一種生產豬細小病毒vp2蛋白的重組菌株的制作方法
【專利摘要】本發明的目的是提供一種生產豬細小病毒VP2蛋白的重組菌株，本發明提供的表達豬細小病毒VP2蛋白的巴斯德畢赤酵母菌X33?VP2，其保藏編號為CCTCC NO:M 2016098。本發明構建了帶有豬細小病毒VP2蛋白基因的高效表達載體，獲得了在畢赤酵母菌中的高效表達豬細小病毒VP2蛋白的重組菌株，該表達產物為可溶性蛋白。這為工業化生產豬細小病毒亞單位疫苗奠定了堅實的基礎。CCTCC NO: M 201609820160309
【專利說明】
一種生產豬細小病毒VP2蛋白的重組菌株
技術領域
[0001] 本發明屬于分子生物學和生物技術領域，特別涉及一種生產豬細小病毒VP2蛋白 的重組菌株及其應用。
【背景技術】
[0002] 豬細小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是引起母豬繁殖障礙的重要病原之一，可 導致母豬流產、早產、產死胎、木乃伊胎、弱仔及母豬不育和新生仔豬大量死亡。我國自20世 紀80年代后相繼從各地分離到PPV，經調查發現一些豬群中該病的血清學陽性率可達85% 以上。PPV常呈隱性感染存在，尤其是低劑量持續感染的現象經常發生。該病毒除引起母豬 的繁殖障礙，還可與其他病原體協同作用引起多種疾病，給養豬業造成很大的經濟損失。豬 細小病毒血清型單一、具有較高的免疫原性，疫苗接種是控制PPV感染的有效措施。
[0003]完整的病原體含有許多抗原，但并非所有抗原都能刺激宿主產生保護性應答。其 中某些抗原還能引起過敏，免疫抑制和其他副作用，這是使用完整的病原體做疫苗的缺陷。 并且目前國內應用的滅活苗生產制備抗原過程繁瑣，而弱毒疫苗現也有接種疫苗發病情況 存在。而用亞單位疫苗則可以解決這個問題，尤其是這種疫苗除了具有抗原穩定性高，純度 高，特異性強，敏感性高，不產生其他不相關抗體，免疫效果檢測方法方便準確外，還十分易 于生產。不用動物體或是胚體生產，不會帶有組織殘留物，但安全性高。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一種生產豬細小病毒VP2蛋白的重組菌株及其應用，為大規 模工業化生產中能生產出高效、安全、價廉的優良亞單位疫苗和診斷試劑服務。
[0005] 本發明提供的表達豬細小病毒VP2蛋白的巴斯德畢赤酵母菌X33_VP2(Pichia pastoris X33-VP2)，已經于2016年3月9日保藏于位于中國武漢、武漢大學的中國典型培養 物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:Μ 2016098。
[0006] 將上述豬細小病毒VP2蛋白基因克隆入帶有高效表達Α0Χ啟動子的畢赤酵母菌中， 在甲醇的作用下，豬細小病毒VP2蛋白獲得高效表達。
[0007] 上述方法中所述的誘導劑為終濃度0.55%的甲醇，所生產的豬細小病毒VP2蛋白， 其分子量約為64kD。
[0008] 本發明構建了帶有豬細小病毒VP2蛋白基因的高效表達載體，獲得了在畢赤酵母 菌中的高效表達豬細小病毒VP2蛋白的重組菌株，該表達產物為可溶性蛋白。這為工業化生 產豬細小病毒亞單位疫苗奠定了堅實的基礎。
【附圖說明】
[0009] 圖1是本發明實施例豬細小病毒VP2蛋白基因 PCR的擴增鑒定圖，
[0010]圖2是本發明的VP2蛋白的blast比較圖；
[0011]圖3是本發明實施例重組菌發酵誘導表達產物SDS-PAGE電泳檢定圖。
【具體實施方式】
[0012]下面結合附圖對本發明的實施例進行具體說明。
[0013] 實施例1:豬細小病毒(PPV)VP2基因的篩選
[0014] 2010年在山東省多個養殖場出現了豬細小病毒病的癥狀，而發病個體豬之前已經 注射了已有的細小病毒疫苗，推測感染的病毒發生了變異；因此從發病個體中進行豬細小 病毒的篩選;最終篩選出了豬細小病毒PPV1。
[0015] 為驗證篩選的病毒的抗原性，使用了包含篩選的PPV1毒株在內的5個不同來源的 病毒株作為抗原制備疫苗，免疫SPF豬后用篩選的病毒液進行攻毒實驗，結果表明相比于其 它豬細小病毒疫苗，其本身制備的疫苗具有更好的免疫效果(P<〇.05)，因此確定其發生了 遺傳上的變異。
[0016] 根據豬細小病毒VP2蛋白的抗原特性和氨基酸序列，設計合成一對引物，primer 1:5 ' -GCGGTACCATGTCTGAAAATGTTGAAGAAC-3 '，含ΚρηΙ位點；
[0017] primer 2:5'-GCGGCCGCCTAATATAATTTTCTTGGAAT-3'，含Notl位點。取PPV株病毒基 因作為模板，PCR擴增目的片段，產物回收連接PMD18-T載體，轉化和篩選陽性克隆pMD18-T-VP2,經序列測定（圖1為豬細小病毒VP2基因 PCR的擴增鑒定圖）；其核苷酸序列為SEQ ID N0:2,編碼的蛋白的序列為SEQ ID N0:1。與NCBI中公開的豬細小病毒VP2基因相比，最高的 同源性為96%;在存在579氨基酸的情況下，表明本發明的豬細小病毒VP2蛋白與已公開的 蛋白存在不少于23個氨基酸的差異(圖2)。
[0018] 實施例2:重組豬細小病毒VP2蛋白的制備
[0019]包括以下步驟:a.構建表達載體;b.構建表達菌株;c .重組VP2蛋白的誘導和提取 純化。具體如下:將陽性克隆質粒PMD18-T-VP2和表達載體pPICZa載體分別用ΚρηΙ和Notl雙 酶切產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳后，用DNA凝膠回收試劑盒回收，分別獲得約1.7kb和 3.3kb片段，在16°C定向連接構建pPICZa-VP2表達載體，經酶切鑒定正確后;將質粒線性化 后，電轉化入畢赤酵母感受態細胞，構建畢赤酵母表達菌株X33-VP2，并提取表達菌株X33-VP2基因組，使用引物primer 1和primer 2進行PCR鑒定正確，于2016年3月9日保藏于中國 典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC M2016098;進行誘導表達，挑取含X33-VP2的單克 隆菌落接種于BMGY液體培養基，30 °C振蕩培養過夜，離心收集菌體，用適量的BMMY懸浮后， 加入0.55 %甲醇，30°C誘導96小時。4°C，9000rpm離心5min，保留上清液，加入40%的硫酸銨 沉淀后，12000rpm離心5min收集蛋白沉淀，用PBS重溶蛋白。加入蛋白電泳上樣緩沖液，沸水 煮8分鐘后，用12%的分離膠進行SDS-PAGE鑒定（圖3是重組菌發酵誘導表達產物的SDS-PAGE電泳檢定圖，圖中1、2、為VP2蛋白表達產物沉淀，Μ為分子量標準蛋白質）。
[0020] 實施例3:疫苗的制備
[0021] 將生產豬細小病毒VP2蛋白的畢赤酵母表達菌株X33-VP2株保藏于中國典型培養 物保藏中心，保藏編號為CCTCC Μ 2016098。
[0022] 1.制苗用菌液的制備將X33-VP2菌種接種于含博萊霉素的ΥΗ)液體培養基中，30°C 振蕩培養16~18小時。然后劃線接種于加有博萊霉素的Yro固體培養基，選取典型菌落2~3 個混合于少量Yro液體培養基中，置30°C搖床中振蕩培養18小時，定量分裝，經純粹檢驗后， 作為一級種子。取一級種子接種于BMGY液體培養基中，30°C振蕩培養16~18小時，經鏡檢 后，置2~8°C保存，作為二級種子。
[0023] 2.制苗用蛋白的制備按發酵罐容積60% (V/V)加入BMGY不完全液體培養基，同時 按培養基〇. 1 % (V/ν)加入消泡劑，通入高溫蒸汽滅菌30分鐘，待培養基溫度降至32°C，加入 YNB和生物素，接種豬細小病毒VP2蛋白生產用畢赤酵母X33-VP2二級種子液，發酵罐參數設 置分別為攪拌速度800r/min，溫度30 °C，維持D0值(溶氧量)在20%。培養24小時后的菌液補 加甲醇，甲醇的補加速度為2ml/h/L誘導表達培養，按照以上發酵控制參數及工藝誘導表達 120小時；發酵培養菌液經管式離心機10000r/min離心30分鐘，收獲的上清，加入硫酸銨沉 淀蛋白后，按12000r/min離心30分鐘收獲沉淀，加入適量的生理鹽水溶解蛋白沉淀。
[0024] 3.滅活將蛋白液置于滅活瓶內，計量加入10%甲醛溶液，隨加隨搖，使其充分混 合，甲醛溶液的最終濃度為0.1 %。加甲醛溶液后倒入另一滅活瓶中，以避免瓶口附近粘附 的病毒未能接觸滅活劑。37°C滅活16小時后取出，置2~8°C保存。
[0025] 4.半成品檢驗
[0026] (1)無菌檢驗按現行《中國獸藥典》附錄進行無菌檢驗。
[0027] (2)蛋白含量測定按Bradf ord法檢測蛋白含量。
[0028] (3)滅活檢驗將滅活后的蛋白液取少量接種YPD固體培養基，置于置30°C繼續培養 72小時。觀察無菌落生長，判滅活檢驗合格。
[0029]實施例2:亞單位滅活疫苗的制備
[0030] 經過檢驗合格后的半成品VP2蛋白抗原進行疫苗制備（以下配制中各液體成分按 體積比計）。
[0031] (1)油相制備取獸用白油95份，硬脂酸鋁1份，置于油相制備罐中加熱至80°C后，再 加司本一80 5份，至溫度達到115°C時，維持30min，冷卻后備用。
[0032] (2)水相制備將豬細小病毒VP2蛋白使用生理鹽水稀釋成150yg/0.1ml。取滅菌后 的5份吐溫-80，加入配液罐中，同時加入制苗用蛋白液95份，攪拌20~30min，使吐溫-80完 全溶解。
[0033] (3)乳化取油相2份放于高速剪切機內，開動電機慢速轉動攪拌，同時徐徐加入水 相1份，以l〇〇〇〇r/min，乳化5分鐘。乳化后，取10ml，以3000r/min離心15分鐘，管底析出的水 相應不超過0.5ml。
[0034] 實施例3、疫苗成品檢驗
[0035] (1)性狀
[0036] 外觀疫苗應為乳白色乳劑，無雜質并且外包裝應合格。
[0037] 劑型為油包水型。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，均應不擴 散。
[0038] 穩定性吸取疫苗10ml加入離心管中，以3000r/min離心15分鐘，管底析出的水相應 不超過0.5ml。
[0039]黏度按現行《中國獸藥典》附錄進行，應符合規定。
[0040] (2)裝量檢查按現行《中國獸藥典》附錄進行，應符合規定。
[0041 ] (3)無菌檢驗按現行《中國獸藥典》附錄進行，應符合規定。
[0042] (4)安全檢驗用50日齡仔豬5只，每只頸部皮下注射疫苗1.0ml，同時設對照5只，在 相同的條件下飼養，連續觀察14日，記錄試驗豬采食、飲水及臨床情況。應不出現由疫苗引 起的任何局部和全身不良反應。
[0043] (5)效力檢驗初產母豬5只，每只頸部皮下注射疫苗，0.5ml/只，另取5只同日齡初 產母豬作為不免疫作對照。母豬配種后，懷孕至38-40天時攻毒，結果從接種亞單位疫苗的 母豬的血漿中沒有分離到病毒，而對照母豬的血漿中則分離到病毒。攻毒40天后宰殺，接種 母豬共懷65頭胎豬，從它們的臟器中均沒有分離到病毒，而對照母豬共懷60頭胎豬，其中有 31頭的臟器分離到病毒。結果表明，用豬細小病毒VP2蛋白亞單位疫苗免疫母豬能夠抵抗病 毒的攻擊，不出現臨床癥狀，胎豬病毒分離均為陰性。對照組，出現輕微的臨床癥狀，胎豬病 毒分離陽性率超過50%，表明豬細小病毒亞單位滅活疫苗能夠提供有效的保護。
[0044] 對比實驗表明，用目前市場上出售的豬細小病疫苗進行免疫，再用本發明篩選的 PPV1株進行攻毒實驗;結果表明目前市場上出售的疫苗的免疫效果遠低于本發明的VP2蛋 白疫苗的效果;推測是由于PPV1株的VP2蛋白疫苗發生變異導致目前疫苗的免疫效果不好。
【主權項】
1. 一種巴斯德畢赤酵母菌，其特征在于，所述的巴斯德畢赤酵母菌的保藏編號為CCTCC NO:M 2016098。2. 權利要求1所述的巴斯德畢赤酵母菌，其特征在于，所述的巴斯德畢赤酵母菌是將豬 細小病毒VP2蛋白基因克隆入帶有高效表達AOX啟動子的畢赤酵母菌中制備的。3. 如權利要求2所述的巴斯德畢赤酵母菌其特征在于，所述的豬細小病毒VP2蛋白基因 的核苷酸序列為SEQ ID NO:2。4. 權利要求1所述的巴斯德畢赤酵母菌在重組表達豬細小病毒VP2蛋白中的應用。5. -種重組表達豬細小病毒VP2蛋白中的方法，其特征在于，所述的方法是將權利要求 1所述的巴斯德畢赤酵母菌在在甲醇的誘導作用下來重組表達豬細小病毒VP2蛋白。6. 如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述的甲醇添加的終濃度為0.55 %。
【文檔編號】C12R1/84GK105950492SQ201610369589
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月28日
【發明人】劉新文, 范根成, 胡瀟, 宮曉, 李陸梅, 劉蕾
【申請人】青島易邦生物工程有限公司