[0047] 使用實施例1中所述引物，以實施例1和實施例2所獲得的突變體作為模板進行PCR 擴增，PCR反應條件與實施例1相同。
[0048] 將擴增得到的實施例1及實施例2所述葡萄糖氧化酶突變體基因片段，以及野生型 基因片段，通過EcoR I和Not I位點與表達載體pPIC9K相連接，構建表達載體?？1091(-600-1、pPIC9K-G0D-H-1、pPIC9K-G0D-H-2、pPIC9K-G0D-H-3、pPIC9K-G0D-H-4、pPIC9K-G0D-H-5 和PPIC9K-G0D-H-6。將表達載體轉入大腸桿菌DH5a感受態，挑取轉化子后大量提取質粒。
[0049] 將以上表達質粒用Sail進行線性化，線性化片段用片段純化試劑盒（TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purifibation Kit)純化收集后，通過電轉化方法轉化畢赤酵母 GS115，涂布MD平板。將在MD平板上生長出的菌落涂布到濃度依次逐漸升高（lmg/mL，2mg/ mL，4mg/mL，8mg/mL)的遺傳霉素的YH)平板上篩選多拷貝的陽性轉化子，得到畢赤酵母重組 菌株。
[0050] 將7個基因的轉化子分別命名為畢赤酵母600-1(?丨吐丨3口38如^8 600-1)、600-H_l(Pichia pastoris G0D-H-1)、畢赤酵母G0D-H_2(Pichia pastoris G0D-H-2)、畢赤酵 母G0D-H_3(Pichia pastoris G0D-H-3)、畢赤酵母G0D-H_4(Pichia pastoris G0D-H-4)、 畢赤酵母G0D-H_5(Pichia pastoris G0D-H-5)和畢赤酵母G0D-H_6(Pichia pastoris G0D-H-6)，分別挑取每個基因的轉化子轉接于BMGY培養基中，30°C，220rpm振蕩培養18h后， 離心獲得菌體，將適量菌體轉入BMMY培養基中，使菌體濃度達到0D600 = 1，30°C，220rpm繼 續振蕩培養，每24h添加培養體積1 %的甲醇。誘導表達4d后，將培養液離心獲得上清，將上 清液進行葡萄糖氧化酶活力測定和熱穩定性測定。
[0051 ]實施例4:突變體和野生型表達產物酶活力及熱穩定性的測定 [0052]酶活力測定方法：
[0053] 取鄰聯茴香胺緩沖液2.5mL(0 . lmLl %鄰聯茴香胺甲醇儲備液加入到12mL 0.1M pH6.0磷酸緩沖液配成），18%葡萄糖溶液0.3mL，0.03 %過氧化物酶溶液0. lmL，加入到比色 管中37°C保溫5min，再加入0. lmL葡萄糖氧化酶酶液(空白管加入0. lmL蒸餾水），反應3min 后，加入2M硫酸2mL，混勻以終止反應。以標準空白樣為空白對照，在540nm波長處測定空白 (A〇)和試樣溶液(心)的吸光值。得出Δ A=Ai-Ao
[0054]試樣酶活力計算：
[0055] X=( AAXnX3)/(11.3XtX0.1)
[0056] T一測定時間，min
[0057] 0.1-樣品體積，mL
[0058] 11.3-消光系數
[0059] N-稀釋倍數 [0060] 3-反應液體積，mL
[00611酶活單位與定義:在pH5.5、37°C的條件下，每分鐘能把1. Ownol的β-D-葡萄糖氧化 成葡萄糖酸和H202的酶量為一個單位。
[0062]將實施例3所述發酵上清液用pH 6.0的磷酸緩沖液稀釋至約20U/mL，在80°C條件 下處理3min后，測定殘余酶活，以未處理樣品的酶活為100%，計算相對酶活。結果如圖7所 示，野生型葡萄糖氧化酶在80°C條件下處理3min，酶活僅剩23%，而突變體600-!1-1、6(?-!!- 2、600-!1-3、600-!1-4,600-!1-5和600-!1-6同樣在80°(：條件下處理3111丨11仍能保持30-60%的酶 活。其耐熱性分別與野生型基因相比，分別提高了 1.3、1.6、2.2、2.1、2.7、2.3倍。
[0063] 由此可見，突變后的葡萄糖氧化酶的耐熱性與野生型相比有了較大提高，更加有 利于其在工業中的應用。
[0064] 實施例5:葡萄糖氧化酶的養殖應用實驗
[0065] 5.1實驗設計
[0066]白羽肉雞苗購自某種禽廠，共分為8棟雞舍，每一雞舍20000只雞，其中1、2、3、4為 對照組，5、6、7、8為實驗組，實驗組在基礎日糧中添加0.2U/g本發明提供的葡萄糖氧化酶 G0D-H-5,實驗為期40天。
[0067] 5.2生產性能測定
[0068] 分別實驗開始第2、40天對各組雞空腹稱重，記錄初始重和末重。飼養過程中，觀察 記錄各組雞的健康狀況，并記錄每周每籠采食量，統計實驗期內的成活率、料重比及計算歐 洲指數。實驗結果：
[0069] 表1對照組生產性能數據
[0071 ]表2實驗組生產性能數據
[0073] 與對照組相比，實驗組的均重有所增加，成活率也有所增加，而料重比有所下降， 經過計算歐洲指數上升了 2.9 %，表明在日糧中添加了葡萄糖氧化酶G0D-H-5使養殖效益有 所增加。
[0074] 本實施例5為了便于體現本發明所述的葡萄糖氧化酶的應用，并不限于肉雞的應 用，因為所述的葡萄糖氧化酶可以添加到基礎日糧中，可以用于其他畜禽類的飼喂。通常可 以在豬、兔和奶牛等養殖過程中在其配合飼料中添加。
[0075] 以上實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其進行限制；盡管參照前述實 施例對本發明進行了詳細的說明，對于本領域的普通技術人員來說，依然可以對前述實施 例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換;而這些修改或替 換，并不使相應技術方案的本質脫離本發明所要求保護的技術方案的精神和范圍。
【主權項】
1. 一種熱穩定性提高的葡萄糖氧化酶突變體G0D-H-2,其特征在于:所述的葡萄糖氧化 酶突變體G0D-H-2的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示，所述的突變體G0D-H-2序列由氨基酸 序列為SEQ ID NO: 1的葡萄糖氧化酶的第143位氨基酸由丙氨酸變為脯氨酸、第461位氨基 酸由苯丙氨酸變為異亮氨酸獲得。2. 權利要求1所述的葡萄糖氧化酶突變體G0D-H-2的葡萄糖氧化酶編碼基因。3. 含有權利要求2所述的葡萄糖氧化酶編碼基因的重組菌株。4. 一種熱穩定性提高的葡萄糖氧化酶突變體G0D-H-5，其特征在于:所述的葡萄糖氧化 酶突變體G0D-H-5的氨基酸序列如SEQ ID N0:7所示，所述的突變體G0D-H-5序列由氨基酸 序列為SEQ ID NO: 1的葡萄糖氧化酶的第29位氨基酸由異亮氨酸變為亮氨酸、第143位氨基 酸由丙氨酸變為脯氨酸、第390位氨基酸由甘氨酸變為精氨酸、第461位氨基酸由苯丙氨酸 變為異亮氨酸獲得。5. 權利要求4所述的葡萄糖氧化酶突變體G0D-H-5的葡萄糖氧化酶編碼基因。6. 含有權利要求5所述的葡萄糖氧化酶編碼基因的重組菌株。7. -種熱穩定性提高的葡萄糖氧化酶突變體G0D-H-6，其特征在于:所述的葡萄糖氧化 酶突變體G0D-H-6的氨基酸序列如SEQ ID N0:8所示，所述的突變體G0D-H-6序列由氨基酸 序列為SEQ ID NO: 1的葡萄糖氧化酶的第143位氨基酸由丙氨酸變為脯氨酸、第241位氨基 酸由脯氨酸變為天門冬氨酸、第359位氨基酸由蘇氨酸變為絲氨酸、第461位氨基酸由苯丙 氨酸變為異亮氨酸獲得。8. 權利要求7所述的葡萄糖氧化酶突變體G0D-H-6的葡萄糖氧化酶編碼基因。9. 含有權利要求8所述的葡萄糖氧化酶編碼基因的重組菌株。10. 葡萄糖氧化酶突變體G0D-H-2、G0D-H-5和G0D-H-6在用于制備動物飼料添加劑中的 應用。
【文檔編號】C12N15/53GK105950577SQ201610528932
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年7月6日
【發明人】肖志壯, 張穩, 李俊安, 趙志強, 武傳菊
【申請人】青島紅櫻桃生物技術有限公司