一種成肌細胞膜片及其制備方法
【專利摘要】本發明提供了一種成肌細胞膜片及其制備方法，所述的成肌細胞膜片為通過脂肪干細胞定向誘導而得到的。本發明提供的成肌細胞膜片，在具備良好機械性能同時，能夠高表達肌細胞標志蛋白，可用于肌肉損傷及修復重建。本發明還提供了上述成肌細胞膜片的制備方法。上述成肌細胞膜片及其制備方法十分具有實用價值。
【專利說明】
一種成肌細胞膜片及其制備方法
技術領域
[0001] 本發明涉及組織工程與再生醫學領域，尤其涉及一種成肌細胞膜片及其制備方 法。
【背景技術】
[0002] 肌細胞是一種終末分化細胞，再生能力差，肌肉損傷后主要以瘢痕修復為主，繼而 影響其運動及收縮功能。臨床上多種疾病病因與肌肉損傷或功能異常密切相關，如壓力性 尿失禁、肌無力、杜氏肌營養不良等，但目前治療手段有限且療效欠佳。正常肌細胞由肌衛 星細胞分化而成，后者是位于基膜下的一類靜息期肌源性干細胞，其數量隨年齡增長而不 斷降低，至成年時僅剩下不足7%，因此難以滿足廣泛而嚴重的肌肉再生需求。
[0003] 利用干細胞移植修復是目前組織工程研究的熱點，通常將干細胞通過體外誘導技 術促其定向分化，繼而細胞懸液注射組織損傷處進行修復，并已取得一定療效。但是這種利 用細胞懸液原位注射有一些缺陷難以克服:首先，干細胞屬于貼壁生長，細胞直接注射之前 須通過酶消化使其分散形成細胞懸液，這樣不可避免影響細胞活性和丟失細胞;其次，幾乎 所有文獻均提及注射的細胞聚集在注射點周圍，僅有少量細胞沿正常肌纖維組織深入生 長，因此如何使細胞在植入受損周圍并形成更為均勻的分布，以整體區域修復，而非若干點 修復，將是影響最終臨床療效的關鍵。
[0004] 細胞膜片技術是通過刺激細胞外基質大量分泌并連接細胞形成一種細胞密度高、 細胞分布均勻、質地均一的膜片狀組織的技術。已有研究證實，細胞膜片中細胞無須胰酶消 化處理，直接移植修復后，細胞凋亡率低，細胞活性保持長達12個月。脂肪干細胞是組織工 程應用最常見干細胞類型之一，具有細胞活性高、脂肪組織中含量豐富、取材簡便、可重復 切取、機體損傷小等優勢。脂肪干細胞具有多向分化潛能，分化能力強，多項研究證實添加 5_氮雜胞苷及馬血清可促進其成肌分化。干細胞誘導技術和細胞膜片技術均為近年來發展 起來的組織工程關鍵技術之一，然而單獨應用存在一定局限性，目前國內外均未見將脂肪 干細胞誘導成肌技術結合細胞膜片技術應用于肌肉修復重建研究中。
【發明內容】
[0005] 為了克服上述現有技術的不足，本發明提供了 一種成肌細胞膜片及其制備方法。
[0006] 本發明第一方面提供了一種成肌細胞膜片，所述的成肌細胞膜片為通過脂肪干細 胞定向誘導而得到的。
[0007] 較佳地，所述的成肌細胞膜片由細胞膜片技術與干細胞成肌誘導技術結合而構建 的肌分化膜片狀組織組成。
[0008] 本發明第二方面提供了上述的成肌細胞膜片的制備方法，其特征在于，包括以下 步驟：
[0009] 步驟一:將脂肪干細胞高密度地接種于細胞培養皿中；
[0010] 步驟二:在所述的細胞培養皿中加入梯度濃度維生素進行刺激，并加入5-氮雜胞 苷和馬血清誘導，得到所述的成肌細胞膜片。
[0011 ] 較佳地，所述的高密度為5 X 104個/cm2。
[0012] 較佳地，所述的步驟二中加入梯度濃度維生素進行刺激為以lOOμg/ml維生素 C強 刺激3天，更換50μg/ml維生素 C溫和刺激18天。
[0013] 較佳地，所述的步驟二中加入5-氮雜胞苷和馬血清誘導，所述的5-氮雜胞苷濃度 為lOymol/L，所述的馬血清含量為5%，誘導時間為3周。
[0014] 本發明提供的成肌細胞膜片，在具備良好機械性能同時，能夠高表達肌細胞標志 蛋白，可用于肌肉損傷及修復重建。維生素 C在細胞外基質形成過程中起著關鍵作用，可顯 著促進細胞膠原合成，形成細胞-基質連接以及細胞間連接三維立體結構，在既往報道的細 胞膜片構建中廣泛使用。5-氮雜胞苷是一種甲基轉移酶抑制劑，與控制向肌源性分化的特 異啟動子基因上阻遏蛋白結合，誘導DNA去甲基化，激活肌源性調節因子，啟動干細胞向成 肌分化。馬血清中含有促干細胞成肌分化的調節因子，與5-氮雜胞苷聯合使用促加強成肌 分化能力。因此，我們在本發明中利用維生素 C促進細胞膜片形成的同時，聯合5-氮雜胞苷/ 馬血清促進脂肪干細胞成肌分化，構建一種成肌誘導細胞膜片。該膜片表面平整，質地均 一，細胞外基質含量豐富，厚度大，具備較好抗牽拉特性，不易破裂，具有臨床應用的可操作 性，成肌確切，能自體移植。其厚度和機械性能具備可操作性，成肌確切，有望應用于肌肉損 傷修復。
【附圖說明】
[0015] 圖1為成肌細胞膜片HE染色觀察圖；
[0016]圖2A和2B為成肌細胞膜片掃描電鏡觀察圖；
[0017] 圖3為成肌細胞膜片中α-SMA和Desmin基因水平表達圖；
[0018] 圖4A和圖4B為成肌細胞膜片中a-SMA和Desmin蛋白水平表達圖；
[0019]圖5為免疫組化分析成肌細胞膜片中a-SMA和Desmin蛋白分布圖。
【具體實施方式】
[0020]下面參照附圖，結合具體的實施例對本發明作進一步地說明，以更好地理解本發 明。
[0021] 1、脂肪干細胞原代培養
[0022] 比格犬，6-8個月，戊巴比妥全身麻醉后無菌切取腹股溝處10g脂肪組織，剔除肉眼 可見筋膜及血管，0.25 %氯霉素浸泡30分鐘，PBS漂洗3遍，眼科剪盡量剪碎成肉沫狀，加入 0.1 % I型膠原酶在37°C中消化lh，100目濾網過濾，300g離心5min，加入干細胞培養基重懸 后接種于100mm細胞培養皿中繼續培養，每2-3天更換培養基。
[0023] 脂肪干細胞培養基組成:450ml低糖DMEM培養基+50ml胎牛血清+100U/ml青霉素+ 100mg/ml硫酸鏈霉素，0.22μηι濾網過濾除菌。
[0024] 2、脂肪干細胞純度鑒定
[0025]將原代培養脂肪干細胞傳代至Ρ2，流式細胞儀鑒定其干細胞純度，選取CD45、 ⑶90、⑶105作為表面抗原標志，0.25 %胰蛋白酶+0.01 %EDTA消化后4%多聚甲醛固定15分 鐘，PBS清洗2遍，300g離心5min后加入250μ1 PBS重懸，分別加入2μ1 CD45-FITC抗犬抗體、1 μL CD90-PE抗犬抗體、2μ1 CD105-FITC抗犬抗體，在4°C條件下避光孵育30分鐘，PBS清洗2 遍，上機檢測。
[0026] 3,脂肪干細胞成肌誘導膜片制備
[0027] 將P2代脂肪干細胞以5 X 104個/cm2接種于60mm細胞培養皿，待細胞融合至90 %以 上時，更換干細胞成肌誘導培養基A繼續培養，3天后更換干細胞成肌誘導培養基B連續培養 18天，每2天更換細胞培養液，培養3周即可成制備一種基于脂肪干細胞定向誘導的成肌細 胞膜片，可直接用鑷子輕輕撕下。
[0028] 干細胞成肌誘導培養基A成分:425mL低糖DMEM培養基、50mL胎牛血清、100U/mL青 霉素、100mg/mL硫酸鏈霉素 、ΙΟμΜ ΙΟμ mol/L的5-氮雜胞苷、25mL含量為5%的馬血清、100μ g/ml的維生素 C、3.7g/L NaHC03，上述培養基PH值為7.2。
[0029] 干細胞成肌誘導培養基B成分:425mL低糖DMEM培養基、50mL胎牛血清、100U/mL青 霉素、100mg/mL硫酸鏈霉素、10μΜ lOymol/L 5-氮雜胞苷、25mL含量為5%馬血清、5(^8/11^ 維生素 C、3.7g/L NaHC03，上述培養基PH值為7.4
[0030]如圖1所示，誘導培養3周后收獲膜片狀物，表面平滑，灰白樣外觀，質地均勻，具有 較好機械性能，能用鑷子提起;HE染色顯示，脂肪干細胞成肌誘導膜片由7-8層細胞構成，厚 度約100μπι，細胞之間緊密連接形成致密片狀整體。
[0031] 4、脂肪干細胞成肌誘導膜片鑒定
[0032] 1)掃描電鏡觀察細胞膜片
[0033]成肌誘導3周至細胞膜片形成后，取小于lcm2細胞膜片樣品，生理鹽水清洗3遍， 1.25 %戊二醛4 °C預固定2h，0.1M磷酸緩沖液清洗3次，每次15分鐘，1 %餓酸4 °C固定2h，酒 精梯度脫水，臨界點干燥儀中干燥約2h，雙面膠將干燥樣品粘貼于樣品臺上，噴金3分鐘，掃 描電鏡觀察。
[0034]如圖2A和2B所示，低倍鏡下（X800)觀察成肌誘導膜片表面平整，細胞排列方向一 致，融合成梭狀肌管樣細胞分布(A);高倍鏡下（X3000)細胞表面纖維蛋白和膠原大量分 布，并連接各細胞形成致密整體(B)。
[0035] 2)成肌標志基因 α-SMA和Desmin表達
[0036]本實施例所用引物信息如下：
[0039] 設置成肌誘導組和對照組，對照組未予以成肌誘導，僅單純添加維生素 C刺激形成 脂肪干細胞膜片，成肌誘導組則予以上述方法誘導3周至細胞膜片形成，Trizol提取細胞膜 片中總RNA，逆轉錄cDNA合成，cDNA合成反應體系如下：
[0041 ] 制備cDNA溶液，保存于-80°c待用。實時定量PCR反應體系配置如下：
[0043] 將配制好的PCR反應溶液置于Real-time PCR儀上進行PCR擴增反應。反應條件為： 95 °C 2分鐘預變性，然后按95 °C 30s，58 °C 30s，72 °C 30s，共做35個循環，最后72 °C 5分鐘延伸。 qPCR結果予以比較CT值法進行統計分析。
[0044] 如圖3所示，qPCR結果顯示，與對照組相比，成肌誘導細胞膜片中成肌標志基因 α_ SMA和Desmin表達顯著升高，ρ〈0.001，表明5-氮雜胞苷/馬血清誘導脂肪干細胞在基因水平 產生了顯著的成肌分化。
[0045] 3)Western_blot檢測細胞膜片α-SMA和Desmin蛋白表達
[0046] 依照上述方法成肌誘導3周至細胞膜片形成后，全蛋白提取試劑盒提取細胞膜片 中總蛋白，Lowry法測定蛋白濃度，取蛋白樣品對目的蛋白a-SMA和Desmin的表達水平進行 檢測，轉PVDF膜80V 2h后，TBST稀釋的BSA(濃度1%)封閉1 h，剪膜，加入一抗(a-SMA 1: 1000稀釋，Desmin 1:300稀釋)4°C過夜孵育，加入HRP標記二抗（1:1500稀釋)室溫孵育45分 鐘，ECL顯色系統定影顯色，觀察雜交條帶。
[0047] 如圖4A和圖4B所示，Western blot結果顯示，成肌誘導細胞膜片中成肌標志蛋白 a-SMA和Desmin高表達，而對照組中a-SMA蛋白低表達，Desmin蛋白未見表達，a-SMA蛋白相 對表達差異有統計學意義，P = 0.005。
[0048] 4)免疫組化分析細胞膜片a-SMA和Desmin蛋白表達
[0049] 依照上述方法成肌誘導3周至細胞膜片形成，設置未誘導細胞膜片作為對照組，石 蠟切片脫蠟入水，檸檬酸鈉 (PH 6.0)溶液水浴煮沸30min抗原修復，5 %BSA封閉常溫30min， 一抗(α-SMA 1:1500稀釋，Desmin 1:500稀釋)4 °C 孵育過夜，PBS 清洗5遍，HRP-二抗37 °C 孵 育3〇11^11，048(1:50)顯色15分鐘，終止后蘇木紫復染，酒精梯度脫水后中性樹膠封片。
[0050] 如圖5所示，與對照組相比，成肌誘導細胞膜片中a-SMA和Desmin蛋白免疫組化染 色強陽性表達，呈現棕黃色廣泛分布。
[0051] 本發明提供的成肌細胞膜片，在具備良好機械性能同時，能夠高表達肌細胞標志 蛋白，可用于肌肉損傷及修復重建。維生素 C在細胞外基質形成過程中起著關鍵作用，可顯 著促進細胞膠原合成，形成細胞-基質連接以及細胞間連接三維立體結構，在既往報道的細 胞膜片構建中廣泛使用。5-氮雜胞苷是一種甲基轉移酶抑制劑，與控制向肌源性分化的特 異啟動子基因上阻遏蛋白結合，誘導DNA去甲基化，激活肌源性調節因子，啟動干細胞向成 肌分化。馬血清中含有促干細胞成肌分化的調節因子，與5-氮雜胞苷聯合使用促加強成肌 分化能力。因此，我們在本發明中利用維生素 C促進細胞膜片形成的同時，聯合5-氮雜胞苷/ 馬血清促進脂肪干細胞成肌分化，構建一種成肌誘導細胞膜片。該膜片表面平整，質地均 一，細胞外基質含量豐富，厚度大，具備較好抗牽拉特性，不易破裂，具有臨床應用的可操作 性，成肌確切，能自體移植。其厚度和機械性能具備可操作性，成肌確切，有望應用于肌肉損 傷修復。
[0052]以上對本發明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為范例，本發明并不限 制于以上描述的具體實施例。對于本領域技術人員而言，任何對本發明進行的等同修改和 替代也都在本發明的范疇之中。因此，在不脫離本發明的精神和范圍下所作的均等變換和 修改，都應涵蓋在本發明的范圍內。
【主權項】
1. 一種成肌細胞膜片，其特征在于，所述的成肌細胞膜片為通過脂肪干細胞定向誘導 而得到的。2. 根據權利要求1所述的成肌細胞膜片，其特征在于，所述的成肌細胞膜片是由細胞膜 片技術與干細胞成肌誘導技術結合而構建的一種肌分化膜片狀組織。3. -種根據權利要去1所述的成肌細胞膜片的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 步驟一:將脂肪干細胞高密度地接種于細胞培養皿中； 步驟二:在所述的細胞培養皿中加入梯度濃度維生素進行刺激，并加入5-氮雜胞苷和 馬血清誘導，得到所述的成肌細胞膜片。4. 根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述的高密度為5 X IO4個/cm2。5. 根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述的步驟二中加入梯度濃度維生素 進行刺激為以l〇〇μg/ml維生素 C強刺激3天，更換50μg/ml維生素 C溫和刺激18天。6. 根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述的步驟二中加入5-氮雜胞苷和馬 血清誘導，所述的5-氮雜胞苷濃度為lOwnol/L，所述的馬血清含量為5%，誘導時間為3周。
【文檔編號】C12N1/38GK105950547SQ201610343196
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月20日
【發明人】傅強, 周術奎
【申請人】上海市第六人民醫院