一種高品質噬菌體保存保護劑及其制備方法和應用
【專利摘要】本發明提供了一種高品質噬菌體保存保護劑以及該高品質噬菌體保存保護劑的制備和應用方法。其中本發明所述的高品質噬菌體保存保護劑，組分合理，其中脫脂奶粉、白蛋白粉、酵母粉、中性白土等形成整個保存保護劑的骨架，還包含多種糖類和鹽，組分合理，原料來源廣，易于獲得，成本低，并且可以用于多種噬菌體的保存，適應性好。本發明所述的高品質噬菌體保存保護劑的制備方法，方法合理，工藝簡單易行，效率高，應用成本低，操作簡單、易于實現。高品質噬菌體保存保護劑具有極高的應用前景，并且使用方便，應用便捷。
【專利說明】
一種高品質噬菌體保存保護劑及其制備方法和應用
技術領域
[0001] 本發明屬于生物技術和微生物制品領域，具體地，涉及一種高品質噬菌體保存保 護劑，以及該高品質噬菌體保存保護劑的制備方法和應用方法。
【背景技術】
[0002] 噬菌體是一類能感染細菌、放線菌、螺旋體等微生物的病毒的總稱，對一些細菌具 有高度的專一性，當噬菌體侵染這些細菌時，可在細菌中繁殖并殺死細菌，而它對動植物沒 有毒性。隨著分子生物學技術的發展，噬菌體已經廣泛用于疾病診斷、水處理等多個領域。 由于噬菌體可以將基因插入宿主DNA內的特性，使得它還成為了重要的分子和遺傳學研究 工具。利用噬菌體，可以設計很多精巧的實驗。
[0003] 然而在上述過程中，都需要對噬菌體進行保存，在噬菌體的保存過程中，往往需要 加入保存保護劑從而保證噬菌體的活性。現有技術中的保護劑常常保存效果差，噬菌體的 保存時間短，存活率低，噬菌體容易被污染，并且必須在低溫條件下進行保存，嚴重制約了 對噬菌體應用的發展。
【發明內容】
[0004] 發明目的：為了克服以上不足，本發明提供了一種高品質噬菌體保存保護劑以及 該高品質噬菌體保存保護劑的制備和應用方法。
[0005] 技術方案:本發明提供了一種高品質噬菌體保存保護劑，以重量組分計，包括以下 組分：
[0006] 脫脂奶粉5-12份
[0007] 白蛋白粉3-5份
[0008] 酵母粉 0.5-1.2份
[0009] 中性白土 0.02-0.1 份 [0010]木炭粉 0.01-0.03份
[0011] 蜂膠 0.02-0.05份
[0012] 乳糖 1-1.8 份
[0013] 麥芽糖0.8-2份
[0014] 硫酸鈉 0.2-0.3份 [0015]氯化鈣 0.5-1.5份
[0016] 氯化鎂 0.3-0.8份
[0017] 磷酸氫二鉀0.02-0.3份
[0018] 磷酸二氫鈉 0.04-0.15份
[0019] 甘油1-3份
[0020] 司盤-80 0.01-0.08份
[0021] 水 100 份。
[0022] 本發明所述的高品質噬菌體保存保護劑，組分合理，其中脫脂奶粉、白蛋白粉、酵 母粉、中性白土等形成整個保存保護劑的骨架，防止低分子物質的碳化和氧化，同時保護活 性物質不受溫度影響，使保護劑形成多孔性、疏松的海綿狀物且具有一定的含水量，在凍存 過程中保持原有的構架，從而增加溶解度。此外，多種糖類和鹽使噬菌體保持存活狀態以及 對水分起緩解作用，并且保持電解質濃度。噬菌體保存保護劑可以使噬菌體低溫保存下免 受溶液損傷和冰晶損傷等物理因素的損傷，并且維持噬菌體極高的存活率和活性，使噬菌 體的活動處于半靜止或靜止狀態。此外，保護劑同溶液中的水分子結合，發生水合作用，弱 化水的結晶過程使溶液的粘性增加從而減少冰晶的形成，同時冷凍保護劑可以通過在噬菌 體內外維持一定的摩爾濃度，降低內外未結冰溶液中電解質的濃度，使細胞免受溶質的損 傷。此外，保護劑還可以在室溫條件下用于多種噬菌體的保存，適應性好。
[0023] 進一步的，上述的高品質噬菌體保存保護劑，以重量組分計，還包括0.1-0.5份的 維生素，所述維生素以重量組分計，包括以下組分：
[0024] 維生素 C ^份
[0025] 維生素 E 3-8份
[0026] 維生素 A 0.5-0.8份
[0027] 維生素 B2 0.2-0.5份。
[0028] 通過增加維生素，增加整個保存保護劑的營養成分和抗氧化作用，使噬菌體保持 存活狀態以及對水分起緩解作用。
[0029]進一步的，上述的高品質噬菌體保存保護劑，所述甘油為20 % -40 %的甘油。20 % -40 %的甘油流動性好，易于應用。
[0030] 進一步的，上述的高品質噬菌體保存保護劑，所述的水為去離子水或純化水。去離 子水或純化水可以保證高品質噬菌體保存保護劑質量穩定、可控。
[0031] 本發明還提供一種高品質噬菌體保存保護劑的制備方法，包括以下步驟：
[0032] 1)將脫脂奶粉、白蛋白粉、乳糖、麥芽糖、硫酸鈉、氯化鈣和氯化鎂加入到1/2重量 的水中，升溫到20_30°C，磁力攪拌混勻后備用；
[0033] 2)將酵母粉、中性白土、木炭粉、蜂膠、磷酸氫二鉀和磷酸二氫鈉加入至ljl/2重量的 水中，磁力攪拌混勻后備用；
[0034] 3)將步驟1)的混合液加入到步驟2)得到的溶液中混合，磁力攪拌均勻；
[0035] 4)向混合步驟3)的溶液中再滴加甘油和司盤-80，磁力攪拌20-30min;
[0036] 5)調節步驟4)得到的溶液的pH到5.5-7.5后于115-121°C加熱滅菌20-30min，得所 述高品質噬菌體保存保護劑。
[0037] 本發明所述的高品質噬菌體保存保護劑的制備方法，工藝簡單易行，效率高，應用 成本低，操作簡單、易于實現，應用方便。
[0038] 進一步的，上述的高品質噬菌體保存保護劑的制備方法，熱滅菌液冷卻到室溫后， 在無菌條件下加入維生素磁力攪拌混勻。后添加維生素，保證維生素的成分不被破壞。 [0039]進一步的，上述的高品質噬菌體保存保護劑的制備方法，所述攪拌速度為50-200r/min。條件溫和，易于實現。
[0040]進一步的，上述的高品質噬菌體保存保護劑的制備方法，使用稀鹽酸和/或氫氧化 鈉調節溶液pH。原料來源廣，調節十分方便，并且應用成本低。
[0041 ]進一步的，上述的高品質噬菌體保存保護劑的制備方法，所述室溫為15-25°C。條 件溫和，易于實現。
[0042] 本發明還提供一種高品質噬菌體保存保護劑的應用方法，所述高品質噬菌體保存 保護劑應用時，噬菌體液與高品質噬菌體保存保護劑按照1:1-2.5的體積比混合均勻，于室 溫保存或者真空冷凍干燥后2_7°C進行凍存。高品質噬菌體保存保護劑使用方便，可以用于 多種不同的噬菌體凍存的使用，適應性好，可以于室溫或者冷藏保存，對環境溫度要求低， 并非要求必須低溫才能保存，即便在15-25Γ的室溫條件下也可以進行噬菌體的保存，可以 用于多種情況下的保存，具有極高的應用前景。
[0043] 有益效果:與現有技術相比，本發明具有以下優點:本發明所述的高品質噬菌體保 存保護劑，其組分合理，原料來源廣，易于獲得，成本低，可以維持噬菌體極高的存活率和活 性，并且適應性好。本發明所述的高品質噬菌體保存保護劑的制備方法，方法合理，工藝簡 單易行，效率高，應用成本低，操作簡單、易于實現。具有極高的應用前景，對保存溫度要求 低，并且使用方便，可以用于多種情況下的保存，應用便捷。
【附圖說明】
[0044] 圖1為本發明所述使用實施例1-4高品質噬菌體保存保護劑的噬菌體存活率圖。
【具體實施方式】
[0045] 下面將通過幾個具體實施例，進一步闡明本發明，這些實施例只是為了說明問題， 并不是一種限制。
[0046] 實施例1
[0047] -種高品質噬菌體保存保護劑，以重量組分計，包括以下組分：
[0048]脫脂奶粉5份
[0049] 白蛋白粉3份
[0050] 酵母粉0.5份 [0051 ] 中性白土 0.02份
[0052] 木炭粉0.01份
[0053] 蜂膠 〇.〇2份
[0054] 乳糖1份
[0055] 麥芽糖0.8份 [0056] 硫酸鈉0.2份 [0057]氯化鈣0.5份 [0058] 氯化鎂0.3份 [0059] 磷酸氫二鉀0.02份 [0060] 磷酸二氫鈉0.04份 [0061 ] 20 % 甘油 1 份
[0062]司盤-80 0.01 份 [0063] 去離子水100份；
[0064]此外，上述的高品質噬菌體保存保護劑，以重量組分計，還包括0.1份的維生素，所 述維生素以重量組分計，包括以下組分：
[0065] 維生素 C 1份
[0066] 維生素 E 3份
[0067] 維生素 A 0.5份 [0068] 維生素 B2 0.2份。
[0069] 上述高品質噬菌體保存保護劑的制備方法，包括以下步驟：
[0070] 1)將脫脂奶粉、白蛋白粉、乳糖、麥芽糖、硫酸鈉、氯化鈣和氯化鎂加入到1/2重量 的水中，升溫到20°C，50r/min的攪拌速度下磁力攪拌混勻后備用；
[0071] 2)將酵母粉、中性白土、木炭粉、蜂膠、磷酸氫二鉀和磷酸二氫鈉加入到1/2重量的 水中，50r/min的攪拌速度下磁力攪拌混勾后備用；
[0072] 3)將步驟1)的混合液加入到步驟2)得到的溶液中混合，50r/min的攪拌速度下磁 力攪拌均勻；
[0073] 4)向混合步驟3)的溶液中再滴加甘油和司盤-80，50r/min的攪拌速度下磁力攪拌 20min；
[0074] 5)使用稀鹽酸和/或氫氧化鈉調節步驟4)得到的溶液的pH到5.5后于115°C加熱滅 菌20min，熱滅菌液冷卻到15°C后，在無菌條件下加入維生素，50r/min的攪拌速度下磁力攪 拌混勻，得所述高品質噬菌體保存保護劑。
[0075] 上述噬菌體保存保護劑用于副溶血弧菌噬菌體的保存，應用時，噬菌體液與高品 質噬菌體保存保護劑按照1:1的體積比混合均勻，真空冷凍干燥后2°C進行凍存。
[0076] 實施例2
[0077] -種高品質噬菌體保存保護劑，以重量組分計，包括以下組分：
[0078]脫脂奶粉12份
[0079] 白蛋白粉5份
[0080] 酵母粉1.2份 [0081 ] 中性白土 0.1份
[0082] 木炭粉0.03份
[0083] 蜂膠 0.05份
[0084] 乳糖1.8份
[0085] 麥芽糖2份 [0086] 硫酸鈉0.3份 [0087]氯化鈣1.5份 [0088] 氯化鎂0.8份 [0089] 磷酸氫二鉀0.3份 [0090] 磷酸二氫鈉0.15份
[0091] 40 % 甘油 3份
[0092] 司盤-80 0.08份
[0093] 純化水100份；
[0094] 此外，上述的高品質噬菌體保存保護劑，以重量組分計，還包括0.5份的維生素，所 述維生素以重量組分計，包括以下組分：
[0095] 維生素 C 3份
[0096] 維生素 E 8份
[0097] 維生素 A 0.8份 [0098] 維生素 B2 0.5份。
[0099] 上述高品質噬菌體保存保護劑的制備方法，包括以下步驟：
[0100] 1)將脫脂奶粉、白蛋白粉、乳糖、麥芽糖、硫酸鈉、氯化鈣和氯化鎂加入到1/2重量 的水中，升溫到30°C，200r/min的攪拌速度下磁力攪拌混勾后備用；
[0101] 2)將酵母粉、中性白土、木炭粉、蜂膠、磷酸氫二鉀和磷酸二氫鈉加入到1/2重量的 水中，200r/min的攪拌速度下磁力攪拌混勾后備用；
[0102] 3)將步驟1)的混合液加入到步驟2)得到的溶液中混合，200r/min的攪拌速度下磁 力攪拌均勻；
[0103] 4)向混合步驟3)的溶液中再滴加甘油和司盤-80,200r/min的攪拌速度下磁力攪 拌30min;
[0104] 5)使用稀鹽酸和/或氫氧化鈉調節步驟4)得到的溶液的pH到7.5后于121°C加熱滅 菌30min，熱滅菌液冷卻到25°C后，在無菌條件下加入維生素，200r/min的攪拌速度下磁力 攪拌混勻，得所述高品質噬菌體保存保護劑。
[0105] 上述噬菌體保存保護劑用于大腸桿菌噬菌體的保存，應用時，噬菌體液與高品質 噬菌體保存保護劑按照1:2.5的體積比混合均勻，真空冷凍干燥后7°C進行凍存。
[0106] 實施例3
[0107] -種高品質噬菌體保存保護劑，以重量組分計，包括以下組分：
[0108] 脫脂奶粉8份 [0109]白蛋白粉4份 [0110]酵母粉1份
[0111] 中性白土 0.06份
[0112] 木炭粉〇.〇2份
[0113] 蜂膠 0.03份
[0114] 乳糖1.5份 [0115]麥芽糖1份
[0116] 硫酸鈉0.25份
[0117] 氯化鈣0.9份
[0118] 氯化鎂0.6份
[0119] 磷酸氫二鉀0.2份
[0120] 磷酸二氫鈉0.1份
[0121] 30%甘油 2份
[0122] 司盤-80 0.016份
[0123] 純化水100份；
[0124] 此外，上述的高品質噬菌體保存保護劑，以重量組分計，還包括0.3份的維生素，所 述維生素以重量組分計，包括以下組分：
[0125] 維生素 C 2份
[0126] 維生素 E 6份
[0127] 維生素 A 0.7份
[0128] 維生素 B2 0.3份。
[0129] 上述高品質噬菌體保存保護劑的制備方法，包括以下步驟：
[0130] 1)將脫脂奶粉、白蛋白粉、乳糖、麥芽糖、硫酸鈉、氯化鈣和氯化鎂加入到1/2重量 的水中，升溫到25°C，100r/min的攪拌速度下磁力攪拌混勾后備用；
[0131] 2)將酵母粉、中性白土、木炭粉、蜂膠、磷酸氫二鉀和磷酸二氫鈉加入到1/2重量的 水中，100r/min的攪拌速度下磁力攪拌混勾后備用；
[0132] 3)將步驟1)的混合液加入到步驟2)得到的溶液中混合，1 OOr/min的攪拌速度下磁 力攪拌均勻；
[0133] 4)向混合步驟3)的溶液中再滴加甘油和司盤-80, lOOr/min的攪拌速度下磁力攪 摔25min;
[0134] 5)使用稀鹽酸和/或氫氧化鈉調節步驟4)得到的溶液的pH到7后于118°C加熱滅菌 25min，熱滅菌液冷卻到20°C后，在無菌條件下加入維生素，100r/min的攪拌速度下磁力攪 拌混勻，得所述高品質噬菌體保存保護劑。
[0135] 上述噬菌體保存保護劑用于溶藻弧菌噬菌體的保存，應用時，噬菌體液與高品質 噬菌體保存保護劑按照1:2的體積比混合均勻，真空冷凍干燥后4°C進行凍存。
[0136] 實施例4
[0137] -種高品質噬菌體保存保護劑，以重量組分計，包括以下組分：
[0138] 脫脂奶粉5份
[0139] 白蛋白粉3份
[0140] 酵母粉1.2份
[0141] 中性白土 0.1份
[0142] 木炭粉〇.〇2份
[0143] 蜂膠 0.03份
[0144] 乳糖1.8份
[0145] 麥芽糖2份
[0146] 硫酸鈉0.2份
[0147] 氯化鈣0.5份
[0148] 氯化鎂-0.8份
[0149] 磷酸氫二鉀0.1份 [0150] 磷酸二氫鈉0.04份
[0151] 20%甘油 3份
[0152] 司盤-80 0.08份
[0153] 去離子水100份；
[0154] 此外，上述的高品質噬菌體保存保護劑，以重量組分計，還包括0.2份的維生素，所 述維生素以重量組分計，包括以下組分：
[0155] 維生素 C 3份
[0156] 維生素 E 8份
[0157] 維生素 A 0.5份
[0158] 維生素 B2 0.2份。
[0159] 上述高品質噬菌體保存保護劑的制備方法，包括以下步驟：
[0160] 1)將脫脂奶粉、白蛋白粉、乳糖、麥芽糖、硫酸鈉、氯化鈣和氯化鎂加入到1/2重量 的水中，升溫到30°C，120r/min的攪拌速度下磁力攪拌混勾后備用；
[0161] 2)將酵母粉、中性白土、木炭粉、蜂膠、磷酸氫二鉀和磷酸二氫鈉加入到1/2重量的 水中，120r/min的攪拌速度下磁力攪拌混勾后備用；
[0162 ] 3)將步驟1)的混合液加入到步驟2)得到的溶液中混合，120r/min的攪拌速度下磁 力攪拌均勻；
[0163] 4)向混合步驟3)的溶液中再滴加甘油和司盤-80,120r/min的攪拌速度下磁力攪 拌20min;
[0164] 5)使用稀鹽酸和/或氫氧化鈉調節步驟4)得到的溶液的pH到6后于121°C加熱滅菌 20min，熱滅菌液冷卻到25°C后，在無菌條件下加入維生素，120r/min的攪拌速度下磁力攪 拌混勻，得所述高品質噬菌體保存保護劑。
[0165] 上述噬菌體保存保護劑用于分歧桿菌噬菌體的保存，應用時，噬菌體液與高品質 噬菌體保存保護劑按照1:1.5的體積比混合均勻，于20°C保存。
[0166] 對使用實施例1-4的噬菌體保護劑的保存1、3、6、9個月后的噬菌體污染情況以及 存活率分別進行考察，如表1所示，噬菌體均未污染，并且如圖1所示，噬菌體在9個月內保持 62.5%以上的存活率。
[0167] 表1噬菌體污染情況
[0168]
[0169]以上所述僅是發明的幾個實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員 來說，在不脫離發明原理的前提下，還可以做出若干改進，這些改進也應視為本發明的保護 范圍。
【主權項】
1. 一種高品質噬菌體保存保護劑，其特征在于：以重量組分計，包括以下組分： 脫脂奶粉5-12份 白蛋白粉3-5份 酵母粉0.5-1.2份 中性白土 0.02-0.1份 木炭粉0.01-0.03份 蜂膠0.02-0.05份 乳糖1-1.8份 麥芽糖0.8-2份 硫酸鈉0.2-0.3份 氯化鈣0.5-1.5份 氣化儀〇. 3_0.8份 磷酸氫二鉀0.02-0.3份 磷酸二氫鈉0.04-0.15份 甘油1-3份 司盤-80 0.01-0.08份 水100份。2. 根據權利要求1所述的高品質噬菌體保存保護劑，其特征在于：以重量組分計，還包 括0.1-0.5份的維生素， 所述維生素以重量組分計，包括以下組分： 維生素 C 1-3份 維生素 E 3-8份 維生素 A 0.5-0.8份 維生素 B2 0.2-0.5份。3. 根據權利要求1所述的高品質噬菌體保存保護劑，其特征在于:所述甘油為20%-40% 的甘油。4. 根據權利要求1所述的高品質噬菌體保存保護劑，其特征在于:所述的水為去離子水 或純化水。5. 根據權利1-4任一項所述的高品質噬菌體保存保護劑的制備方法，其特征在于:包括 以下步驟： 1) 將脫脂奶粉、白蛋白粉、乳糖、麥芽糖、硫酸鈉、氯化鈣和氯化鎂加入到1/2重量的水 中，升溫到20-30°C，磁力攪拌混勻后備用； 2) 將酵母粉、中性白土、木炭粉、蜂膠、磷酸氫二鉀和磷酸二氫鈉加入到1/2重量的水 中，磁力攪拌混勻后備用； 3) 將步驟1)的混合液加入到步驟2)得到的溶液中混合，磁力攪拌均勻； 4) 向混合步驟3)的溶液中再滴加甘油和司盤-80,磁力攪拌20-30min; 5) 調節步驟4)得到的溶液的pH到5.5-7.5后于115-121°(：加熱滅菌2〇-3〇1^11，得所述高 品質嗤囷體保存保護劑。6. 根據權利要求5所述的高品質噬菌體保存保護劑的制備方法，其特征在于:熱滅菌液 冷卻到室溫后，在無菌條件下加入維生素磁力攪拌混勻。7. 根據權利要求5或6所述的高品質噬菌體保存保護劑的制備方法，其特征在于:所述 攪拌速度為50_200r/min。8. 根據權利要求5所述的高品質噬菌體保存保護劑的制備方法，其特征在于:使用稀鹽 酸和/或氫氧化鈉調節溶液pH。9. 根據權利要求6所述的高品質噬菌體保存保護劑的制備方法，其特征在于:所述室溫 為 15-25。。。10. 根據權利要求1或5所述的高品質噬菌體保存保護劑的應用方法，其特征在于:所述 高品質噬菌體保存保護劑應用時，噬菌體液與高品質噬菌體保存保護劑按照1:1-2.5的體 積比混合均勻，于室溫保存或者真空冷凍干燥后2-7°C進行凍存。
【文檔編號】C12N7/00GK105950569SQ201610416073
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月14日
【發明人】許維素, 宋增福, 陳彪
【申請人】蘇州埃瑞特生物技術有限公司