一種牧草降解減容的方法
【專利摘要】本發明公開了一種牧草降解減容的方法和一種用于牧草降解減容的真菌，所述方法包括以下步驟：取牧草自然風干，加入尿素，作為牧草基質；將白腐菌接種到PDA液體培養基中，28℃下培養4天，作為白腐菌母液；將真菌QD?1接種到PDA液體培養基中，28℃下培養4天，作為真菌QD?1母液；將所述白腐菌母液和真菌QD?1母液接種到牧草基質上，進行發酵降解減容。本發明的方法較好的克服了牧草降解緩慢，降解過程不穩定，難以標準化的問題。CGMCCNo.1223720160324
【專利說明】
一種牧草降解減容的方法
技術領域
[0001] 本發明屬于微生物學，具體地說，涉及一種牧草降解減容的方法和一株用于牧草 降解減容的真菌。
【背景技術】
[0002] 隨著經濟的發展，環境問題也越來越受人們的關注，特別是重金屬(包括核素)對 土壤和水體的污染在全球范圍內受到極大的關注。對于重金屬(包括核素)污染土壤和水體 的植物修復技術研究已成為該領域的熱點。植物修復技術屬于原位修復技術，其成本低、易 操作，與此同時植被還具有保護表土、減少侵蝕和水土流失的功效，可大面積應用于礦山的 復墾、重金屬污染場地的植被與景觀修復。對于植物修復技術的研究，國內外的科研工作者 主要集中在對超富積植物的篩選，然后人們常常忽略這樣一個問題，污染較重的礦區往往 并不具備良好的栽培環境，這就是說人們篩選得到的富積植物不一定能適應礦區的環境。 這樣如果所篩選的富積植物不能生長或者不能較好的生長達到一定的生長量，富積植物的 修復作用就不能得到有效的體現。牧草一般具有較好的環境適應性與較強的生長能力，所 以選擇適當的牧草進行重金屬(包括核素)污染土壤的植物修復具有良好的應用前景。因此 對于收割后的牧草的處理就成了必須面對的問題。利用微生物對牧草進行降解減容具有溫 和、環保、安全等特性，是一種綠色環境友好型的處理方法。能夠利用牧草的微生物種類繁 多，真菌在其中起到重要的作用。在牧草的降解減容過程中由于牧草本身所含有的微生物 往往對外接菌影響較大，從而導致較難實現牧草降解減容過程的標準化處理。在實際操作 過程中可以利用堆肥的方式來實現牧草的減容，但堆肥與減容又具有不同的測重點。堆肥 主要是要通過高溫過程對堆肥有機質中所含的微生物病原菌、雜草種子殺死，避免因為施 用含微生物病原菌和雜草種子的有機肥而將微生物病原菌和雜草種子帶入大田，而降解減 容主要是體積的減少與質量的減少，即在減容的過程中不一定要求到達較高的溫度，而更 加注重在發酵過程中微生物對有機質的有效降解;在重金屬污染土壤的植物修復過程中， 通過微生物的有效降解減容可以較好地實現對收獲后植物的處理，以及對植物所吸收重金 屬的浸出和濃縮，為后續對重金屬的回收或者其他有效處理提供必要的條件。
[0003] 在農業生產過程中會產生大量的秸桿，以往常見的處理措施是焚燒，但焚燒會對 空氣造成嚴重的污染，特別是在我國東北地區，焚燒秸桿已經成為造成霧霾的主要原因之 一。秸桿的微生物降解減容法處理是一個溫和、環保、安全的處理法。
【發明內容】
[0004] 有鑒于此，本發明要解決現有牧草或秸桿的處理方法對環境污染較大的問題，提 供一種牧草降解減容的方法及一株用于牧草降解減容的真菌。
[0005] 為了解決上述技術問題，本發明公開了一株用于牧草降解減容的真菌，該菌株命 名為真菌QD-UPterula sp.QD-Ι)，保藏于北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.12237,保藏日期為2016年3月24 曰。
[0006] 本發明還公開了一種牧草降解減容的方法，包括以下步驟：
[0007] 取牧草自然風干，加入尿素，作為牧草基質；
[0008] 將白腐菌(white rot fungi)接種到PDA液體培養基中，28°C下培養4天，作為白腐 菌母液；
[0009] 將真菌QD-1 (Pterula sp. QD-1)接種到另一roA液體培養基中，28°C下培養4天，作 為真菌QD-1母液；
[0010]將所述白腐菌母液和真菌QD-1母液接種到牧草基質上，進行發酵降解減容。
[0011] 進一步的，所述真菌QD-1保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中 心，保藏編號為CGMCC N0.12237,保藏日期為2016年3月24日。
[0012] 進一步的，所述真菌QD-1母液的接種量為5-10%。
[0013]進一步的，所述牧草基質中尿素的含量為0.4-2. Og/Kg。
[0014]進一步的，所述白腐菌母液的接種量為5-10%。
[0015]進一步的，所述降解減容的溫度為20-37 °C。
[0016]優選的，所述降解減容溫度為28°C。
[0017]進一步的，所述降解減容時所述牧草基質含水量為50%_70%。
[0018]進一步的，所述牧草基質含水量為60%。
[0019] 與現有技術相比，本發明可以獲得包括以下技術效果：
[0020] 1)本發明在牧草的降解減容過程中，利用QD-1菌株作為牧草降解減容過程的啟動 菌株:QD-1菌株本身是從自然條件下牧草降解的過程中分離得到的菌株，其在牧草基質中 容易定殖。實驗證明了真菌QD-1菌株不容易受牧草基質中其它微生物的影響，其能在牧草 基質中迅速的生長成為牧草基質中的優勢菌株;QD-1菌株在牧草基質中迅速生長，能迅速 的啟動牧草的降解，與此同時但堆肥到一定時間后，一般在20天左右時QD-1有一個明顯的 衰敗過程。QD-1的衰敗與溶解為其它微生物騰出生態位，有利于牧草在其它微生物的作用 下進一步的降解;QD-1真菌的中性代謝特性可以使牧草基質保持較長時間的中性特性，這 有利于微生物的綜合作用，便于牧草基質的進一步降解。這不同于一般微生物降解牧草基 質的產酸代謝類型。
[0021] 2)本發明的方法較好的克服了牧草降解緩慢，降解過程不穩定，難以標準化的問 題。
[0022] 當然，實施本發明的任一產品必不一定需要同時達到以上所述的所有技術效果。 [0023]本發明提供的用于牧草降解減容的真菌命名為真菌QD-UPterula sp.QD-Ι)，已 于2016年3月24日保藏于北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國微生物菌種保藏管理委員 會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.12237。
【具體實施方式】
[0024] 以下將配合實施例來詳細說明本發明的實施方式，藉此對本發明如何應用技術手 段來解決技術問題并達成技術功效的實現過程能充分理解并據以實施。
[0025] 實施例
[0026] 一、材料
[0027]草樣：黑麥草(Lolium perenne);真菌:實驗室分離到的3株菌株，分別為白腐菌、 里氏木霉(Trichoderma ressei)以及強化降解菌株QD-1。
[0028] 黑麥草是具有較好土壤重金屬污染修復應用潛能的牧草。白腐菌與里氏木霉分別 為具有木質素和纖維素降解能力的菌株;同時也直接通過測定牧草基質降解率的簡單方法 分離了大量具有降解牧草能力的真菌，并從眾多的菌株中篩選出1株真菌QD-1進行研究。菌 株QD-1為選定的一株牧草降解減容強化啟動菌株，其生長具有受牧草中固有微生物影響小 的特性。其生長快，能在牧草前期的降解減容過程中迅速成為優勢菌。小規模的牧草降解實 驗證明，該菌株利用牧草代謝類型為中性代謝，并且在牧草降解減容過程中期（中后期）該 菌衰敗溶解，為其他微生物對牧草降解減容進一步的作用提供了生態位。
[0029] 二、降解減容條件研究
[0030] 2.1三株真菌的共生長研究
[0031]將參試的三株真菌分別接種在同一含PDA固體培養基的培養皿中，28°C下培養2~ 4天，觀察三株真菌的共培養情況。三株真菌彼此之間不存在明顯的非接觸抑制現象，表明 三株真菌之間具有較好的共培養能力。
[0032] 2.2牧草基質
[0033] 將牧草剪成1~2cm長的小段，烘干至恒重，備用;接種母液的制備:將白腐菌、里氏 木霉、強化降解菌株QD-1分別接種到PDA液體培養基中，28°C下培養4天，作為接種母液備 用。
[0034] 2.3不同菌株降解減容能力的比較
[0035]通過培養瓶發酵降解減容的方式進行，每個培養瓶中裝干草4g，初始牧草發酵基 質含水量為60%，牧草基質滅菌備用;實驗共設計4組：（1)外接白腐菌3mL; (2)外接里氏木 霉3mL; (3)外接真菌QD-1 3mL; (4)未外接其他真菌的對照組，每個處理3個重復。28°C下培 養14天后測定各個處理的失重，結果見表1。
[0036]表1不同菌株降解能力的比較
[0038] 發酵14天后各個處理組的降解情況如表1所示。接種里氏木霉的處理組具有最大 的降解率32.73 %，比對照的降解率(26.86 % )高了 5.87個百分點，接種白腐菌的處理組具 有最低的降解率27.11%，接種菌株QD-1組的降解率為28.24%。對實驗數據進行顯著性分 析，結果表明接種里氏木霉能顯著提高收割后牧草的降解率，接種里氏木霉處理組與接種 白腐菌處理組差異顯著，接種里氏木霉處理組與接種強啟動菌株QD-1差異不顯著。
[0039] 2.4接種量與尿素含量的優化
[0040]在以QD-1為牧草降解減容快速啟動菌的牧草降解減容體系中，對發酵減容過程中 的外接真菌的接種量與尿素的添加量進行優化。實驗過程中除選擇了 QD-1真菌和白腐菌外 也選擇了實驗室保存的另外一株里氏木霉。實驗通過培養瓶發酵的方式進行，每個培養瓶 中裝4g干草，發酵基質的初始含水量為60 %。實驗共設4個處理3個水平，8卩：（1)白腐菌接種 量0.5mL、l .0mL、l .5mL; (2)里氏木霉接種量0.5mL、l .0mL、l .5mL; (3)真菌QD-1接種量 0.5mL、1. OmL、1.5mL; (4)尿素添加量分別為0.004g、0.008g、0.016g。對4因素3水平進行正 交實驗設計，實驗設計如表2所示。接種后28°C條件下培養30天后測定各個處理組的降解 率。利用SPSS軟件對實驗相關數據比較均值的單因素 AN0VA分析和一般線性模型下的多因 素方差分析。
[0041] 表2接種量與尿素含量的正交實驗設計
[0042]
[0043] 在微生物對牧草的降解過程中，由于牧草自身的特性往往限制了微生物的降解效 率。牧草中含量最為豐富的為纖維素與半纖維素，這些有機物質可以為微生物的生長提供 必要的碳源。在降解的過程中適當的添加合適的氮源能有效調節微生物作用基質的C/N，這 有利用加速微生物對牧草的降解。考慮到重金屬和核素污染的特性環境，研究選擇尿素作 為易得到與易操作的外源氮源。研究進一步對發酵減容過程中的外接真菌的接種量與尿素 的添加量進行優化。實驗按照正交實驗設計進行，培養30天后，對各個處理的牧草基質失重 進行測定，測定結果如下表3所示。
[0044] 表3不同處理組牧草失重統計
[0046]從表3可知，處理組8具有最大的失重率42.75%，即：在白腐菌的接種量為1.5mL (15% )，里氏木霉的接種量為1.0mL(10% )，強化啟動菌株QD-1的接種量為5.0mL(5% )，尿 素為0.016g( 1.6g/Kg)的條件下，培養30天具有最大的失重率。
[0047]利用SPSS軟件對數據進行一般線性模型下的多因素方差分析。方差分析表如下表 4所示，單因素統計表如表5所示。
[0048]表4數據的方差分析
[0050] a.R2 = 0.680(校正后 R2 = 0.319)
[00511表5單因素統計量表
[0052]
[0053] 從表4可知，對于白腐菌的接種量之間F = 2.807，P = 0.119>0.05，差異不顯著;對 于里氏木霉的接種量之間？ = 0.695，？ = 0.527>0.05，差異不顯著;對于0〇-1的接種量之間 F = 0.990，P = 0.413 >0.05,差異不顯著；對于尿素的使用量之間F = 3.763，P = 0.070> 0.05,差異不顯著。從分析的結果看各個因素對牧草的降解減容影響不同，其作用大小依次 為:尿素> 白腐菌>0〇_1>里氏木霉。根據單因素統計表(表5)可知，六131、(：1、03的均值最 大，即根據所得數據確定最優的牧草降解減容條件為白腐菌的接種量為5%，里氏木霉的 接種量為5 %，強啟動菌株QD-1的接種量為5 %，尿素的施用量為1.6g/Kg。進一步對在有優 化后的降解減容條件下對牧草基質的降解減容能力進行了驗證，培養30d后牧草基質的失 重率為45.60 %。
[0054] 鑒于尿素與白腐菌在牧草降解減容過程中重要作用，研究進一步地設計了實驗進 行驗證。實驗一共5個處理組，處理1:接種QD-1 (10 % )，處理2:接種白腐菌（10 % )，處理3:接 種QD-1 (5%)和白腐菌(5%)，處理4:牧草基質自然接種(不人為接種），處理5:牧草基質(不 含尿素）自然接種(不人為接種）。接種后28°C條件下培養30天測定牧草的失重。基質:40% 牧草，60 %含水量(添加或者不添加1.6g/Kg尿素）。處理1、處理2、處理3和處理4的基質分別 為在基本基質的基礎上添加1.6g/kg的尿素的基質；處理5為基本基質，不含尿素。實驗結果 表明：處理3在含尿素的牧草基質中外接QD-1和白腐菌具有最高的失重率。在對未滅菌牧草 基質進行降解處理時，為了保證外接真菌能較好的在基質中發揮作用，一般都需要較大的 接種量，故在實驗過程中對于真菌接種量的設計上以5%或者10%為參考值。
[0055] 在實際的工程應用過程中，需要根據實際的具體情況對比參照得到的培養條件的 參考值對培養條件的各個參數進行修正，以期能得到有效牧草快速降解減容結果。
[0056]三、強啟動真菌QD-1的種屬鑒定
[0057] 采用18SrDNA-26SrDNA ITS序列分析的方法對參試的QD-1菌株進行了種屬鑒定。 PCR引物為5 '-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 ' 與5 '-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 '。反應體系為25μ L:Taq聚合酶（5UAiL)0.2yL;MgCl2(25mmol/L)3yL;10XPCR buffer 2.5yL;dNTP(10ymol/ L) lyL;引物各0 · 5yL;DNA模板0 · 5yL; ddH20 16 · 8yL JCR擴增程序為:94°C預變性4min;94°C 變性45s，56°C退火45s，72°C延伸lmin，循環30次；72°C延伸lOmin，用1%的瓊脂糖來檢測 PCR結果。對DNA條帶進行回收純化與克隆測序。
[0058] 得到的ITS序列如SEQ ID NO: 1所示。在NCBI上進行blast比對得到的結果與 Pterula sp strain(DQ494693.1)具有最大的相似度（89%)。因此該菌初步鑒定為 Pterula sp·，命名為Pterula sp.strain QD-1，該菌株于2016年3月24日保藏于北京市朝 陽區北辰西路1號院3號，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為 CGMCC N0.12237。
[0059] 強啟動菌株QD-1在牧草降解過程中的應用能有效快速地啟動牧草降解過程，使牧 草降解過程具有較好的穩定性和可控性。QD-1菌株本身具有較好的牧草降解能力，且與其 他牧草降解真菌具有較好的共培養能力，這有利于牧草降解過程中多種菌的綜合作用。與 此同時，在牧草降解減容過程中期或中后期該菌衰敗溶解，為其他微生物對牧草降解減容 進一步的作用提供了生態位。在牧草基質中外加一定量的尿素和接種一定量的強啟動真菌 QD-1與白腐菌能有效的促進牧草基質的降解，且在溫和條件下能在30天實現40%以上的降 解率。
[0060] 本發明在牧草的降解減容過程中，利用QD-1菌株作為牧草降解減容過程的啟動菌 株:QD-1菌株本身是從自然條件下牧草降解的過程中分離得到的菌株，其在牧草基質中容 易定殖。實驗證明了真菌QD-1菌株不容易受牧草基質中其它微生物的影響，其能在牧草基 質中迅速的生長成為牧草基質中的優勢菌株;QD-1菌株在牧草基質中迅速生長，能迅速的 啟動牧草的降解，與此同時但堆肥到一定時間后，一般在20天左右時QD-1有一個明顯的衰 敗過程。QD-1的衰敗與溶解為其它微生物騰出生態位，有利于牧草在其它微生物的作用下 進一步的降解;QD-1真菌的中性代謝特性可以使牧草基質保持較長時間的中性特性，這有 利于微生物的綜合作用，便于牧草基質的進一步降解。這不同于一般微生物降解牧草基質 的產酸代謝類型。本方法較好的克服了牧草降解緩慢，降解過程不穩定，難以標準化的問 題。
[0061]如在說明書及權利要求當中使用了某些詞匯來指稱特定成分或方法。本領域技術 人員應可理解，不同地區可能會用不同名詞來稱呼同一個成分。本說明書及權利要求并不 以名稱的差異來作為區分成分的方式。如在通篇說明書及權利要求當中所提及的"包含"為 一開放式用語，故應解釋成"包含但不限定于"。"大致"是指在可接收的誤差范圍內，本領域 技術人員能夠在一定誤差范圍內解決所述技術問題，基本達到所述技術效果。說明書后續 描述為實施本發明的較佳實施方式，然所述描述乃以說明本發明的一般原則為目的，并非 用以限定本發明的范圍。本發明的保護范圍當視所附權利要求所界定者為準。
[0062]還需要說明的是，術語"包括"、"包含"或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的 包含，從而使得包括一系列要素的商品或者系統不僅包括那些要素，而且還包括沒有明確 列出的其他要素，或者是還包括為這種商品或者系統所固有的要素。在沒有更多限制的情 況下，由語句"包括一個……"限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系統中還 存在另外的相同要素。
[0063]上述說明示出并描述了本發明的若干優選實施例，但如前所述，應當理解本發明 并非局限于本文所披露的形式，不應看作是對其他實施例的排除，而可用于各種其他組合、 修改和環境，并能夠在本文所述發明構想范圍內，通過上述教導或相關領域的技術或知識 進行改動。而本領域人員所進行的改動和變化不脫離本發明的精神和范圍，則都應在本發 明所附權利要求的保護范圍內。
【主權項】
1. 一種牧草降解減容的方法，其特征在于，包括以下步驟： 取牧草自然風干，加入尿素，作為牧草基質； 將白腐菌接種到PDA液體培養基中，28 °C下培養4天，作為白腐菌母液； 將真菌QD-I (Pterula sp. QD-I)接種到另一HM液體培養基中，28°C下培養4天，作為真 菌QD-I母液； 將所述白腐菌母液和真菌QD-I母液接種到牧草基質上，進行發酵降解減容。2. 根據權利要求1所述的牧草降解減容方法，其特征在于，所述真菌QD-I保藏于中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO. 12237,保藏日期為2016 年3月24日。3. 根據權利要求2所述的牧草降解減容方法，其特征在于，所述真菌QD-I母液的接種量 為5-10% 〇4. 根據權利要求3所述的牧草降解減容方法，其特征在于，所述牧草基質中尿素的含量 為0.4-2.0g/Kg。5. 根據權利要求4所述的牧草降解減容方法，其特征在于，所述白腐菌母液的接種量為 5-10% 〇6. 根據權利要求5所述的牧草降解減容方法，其特征在于，所述降解減容的溫度為20-37。。。7. 根據權利要求6所述的牧草降解減容方法，其特征在于，所述降解減容溫度為28°C。8. 根據權利要求7所述的牧草降解減容方法，其特征在于，所述降解減容時所述牧草基 質含水量為50 %-70 %。9. 根據權利要求8所述的牧草降解減容方法，其特征在于，所述牧草基質含水量為 60% 〇10. -株用于牧草降解減容的真菌，其特征在于，該菌株命名為真菌QD-I (Pterula sp . QD-I )，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO.12237,保藏日期為2016年3月24日。
【文檔編號】C12R1/645GK105950480SQ201610326838
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月17日
【發明人】肖偉, 陳曉明, 張祥輝, 廖祥兵, 向芳
【申請人】西南科技大學