一株降解多環芳烴類有機污染物的泛菌的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一株降解多環芳烴類有機污染物的泛菌屬(Pantoea sp.)PYR16，屬于微生物和環境有機污染物修復治理領域，該菌株保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為：CCTCC NO：M2016227。本發明所公開的菌株能高效降解多種多環芳烴，具有廣泛的環境適應和抗重金屬能力，可定植于惡劣的環境中修復被重金屬和多環芳烴復合污染的土壤或水體。CCTCC NO：M201622720160426
【專利說明】
一株降解多環芳烴類有機污染物的泛菌
技術領域
[0001] 本發明屬于微生物和環境有機污染物修復治理領域，具體涉及一株降解多環芳烴 類有機污染物的泛菌(Pantoea sp.)，本發明還涉及該泛菌的應用以及一種降解多環芳烴 類有機污染物的方法。
【背景技術】
[0002] 多環芳烴(簡稱PAHs)是指一類由兩個或兩個以上苯環以線狀、角狀或簇狀排列的 稠環碳氫化合物，其中具有4個苯環及4以上的PAHs稱之為高分子量多環芳烴（High molecular weight-PAHs,簡稱HMff-PAHs)。多環芳經的來源主要包括兩個方面:一方面是自 然界自身的活動，如森林火災、動植物遺體腐爛、石油煤炭形成、火山噴發等;另外一個方面 是人類污染行為，如化石燃料的不完全燃燒、城市固體廢棄物的焚燒、石油開采、加工運輸 以及化工生產和汽車尾氣的排放等。人類活動向環境貢獻了絕大多數的多環芳烴污染，是 公認的環境多環芳烴主要污染來源。多環芳烴通常存在于石化產品、橡膠、塑料、潤滑油、防 銹油以及不完全燃燒的有機化合物等物質中，它可以通過大氣和水體的流動，發生長距離 迀移，因此廣泛分布在大氣、土壤、水體、沉積物以及植物等各種環境介質中。由于多環芳經 水溶性低、吸附性強、半衰期長，使其可以持續存在于環境中數年，通常隨著芳環數和分子 量的增大，其生物可利用性越差，因此修復高分子量多環芳香相較于低分子量多環芳香烴 更加困難。多環芳烴的脂溶性使其可以通過食物鏈逐級富集到處于食物鏈末端人的體內， 并分散到體內組織，通過蛋白質酮-稀醇互變異構過程中的催化作用，導致蛋白的不可逆轉 變，進而使細胞發生癌變。因此對人類健康和生態系統造成巨大威脅，多環芳經的污染修復 是國內外的研究熱點。
[0003] 傳統的多環芳烴污染的修復主要是依賴物理化學修復(化學氧化、客土或翻土法、 汽提、熱解吸、焚燒、填埋等方法去除或固定土壤中的污染物），這些方法往往處理成本高、 修復不徹底、容易產生二次污染而且不適合大規模應用。另外，在自然界中單種污染物構成 的環境污染雖時有發生，但事實上絕對意義上的單一污染是不存在的，污染多具伴生性和 綜合性即多種污染物形成的復合污染，由于重金屬和多環芳烴一樣能夠持續存在于土壤環 境中，因此重金屬-多環芳烴復合污染是土壤污染的主要形式。
[0004] 生物修復是利用微生物來修復污染物，它不僅克服了物理化學修復處理成本高、 修復不徹底等缺陷，而且不會產生二次污染，對污染物具有修復效果的微生物菌劑也適合 大規模應用。微生物修復的實質是利用土壤微生物專一性代謝土壤中的有機污染物，將其 轉化為細胞其它碳基大分子和二氧化碳的過程。因此有機污染物微生物修復技術的核心是 代謝速度快，環境適應性強的降解菌的篩選。而直接從環境中富集篩選土著微生物，不僅有 效避免了基因工程菌在實際應用中發生的生物安全性問題，而且還是一種簡單方便理想的 技術手段。目前人們已經從各類生態環境中篩選獲得一批多環芳烴降解菌，包括假單胞菌 (Pseudomonas)、節桿菌（Arthrobacter)、紅球菌（Rhodococcus)、分枝桿菌 (Mycobacterium)、芽抱桿菌（Bacillus)、鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas )、氣單胞菌 (Aeromonas)、拜葉林克氏菌（Beijerinckia)、擬諾卡氏菌（Nocardioides)、解環菌 (Cycloclasticus)、伯克氏菌(Burkholderia)、叢毛單胞菌(Polaromonas)以及一些嗜熱厭 氧的菌屬如嗜油菌(Neptunomonas)、兩面神菌(Janibacter)、諾卡氏菌(Nocardia)、變性菌
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種降解多環芳烴類有機污染物的泛菌。
[0006]
【申請人】從石油污染的土壤中分離獲得一株能夠快速降解多環芳烴類污染物的菌 株，通過生理生化鑒定和核糖體16S rDNA基因序列分析將其鑒定為泛菌屬(Pantoea sp.)， 命名為?3111:〇63 8口.？￥1?16。該菌株已于2016年4月26日送交位于湖北省武漢市武漢大學內 的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號為:CCTCC Ν0:Μ 2016227。
[0007] 試驗結果表明：
[0008] 1)該菌株具有對芘的高效降解能力，而且能降解高濃度的芘。
[0009] 2)該菌株在pH為6-10范圍內，對芘的降解效果最好，因此適合弱酸性到堿性環境 條件下的多環芳烴污染物去除。
[0010] 3)該菌株具有廣泛的NaCl濃度適應能力。
[0011] 4)該菌株具有廣泛的溫度適應能力，更適合低溫條件下的多環芳烴有機污染物的 清除，有利于在我國一年四季和北方地區開展土壤原位修復。
[0012] 5)該菌株能夠在較大范圍內耐受重金屬的毒害作用，維持對多環芳烴類污染物的 高效降解，具有重金屬-多環芳烴復合污染環境修復的能力。
[0013] 6)該菌株對多種PAHs如菲、芴、焚蒽、花有良好的降解功能，特別是對于4環及4環 以下的多環芳香烴降解效果顯著，這有利于該菌應用于復合污染物污染嚴重的地區。
[0014] 7)該菌株具有廣泛的抗重金屬能力，這有利于該菌定植于惡劣的環境中修復被重 金屬和多環芳烴復合污染的土壤或水體。
[0015] 更詳細的技術方案見《具體實施方案》所述。
【附圖說明】
[0016] 圖1是菌株PYR16在200mg/L芘濃度下的生長和降解曲線。
[0017] 圖2是菌株PYR16對不同起始芘濃度的降解曲線。
[0018] 圖3是菌株PYR16在不同pH條件下對芘的降解能力。
[0019] 圖4是菌株PYR16在不同鈉離子濃度條件下對芘的降解能力。
[0020] 圖5是菌株PYR16在不同溫度條件下對芘的降解能力。
[0021] 圖6是菌株PYR16對不同重金屬離子存在條件下對芘的降解能力。
[0022]圖7是菌株PYR16對不同種類多環芳香烴的降解能力。
【具體實施方式】
[0023]以下結合實施例對本發明進行詳細地說明。應該說明的是，本發明的實施例僅限 于對于本發明進行說明，而沒有限制作用。實施例中所涉及的有關篩選方法、緩沖液配制和 常見培養基配方等可參照趙斌，何紹江主編的《微生物學實驗》以及《分子克隆實驗指南》所 描述的內容(參見J.薩姆布魯克等，2002,分子克隆實驗指南，第三版，金冬雁等(譯），科學 出版社，北京）。本發明中所涉及的其他各種實驗操作，均為本領域的常規技術，文中沒有特 別說明的部分，本領域的普通技術人員可以參照本發明申請日之前的各種常用工具書、科 技文獻或相關的說明書、手冊等予以實施。
[0024]實施例1PYR16菌株的分離鑒定
[0025]采用來自長慶油田長期受石油污染的土壤為篩選土壤，具體篩選方案如下：
[0026] 1)取10g 土壤，加入到含有200mg//L芘的無機鹽培養基MSM中，28°C震蕩培養15天， 再以10%的接種量接到上述含有200mg/L芘的無機鹽培養基MSM培養基中；連續轉接5次。 [0027] 2)取0.1ml步驟1)所得到的富集培養液，涂布到含芘的MSM固體平板上，28 °C靜止 培養15天后，將平板上長出來的菌落轉接到含芘的MSM固體平板上，繼續培養生長，直到平 板上出現單一的菌落。
[0028] 3)挑取含芘的MSM固體平板上生長出來的單菌落，接種到含有200mg//L芘的MSM液 體培養基中，28 °C震蕩培養15天，獲得本發明的菌株。
[0029] 進一步對菌株進行了形態學和分子生物學鑒定。
[0030] 首先，對菌株的形態學特征進行了初步的觀察，結果表明，該菌株為革蘭氏陰性 菌，短桿狀。
[0031] 同時，發明人分離獲得菌株的基因組DNA，然后以細菌16S rRNA基因的通用引物 27F和1492R引物對DNA進行PCR擴增;將獲得的PCR擴增產物進行測序，其測序結果如序列表 SEQ ID NO: 1所示。然后，利用NCBI核酸數據庫，根據菌株16S rRNA基因序列進行了BLAST分 析，結果表明菌株的16S rRNA基因序列與泛菌屬的同源性高達99%，結合革蘭氏染色和形 態學觀察，發明人將該菌株命名為Pantoea sp. PYR16。
[0032] 實施例2PYR16菌株對芘的降解特征
[0033]以芘為唯一碳源，利用MSM培養基為基礎培養基，發明人對PYR16菌株對芘的降解 能力進行了測試。首先，從-80°C取出保藏的菌株，然后接種到R2A固體培養基中活化1天;挑 取單菌落接種到5毫升R 2A液體培養基中培養至0D6QQ = 0.5;然后取0.5ml菌液接種到25ml含 有200mg//L的芘的MSM培養基中，置于28°C震蕩培養。上述降解體系中，PYR16菌株的接入量 約為10 5-106左右。每隔24小時取出一瓶培養物，分別測定OD600值，并利用丙酮/正己烷（1:1) 萃取三角瓶中所有殘留的芘，然后利用GC-FID進行芘含量分析。每次取三瓶進行平行分析。 [0034]如圖1所示，接種PYR16菌株后第15天，培養基中的芘被降解70%以上，到第20天， 降解體系中82%以上的芘都被完全去除。這充分說明本發明所提供的菌株具有快速、徹底 去除芘的能力。
[0035]進一步的，發明人測試了PYR16菌株對不同起始濃度的芘的降解速率和降解效果。 如圖2所示，低濃度的芘（小于200mg/L)，PYR16菌株20天即可降解芘達80%以上；而當起始 芘濃度提高到800mg/L的時候，接種PYR16菌株后20天即可完成約80%以上的去除率。這表 明，本發明所提供的PYR16菌株具有快速去除高濃度芘的能力。
[0036]實施例3pH、鈉離子和溫度對PYR16菌株芘降解能力的影響 [0037]首先將MSM培養基用鹽酸或氫氧化鈉溶液調整為pH分別為4、5、6、7、8、9、10，然后 按照實施例2的操作方法接種105-106左右的PYR16菌株，28°C震蕩培養10天后分析培養體系 中殘留芘的濃度。如圖3所示，在pH為6-10范圍內，PYR16菌株均能夠維持對芘的降解效果， 但是當pH低于6的時候，其降解能力將得到顯著抑制。因此，本發明所提供的芘降解菌的合 適處理環境的pH應該調整為6-10之間，并且，當處理樣品的pH調整為6-10的時候，PYR16菌 株都能維持對芘物質的34%以上的降解效率。因此本發明所提供菌株適合弱酸性到堿性環 境條件下的多環芳烴污染物去除。
[0038]類似的，發明人在上述MSM培養基中添加 NaCl，使其濃度分別為0 %、1%、2 %、3 %、 4%、5%、6%、7%、8%，然后按照實施例2的操作方法接種105-106左右的PYR16菌株，28°C震 蕩培養10天后分析培養體系中殘留芘的濃度。如圖4所示，當培養體系中的NaCl濃度小于 3%的時候，降解率可以維持在35%以上；當NaCl濃度提高至丨」8%左右的時候，PYR16對芘的 降解率仍然維持在30 %左右。
[0039]此外，發明人按照實施例2的操作方法接種105-106左右的PYR16菌株，然后分別置 于4°C、16°C、28°C、37 °C、42°C震蕩培養10天，然后分析培養體系中殘留芘的濃度。如圖5所 示，在28 °C、37 °C培養溫度下，PYR16菌株對芘的降解速率能夠維持在65 %以上，其中37 °C的 培養溫度下，上述菌種能夠維持最佳降解效果;而一旦溫度提升到42°C，其降解效率將下降 到60%左右。這表明本發明所提供的PYR16菌株生長適應溫度較廣且更適合低溫條件下的 環境芘污染物的清除，這將有利于在我國一年四季和北方地區開展土壤芘污染原位修復。 [0040]實施例4重金屬離子對PYR16的芘降解效果的影響
[00411按照實施例2所述接種方法，將PYR16接種到含有200mg//L芘的MSM培養基中，同時 分別加入150mg/L硫酸錳、75mg/L硫酸錳、250mg/L硫酸銅、125mg/L硫酸銅，28°C震蕩培養21 天后，分別分析降解體系中殘留的芘的濃度。如圖6所示:75mg/L的硫酸錳對于PYR16菌株的 芘降解能力幾乎沒有抑制，而150mg/L的硫酸錳存在條件下，PYR16對200mg/L芘的降解率接 近40 %左右;而PYR16降解能力受到硫酸銅的影響更大，在125mg/L硫酸銅存在條件下，菌株 PYR16菌株仍然能夠維持25%左右的降解率，而當硫酸銅濃度提高到250mg//L的時候，其降 解率下降到16%左右。這表明本發明所提供的PYR16菌株能夠在較大范圍內耐受重金屬的 毒害作用，維持對多環芳烴類污染物的高效降解能力，具有重金屬-多環芳烴復合污染環境 修復的能力。
[0042] 實施例5PYR16菌株對不同種類PAHs的降解效果
[0043]按照實施例2所述接種方法，將PYR16分別接種到含有200mg/L菲、200mg/L芘、 200mg/L芴和200mg/L熒蒽的MSM培養基中，28°C震蕩培養一周后，分別分析降解體系中殘留 的芘的濃度。如圖7所示:在相同的培養條件下PYR16對菲的降解率達到了98%以上，幾乎將 菲降解完全，對芴和芘的降解效果也比較好，降解率分別達到了 60%和35%，而對于生物可 利用性極低的熒蒽也降解了 23%，這也進一步說明了多環芳香烴苯環數的增加其對生物的 毒性越大，降解過程會更加復雜，降解周期也會相對較長。總體來說菌株PYR16對多種PAHs 有良好的降解功能，特別是對于4環及4環以下的多環芳香烴降解效果顯著，這有利于該菌 應用于復合污染物污染嚴重的地區。
[0044] 實施例6PYR16菌株對不同種類重金屬離子抗性
[0045]從_80°C取出保藏的菌株，然后接種到R2A固體培養基中活化1天;挑取單菌落接種 到5毫升R2A液體培養基中培養至0D6QQ = 0.5。在2毫升滅菌離心管中分別配置含有50mg/L、 100mg/L、150mg/L、200mg/L、250mg/L五個濃度梯度的重金屬溶液(配置液為：10*10 6的重金 屬母液和R2A培養基），然后將培養好的PYR16菌液按照2%的接種量接入該種重金屬溶液 中，置于28°C搖床培養，每兩天觀察一次并記錄其生長狀況。由下表1可知PYR16對MnCl2和 CuS〇4有較大耐受能力，在分別含有150mg/LMnCl2和250mg/LCuS〇4的培養基中仍然能生長， 其對K 2Cr〇4和Cd(N03)2的最大抑制生長濃度也有100mg/L，這能與不同重金屬對與PYR16代 謝有機物相關酶系的作用機制不同有關。表明該菌株具有廣泛的抗重金屬能力，這有利于 該菌定植于惡劣的環境中修復被重金屬和多環芳烴污染的土壤或水體。
[0046]表1菌株PYR16在不同重金屬濃度下的生長情況
[0048] 注:+能生長;一不能生長。
【主權項】
1. 一株降解多環芳烴類有機污染物的泛菌屬(Pantoea sp. )PYR16，其特征在于:保藏 在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為:CCTCC N0:M 2016227。2. 權利要求1所述的泛菌屬PYR16在降解多環芳烴類有機污染物中的應用。3. 根據權利要求2所述的應用，其特征在于：所述多環芳烴類有機污染物為菲、芴、熒 蒽、芘。4. 一種降解多環芳烴類有機污染物的方法，包括向被污染的樣品中接種權利要求1所 述的泛菌屬PYR16的步驟。5. -種用于降解多環芳烴類有機污染物的微生物菌劑，其活性成分為權利要求1所述 的泛菌屬PYRl 6。
【文檔編號】B09C1/10GK105950501SQ201610325152
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月17日
【發明人】黃巧云, 陳雯莉, 汪豪杰, 汪方奎, 李偲, 胡甜, 楊陽
【申請人】華中農業大學