一種空間葡萄球菌lct-h4的制作方法
【專利摘要】一種空間葡萄球菌LCT?H4，更具體的說是一種太空微生物，運用空間技術從“神舟九號”飛船返回艙內部冷凝水分離獲得。其特征：化學異養革蘭陽性菌，有菌毛，與琥珀葡萄球菌Staphylococcus succinus親緣關系最近，對環氧樹脂等5種高分子材料具有腐蝕能力。LCT?H4全基因組序列總長2.78Mbp，具有2,562個蛋白編碼基因和27個RNA基因。其中334個蛋白注釋為 “一般功能預測”，260個蛋白為“氨基酸轉運和代謝”，186個蛋白為“糖轉運和代謝”，176個蛋白為“無機鹽離子轉運和代謝”，167個蛋白為“轉錄”，145個蛋白為“翻譯、核糖體結構和形成”，206個蛋白為“未知功能”。CGMCC No.1257220160601
【專利說明】
一種空間葡萄球菌LCT-H4
技術領域
[0001 ]本發明屬于微生物及生物技術領域，涉及一種新的微生物菌株葡萄球菌LCT-H4以 及其生物學特性、基因組DNA序列，利用生物信息學技術進行了組學分析，獲得其在基因組 的特性。
【背景技術】
[0002] 在隨著人類空間探索活動的日益頻繁，宇宙空間成為了人類活動的一個重要領 域。太空密閉艙中存在著特定的微生物群落。雖然每一件物品都經過了嚴格消毒，微生物仍 會隨航天員身體、人體分泌物、航空部件等進入太空，并在航天器密閉艙室內形成特定微生 物群落，既包括無害微生物，也包括一些致病性和腐蝕性微生物。"和平"號運行十余年來空 間站內檢測到234種微生物。太空密閉艙內的特殊環境因素，包括微重力、弱磁場和粒子輻 射等，使得微生物會產生變異，導致它們對生存環境的要求很低，更加容易生長和繁殖，某 些微生物的腐蝕性會增強。太空密閉艙中腐蝕性微生物的大量繁殖，使得各種航天材料逐 漸產 生腐蝕，加速航天器件的降解耗損，將可能導致空間站內的設備運行失靈，影響航天器 的長期正常運行及其在軌使用壽命，甚至對飛行安全也會造成很大威脅。航天器服役條件 惡劣，在軌時間長，而維修條件相對不足，一旦發生微生物腐蝕設備故障，損失不可估量。國 外載人航天器在軌經驗和國內地面研究的初步結果表明，微生物會嚴重威脅航天設備安 全。開展長期太空密閉艙中微生物對航天器材腐蝕的機理及防控措施研究，深化對載人航 天器中微生物風險的認識和加強相關技術儲備，探索更加有效的載人航天器微生物綜合控 制措施，為載人航天器的研制和運營提供技術支撐。
[0003] 針對空間環境下微生物材料腐蝕研究，目前尚無葡萄球菌的相關報道。
【發明內容】
[0004] 在本發明的目的在于提供一種空間葡萄球菌LCT-H4。對空間菌株進行表型檢測， 然后對其進行全基因組測序，闡明該細菌的特性及用途。
[0005] 本發明提供的菌株葡萄球菌LCT-H4,其保藏號為CGMCC 12572。
[0006] 所述的葡萄球菌LCT-H4,革蘭陽性菌，具有菌毛，與琥珀葡萄球菌Staphylococcus succinus親緣關系最為相近。對環氧樹脂、酯類聚氨酯、醚類聚氨酯、硫化天然橡膠和 聚乙烯醇聚縮醛5種高分子材料具有腐蝕能力。
[0007] 所述的葡萄球菌LCT-H4，全基因組序列總長度為2.78Mbp，GC含量為33.8%，具有2， 562個蛋白編碼基因和27個RNA基因。其中2302個蛋白被分類注釋為21類C0G家族，其中334 個蛋白注釋為"一般功能預測"，260個蛋白注釋為"氨基酸轉運和代謝"，186個蛋白注釋為 "糖轉運和代謝"，176個蛋白注釋為"無機鹽離子轉運和代謝"，167個蛋白注釋為"轉錄"， 145個蛋白注釋為"翻譯、核糖體結構和形成"，206個蛋白注釋為"未知功能"，以及其他。
【附圖說明】
[0008] 圖1葡萄球菌LCT-H4的革蘭氏染色。
[0009] 圖2葡萄球菌LCT-H4進化樹。
[0010] 圖3葡萄球菌LCT-H4在不同瓊脂濃度平板表面的菌落擴散。
[0011] 圖4葡萄球菌LCT-H4在透射電鏡下的特殊結構形態觀察。
[0012] 圖5葡萄球菌LCT-H4的biolog生化特征。
[0013] 圖6葡萄球菌LCT-H4在環氧樹脂為唯一碳源培養條件下增長曲線。
[0014]圖7葡萄球菌LCT-H4對環氧樹脂腐蝕的SEM觀察。
[0015] 圖8葡萄球菌LCT-H4在酯類聚氨酯為唯一碳源培養條件下增長曲線。
[0016] 圖9葡萄球菌LCT-H4對酯類聚氨酯腐蝕的SEM觀察。
[0017] 圖10葡萄球菌LCT-H4在醚類聚氨酯為唯一碳源培養條件下增長曲線。
[0018] 圖11葡萄球菌LCT-H4對醚類聚氨酯腐蝕的SEM觀察。
[0019]圖12葡萄球菌LCT-H4在硫化天然橡膠為唯一碳源培養條件下增長曲線。
[0020]圖13葡萄球菌LCT-H4對硫化天然橡膠腐蝕的SEM觀察。
[0021]圖14葡萄球菌LCT-H4在聚乙烯醇縮甲醛為唯一碳源培養條件下增長曲線。
[0022] 圖15葡萄球菌LCT-H4對聚乙烯醇縮甲醛腐蝕的SEM觀察。
[0023] 圖16葡萄球菌LCT-H4的C0G功能分析和G0分析。
【具體實施方式】
[0024] 下述實施實例中所用的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。
[0025] 下述實施實例中所用的材料、試劑，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。
[0026] 一、葡萄球菌LCT-H4的表型 1.菌株來源:對"神舟九號"飛船返回艙內部的冷凝水進行了微生物的采集，選用細菌 培養基對樣品進行初篩，然后挑取菌落形態不同的單菌落進行劃線培養，純化到單一菌株 后，使用生理鹽水加80%甘油保藏菌種。菌株命名為葡萄球菌LCT-H4,保存于中國普通微生 物菌種保藏中心，保藏號為CGMCC 12572。
[0027] 2.葡萄球菌LCT-H4菌株16s rDNA鑒定：16S rDNA是16S rRNA序列的基因，長約 1.5kb。將已分純的單菌直接經菌液PCR擴增16S rDNA，部分通過菌液PCR較難擴增的單菌經 擴大培養后提取基因組后擴增，擴增所用引物序列如下： SgF： AGAGTTTGATCATGGCTCAG SgR： TAGGGTTACCTTGTTACGACTT 16S rDNA PCR產物用96孔millpore純化系統純化后準確定量，經ABI 3730x1全自動序 列分析儀測序，測序結果使用Sequence scanner、Seqman等序列分析軟件，將兩向測序結果 去掉首尾不可信序列后拼接，余下的約1350bp(雙向測序）即用于同源性分析。所得16S rDNA序列在Eztaxon server 2.1數據庫中進行比對，確定菌株大致的分類地位。所有單菌 16S序列全部導入seqman，輸出single file(fasta)后，經Mega 5 · 0軟件clusterW多重比 對，輸出meg文件重新導入構建Neighbor-Joining tree。其中，phylogeny test method為 bootstrap參數設置為1000。16s rDNA鑒定結果顯示LCT-H4與琥珀葡萄球菌 Staphylococcus succinus的相似性為99%(圖2)。
[0028] 3.形態學及運動表型：LCT-H4樣品進行稀釋涂布，進行革蘭氏染色。葡萄球菌 LCT-H4為革蘭氏陽性桿菌，菌體單個、成雙或成葡萄串狀排列（圖1)。將LCT-H4單菌落接種 至不同瓊脂濃度平板上觀察菌落的擴散，并用透射電鏡觀察鞭毛、菌毛。葡萄球菌LCT-H4在 軟瓊脂上有明顯的擴散(圖3);透射電鏡下H4觀察到菌毛（圖4)。
[0029] 4.生化代謝(Biolog)實驗:過夜培養葡萄球菌LCT-H4,離心收集菌體后，用接種 液(IF)懸浮菌體配成指定濃度的菌懸液。將菌懸液按每孔100μΙ的量加入Biolog96孔板中， 37°C孵育24h。孵育后，通過顯紫色孔所產生的表型指紋同Biolog數據庫中的數據進行比較 (見圖5)。該菌株生化代謝如表1。
[0030] 表1葡萄球菌LCT-H4的biolog生化特征
注:+陽性，表示LCT-H4可利用該底物生長;+/-弱陽性，表示LCT-H4可部分利用該底 物生長。
[0031] 5.腐蝕性實驗:選擇航天器已采用的5種高分子材料環氧樹脂、酯類聚氨酯、醚類 聚氨酯、硫化天然橡膠和聚乙烯醇聚縮醛為葡萄球菌LCT-H4腐蝕特性研究對象。
[0032]分別以這5種高分子材料為唯一碳源對菌株LCT-H4進行培養，在不同時間點進行 取樣并測定培養液在600 nm波長下的吸光度(0D600)，以判斷細菌利用單一高分子材料作 為唯一碳源的生長情況。具體操作如下：向100 mL無菌三角燒瓶中倒入40 mL無機鹽基礎培 養基，每個培養瓶中加入10個高分子材料試樣，接種5 mL菌懸液，透氣膜封口，放入32 °C，相 對濕度為75%的恒溫培養箱中。每株菌和每個材料準備3個平行樣品。設置4個時間點：1、3、 6、10周取樣。測定各個時間點培養液600 nm波長下的吸光度，判斷細菌利用高分子材料作 為唯一碳源的生長情況。結果（圖6、8、10、12、14)表明在1至10周內，菌株^：1'-!14的00600均 大于對照菌株，具有明顯的增長現象。
[0033]高分子材料表面微生物膜和腐蝕形態SEM觀察：將環氧樹脂膜加工成尺寸為10mm (直徑）X0.5mm(厚度)圓片;醚類聚氨酯、酯類聚氨酯泡沫和聚乙烯醇縮甲醛泡沫分別加工 成10 mm(長）X 10 mm(寬）X5mm(厚度）的小方塊;硫化橡膠膜加工成尺寸為6mm(直徑）X 0.5mm(厚度）圓片;所有樣品用丙酮浸泡1天，5%乙醇/水溶液中15min滅菌，無菌水清洗至 中性。將培養的菌株LCT-H4分別接種至5種高分子材料膜表面，在不同時間點對高分子材料 膜表面用掃描電子顯微鏡（SEM)進行觀察，如圖7、9、11、13、15所示，1至10周內菌株LCT-H4 能在5種高分子材料膜表面形成微生物膜，說明菌株LCT-H4具有降解和腐蝕5種高分子材料 的潛力。
[0034] 二、空間葡萄球菌LCT-H4全基因組測序 采用高通量Solexa測序技術對該樣品的DNA進行Paired-End測序。首先提取細菌的基 因組DNA，離心方法收集葡萄球菌LCT-H4菌體，經過重懸、裂解、酚氯仿抽提、異丙醇沉淀、 75%乙醇洗滌、RNase去除RNA和溶解基因組DNA等步驟獲得LCT-H4的基因組DNA，并檢測其純 度使之符合建庫指標。采用超聲法Covaris將大片段基因組DNA隨機打斷并產生一系列DNA 片段；然后用T4 DNA Polymerase、Klenow DNA Polymerase和T4 PNK將打斷形成的粘性末 端修復成平末端，再通過3'端加堿基"A"，使得DNA片段能與3'端帶有"T"堿基的特殊接頭 連接，用電泳法選擇需回收的目的片段連接產物，再使用PCR技術擴增兩端帶有接頭的DNA 片段;建立300bp的小片段文庫。對測序得到的原始數據進行過濾及統計;運用SOAP denovo ￥1.05軟件和3(^?&1181^以8〇&?2軟件對處理后的^&(18數據進行組裝。并對基因組和基因 區覆蓋度進行評價;采用GlimmeU.O軟件從組裝結果中獲得基因序列并將基因的序列與各 數據庫進行比對，得到對應的功能注釋信息。LCT-H4的全基因組序列總長度為2.78Mbp，GC 含量為33.8%，具有2,562個蛋白編碼基因和27個RNA基因。其所含蛋白中的2302個蛋白被分 類注釋為21類C0G家族，其中334個蛋白注釋為"一般功能預測"，260個蛋白注釋為"氨基酸 轉運和代謝"，186個蛋白注釋為"糖轉運和代謝"，176個蛋白注釋為"無機鹽離子轉運和代 謝"，167個蛋白注釋為"轉錄"，145個蛋白注釋為"翻譯、核糖體結構和形成"，206個蛋白注 釋為"未知功能"，以及其他(圖16)。
[0035]本發明的特點和應用價值:本研究是我國第一次利用自己研發的空間技術獲得對 常用航天高分子材料具有腐蝕性的太空艙定植葡萄球菌LCT-H4,為研究載人航天器微生物 腐蝕提供了寶貴的樣本。同時，我們對這一分離菌進行了全基因組測序，其序列已經測通， 從而為更好地揭示其腐蝕機制打下了堅實的基礎。本研究有助于長期太空密閉艙中微生物 對航天器材腐蝕的機理及防控措施研究，有助于深化對載人航天器中微生物風險的認識和 加強相關技術儲備，有助于探索更加有效的載人航天器微生物綜合控制措施，從而為載人 航天器的研制和運營提供技術支撐。
[0036] 關于保藏的LCT-H4菌株說明 A. 菌種的保藏單位名稱和地址 名稱：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 地址:北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所 B. 交機構保藏的日期 2016年6月1日 C. 保藏機構給予的保藏號 CGMCC No.12572 D. 分類命名 葡萄球菌 Staphylococcus sp.〇
【主權項】
1. 一種空間葡萄球菌LCT-H4，其特征在于:保藏號為CGMCC 12572。2. 根據權利要求1所述的葡萄球菌LCT-H4，其特征在于:革蘭陽性菌，具有菌毛，與琥珀 葡萄球菌Staphylococcus succinus親緣關系最為相近;對環氧樹脂、酯類聚氨酯、醚類聚 氨酯、硫化天然橡膠和聚乙烯醇聚縮醛5種高分子材料具有腐蝕能力。3. 根據權利要求1所述的葡萄球菌LCT-H4,其特征在于：LCT-H4的全基因組序列總長 度為2.78Mbp，GC含量為33.8%，具有2，562個蛋白編碼基因和27個RNA基因。4. 根據權利要求1所述的葡萄球菌LCT-H4,其特征在于:其所含蛋白中的2302個蛋白被 分類注釋為21類COG家族，其中334個蛋白注釋為"一般功能預測"，260個蛋白注釋為"氨基 酸轉運和代謝"，186個蛋白注釋為"糖轉運和代謝"，176個蛋白注釋為"無機鹽離子轉運和 代謝"，167個蛋白注釋為"轉錄"，145個蛋白注釋為"翻譯、核糖體結構和形成"，206個蛋白 注釋為"未知功能"。
【文檔編號】C12R1/44GK105950515SQ201610456293
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月22日
【發明人】劉長庭, 張學林, 姜學革, 方向群, 郭英華, 王俊峰, 李天志, 周宏 , 潘磊, 徐綢, 黃兵, 余昳
【申請人】中國人民解放軍總醫院