一種噬菌體的凍干保存方法
【專利摘要】本發明提供了一種噬菌體的凍干保存方法，將噬菌體液和噬菌體保存保護劑混合均勻，制備成噬菌體凍干粉，噬菌體凍干粉在無菌條件下密封于安瓿中保存。本發明所述的噬菌體的凍干保存方法，方法合理，應用方便，噬菌體可以在室溫保存或者冷藏，對保存環境要求低，適應性好，并且可以長期保存。
【專利說明】
一種噬菌體的凍干保存方法
技術領域
[0001] 本發明屬于生物技術和微生物制品領域，具體地，涉及一種噬菌體的凍干保存方 法。
【背景技術】
[0002] 噬菌體是一類能感染細菌、放線菌、螺旋體等微生物的病毒的總稱，對一些細菌具 有高度的專一性，當噬菌體侵染這些細菌時，可在細菌中繁殖并殺死細菌，而它對動植物沒 有毒性。隨著分子生物學技術的發展，噬菌體已經廣泛用于疾病診斷、水處理等多個領域。 由于噬菌體可以將基因插入宿主DNA內的特性，使得它還成為了重要的分子和遺傳學研究 工具。利用噬菌體，可以設計很多精巧的實驗。
[0003] 然而在上述過程中，都需要對噬菌體進行保存，現有技術的保存方案中噬菌體的 保存效果差，噬菌體的保存時間短，存活率低，噬菌體容易被污染，并且必須在低溫條件下 進行保存，嚴重制約了對噬菌體應用的發展。
【發明內容】
[0004] 發明目的：為了克服以上不足，本發明提供了一種噬菌體的凍干保存方法。
[0005] 技術方案:本發明提供了一種噬菌體的凍干保存方法，包括以下步驟：
[0006] 1)噬菌體溶液于2-7°C靜置4-8h，出現絮狀沉淀，經過8000-12000r/min離心20-40min；
[0007] 2)向上述沉淀中加入噬菌體緩沖液，將沉淀溶解，得噬菌體液；
[0008] 3)噬菌體液體積1-2.5倍的噬菌體保存保護劑混合均勻，所述噬菌體保存保護劑 所述氨基酸以重量組分計，包括以下組分:脫脂乳6-18份、硅藻土 0.3-0.8份、糖醇2-5份、 DEAE-葡聚糖0.8-1.5份、阿拉伯膠0.01-0.16份、牛血清白蛋白0.7-1.2份、麥芽糖糊精 0 · 05-0 · 3份、蜂蜜0 · 01-0 · 08份、棉子糖0 · 8-1 · 6份、磷酸鋁0 · 03-0 · 06份、氯化鈉0 · 01-0 · 04 份、硫酸鎂〇. 3-0.7份、氯化鈣0.6-1.2份、甘油1 -3份、阿拉西A 0.05-0.12份和水100份；
[0009] 4)預降溫:將上述混合溶液冷凍降溫至5°C，并保持30min;進一步以l°C/min的速 度降溫到_5°C，并保持30min;再進一步以rC/min的速度降溫到-30°C，并保持lh;
[0010] 一級干燥:將上述溶液于-30°C、80-150mT〇rr壓強的真空條件下干燥12-18h;
[0011] 二級干燥：以0. rc/min的速度，加熱上述溶液到25°C，再于上述真空條件下保持 4-8h后得噬菌體凍干粉；
[0012] 5)上述噬菌體凍干粉在無菌條件下密封于安瓿中保存。
[0013] 本發明所述的噬菌體的凍干保存方法，方法合理，應用方便，噬菌體原液中加入保 存保護劑，以凍干粉形式保存，由于冷凍干燥在低溫下進行，因此噬菌體不會發生變性或失 去生物活力，物質中的一些揮發性成分損失很小，干燥在真空下進行，氧氣極少，因此一些 易氧化的物質得到了保護，并且噬菌體能保持原來的性狀，干燥后的凍干粉疏松多孔，呈海 綿狀，加溶媒后噬菌體可以溶解迅速而完全，幾乎立即恢復原來的性狀。可以在室溫保存或 者冷藏，對保存環境要求低，適應性好，可以長期保存。保存保護劑中脫脂乳、硅藻土、牛血 清白蛋白、麥芽糖糊精等形成整個保存保護劑的骨架，防止低分子物質的碳化和氧化，同時 保護活性物質不受溫度影響，使保護劑形成多孔性、疏松的海綿狀物且具有一定的含水量， 在凍存過程中保持原有的構架，從而增加溶解度。此外，多種糖類和鹽使噬菌體保持存活狀 態以及對水分起緩解作用，并且保持電解質濃度。噬菌體保存保護劑可以使噬菌體低溫保 存下免受溶液損傷和冰晶損傷等物理因素的損傷，并且維持噬菌體極高的存活率和活性， 使噬菌體的活動處于半靜止或靜止狀態。此外，保護劑同溶液中的水分子結合，發生水合作 用，弱化水的結晶過程使溶液的粘性增加從而減少冰晶的形成，同時冷凍保護劑可以通過 在噬菌體內外維持一定的摩爾濃度，降低內外未結冰溶液中電解質的濃度，使細胞免受溶 質的損傷。此外，保護劑還可以在室溫條件下用于多種噬菌體的保存，適應性好。
[0014] 進一步的，上述的噬菌體的凍干保存方法，所述噬菌體保存保護劑以重量組分計， 還包括0.01-0.08份的防腐劑，所述防腐劑為尼泊金乙酯或苯甲酸鈉或山梨酸鉀。加入防腐 劑可以使整個新型噬菌體保存保護劑的使用時間更長，且可以有效防止污染，防腐劑的選 擇多，適應性好。
[0015] 進一步的，上述的噬菌體的凍干保存方法，所述安瓿放入裝有無水氯化鈣或無水 甲醇或硅膠的密封容器中于室溫或2-7°C保存。在干燥的條件下保存效果更佳，保存時間更 久。
[0016] 進一步的，上述的噬菌體的凍干保存方法，所述步驟在4-6%的濕度條件下完成。 4-6%的濕度條件下溶菌活性最佳，保存效果最好。
[0017] 進一步的，上述的噬菌體的凍干保存方法，所述噬菌體緩沖液以重量組分計，包括 以下組分:三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽8-15份、氯化鈉0.05-0.2份、氯化鉀1-5份、硫酸鎂5-20 份、磷酸氫二鉀1-3份、磷酸二氫鈉8-12份、明膠0.05-0.1份、水100份，并且調節pH到7-7.5。 噬菌體緩沖液組分合理，使用方便，可以用于噬菌體的溶解和重懸，并且不影響噬菌體的活 性。
[0018] 進一步的，上述的噬菌體的凍干保存方法，所述脫脂乳為5%蔗糖脫脂乳。作為一 種優選，選擇5 %蔗糖脫脂乳，保存效果好。
[0019] 進一步的，上述的噬菌體的凍干保存方法，所述糖醇為木糖醇或山梨醇或麥芽糖 醇的一種。糖醇的原料來源廣，適應性好。
[0020] 進一步的，上述的噬菌體的凍干保存方法，所述甘油為20 % -40 %的甘油。20 % -40 %的甘油流動性好，易于應用。
[0021] 進一步的，上述的噬菌體的凍干保存方法，所述的水為去離子水或純化水。去離子 水或純化水可以保證新型噬菌體保存保護劑質量穩定、可控。
[0022] 進一步的，上述的噬菌體的凍干保存方法的制備方法，使用稀鹽酸和/或氫氧化鈉 調節溶液pH。原料來源廣，調節十分方便，并且應用成本低。
[0023] 有益效果:與現有技術相比，本發明具有以下優點:本發明所述的噬菌體的凍干保 存方法，方法合理，應用方便，噬菌體可以在室溫保存或者冷藏，對保存環境要求低，適應性 好，并且可以長期保存。
【附圖說明】
[0024] 圖1為本發明所述使用實施例1-4保存方法保存的噬菌體存活率圖。
【具體實施方式】
[0025] 下面將通過幾個具體實施例，進一步闡明本發明，這些實施例只是為了說明問題， 并不是一種限制。
[0026] 實施例1
[0027] -種大腸桿菌噬菌體的凍干保存方法，在4%的濕度條件下完成，包括以下步驟：
[0028] 1)大腸桿菌噬菌體溶液于2°C靜置4h，出現絮狀沉淀，經過8000r/min離心40min;
[0029] 2)向上述沉淀中加入噬菌體緩沖液，將沉淀溶解，得噬菌體液;所述噬菌體緩沖液 以重量組分計，包括以下組分:三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽8份、氯化鈉0.05份、氯化鉀1份、硫 酸鎂5份、磷酸氫二鉀1份、磷酸二氫鈉8份、明膠0.05份和去離子水100份，并且使用稀鹽酸 和/或氫氧化鈉調節pH到7;
[0030] 3)噬菌體液等體積的噬菌體保存保護劑混合均勻，所述噬菌體保存保護劑所述氨 基酸以重量組分計，包括以下組分:5%蔗糖脫脂乳6份、硅藻土 0.3份、木糖醇2份、DEAE-葡 聚糖〇. 8份、阿拉伯膠0.01份、牛血清白蛋白0.7份、麥芽糖糊精0.05份、蜂蜜0.01份、棉子糖 〇. 8份、磷酸鋁0.03份、氯化鈉0.01份、硫酸鎂0.3份、氯化鈣0.6份、20 %甘油1份、阿拉西A 〇. 05份、防腐劑尼泊金乙酯0.01份和去離子水100份；
[0031] 4)預降溫:將上述混合溶液冷凍降溫至5°C，并保持30min;進一步以l°C/min的速 度降溫到_5°C，并保持30min;再進一步以rC/min的速度降溫到-30°C，并保持lh;
[0032] 一級干燥:將上述溶液于_30°C、80mT〇rr壓強的真空條件下干燥12h;二級干燥：以 0. rC/min的速度，加熱上述溶液到25°C，再于上述真空條件下保持4h后得噬菌體凍干粉；
[0033] 5)上述噬菌體凍干粉在無菌條件下密封于安瓿中保存，所述安瓿放入裝有無水氯 化鈣的密封容器中于2°C保存。
[0034] 實施例2
[0035] -種乳桿菌噬菌體的凍干保存方法，在6%的濕度條件下完成，包括以下步驟： [0036] 1)乳桿菌噬菌體溶液于7°C靜置8h，出現絮狀沉淀，經過12000r/min離心20min;
[0037] 2)向上述沉淀中加入噬菌體緩沖液，將沉淀溶解，得噬菌體液;所述噬菌體緩沖液 以重量組分計，包括以下組分:三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽15份、氯化鈉0.2份、氯化鉀5份、硫 酸鎂20份、磷酸氫二鉀3份、磷酸二氫鈉12份、明膠0.1份和純化水100份，并且使用稀鹽酸 和/或氫氧化鈉調節pH到7.5;
[0038] 3)噬菌體液體積2.5倍的噬菌體保存保護劑混合均勻，所述噬菌體保存保護劑所 述氨基酸以重量組分計，包括以下組分：5%蔗糖脫脂乳18份、硅藻土0.8份、山梨醇5份、 DEAE-葡聚糖1.5份、阿拉伯膠0.16份、牛血清白蛋白1.2份、麥芽糖糊精0.3份、蜂蜜0.08份、 棉子糖1.6份、磷酸鋁0.06份、氯化鈉0.04份、硫酸鎂0.7份、氯化鈣1.2份、40%甘油3份、阿 拉西A 0.12份、防腐劑苯甲酸鈉0.08份和純化水100份；
[0039] 4)預降溫:將上述混合溶液冷凍降溫至5°C，并保持30min;進一步以l°C/min的速 度降溫到_5°C，并保持30min;再進一步以rC/min的速度降溫到-30°C，并保持lh;
[0040] -級干燥:將上述溶液于-30°C、150mT〇rr壓強的真空條件下干燥18h;
[0041] 二級干燥：以0. l°C/min的速度，加熱上述溶液到25°C，再于上述真空條件下保持 8h后得噬菌體凍干粉；
[0042] 5)上述噬菌體凍干粉在無菌條件下密封于安瓿中保存，所述安瓿放入裝有無水甲 醇的密封容器中于7°C保存。
[0043] 實施例3
[0044] -種分歧桿菌噬菌體的凍干保存方法，在5%的濕度條件下完成，包括以下步驟：
[0045] 1)分歧桿菌噬菌體溶液于4°C靜置6h，出現絮狀沉淀，經過10000r/min離心30min;
[0046] 2)向上述沉淀中加入噬菌體緩沖液，將沉淀溶解，得噬菌體液;所述噬菌體緩沖液 以重量組分計，包括以下組分:三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽12份、氯化鈉0.1份、氯化鉀3份、硫 酸鎂15份、磷酸氫二鉀2份、磷酸二氫鈉10份、明膠0.08份和純化水100份，并且使用稀鹽酸 和/或氫氧化鈉調節pH到7.2;
[0047] 3)噬菌體液體積2倍的噬菌體保存保護劑混合均勻，所述噬菌體保存保護劑所述 氨基酸以重量組分計，包括以下組分：5%蔗糖脫脂乳10份、硅藻土 0.6份、麥芽糖醇3份、 DEAE-葡聚糖1份、阿拉伯膠0. . 6份、牛血清白蛋白0.9份、麥芽糖糊精0.2份、蜂蜜0.05份、棉 子糖1.2份、磷酸鋁0.4份、氯化鈉0.02份、硫酸鎂0.5份、氯化鈣0.8份、30%甘油2份、阿拉西 A 0.08份、防腐劑山梨酸鉀0.05份和純化水100份；
[0048] 4)預降溫:將上述混合溶液冷凍降溫至5°C，并保持30min;進一步以l°C/min的速 度降溫到_5°C，并保持30min;再進一步以rC/min的速度降溫到-30°C，并保持lh;
[0049] -級干燥:將上述溶液于-30°C、120mT〇rr壓強的真空條件下干燥14h;
[0050] 二級干燥：以0. TC/min的速度，加熱上述溶液到25°C，再于上述真空條件下保持 6h后得噬菌體凍干粉；
[0051] 5)上述噬菌體凍干粉在無菌條件下密封于安瓿中保存，所述安瓿放入裝有無水氯 化鈣的密封容器中于4°C保存。
[0052] 實施例4
[0053] 一種副溶血弧菌噬菌體的凍干保存方法，在4%的濕度條件下完成，包括以下步 驟：
[0054] 1)副溶血弧菌噬菌體溶液于7°C靜置4h，出現絮狀沉淀，經過9000r/min離心 30min；
[0055] 2)向上述沉淀中加入噬菌體緩沖液，將沉淀溶解，得噬菌體液;所述噬菌體緩沖液 以重量組分計，包括以下組分:三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽8份、氯化鈉0.05份、氯化鉀5份、硫 酸鎂20份、磷酸氫二鉀1份、磷酸二氫鈉9份、明膠0.08份和去離子水100份，并且使用稀鹽酸 和/或氫氧化鈉調節pH到7;
[0056] 3)噬菌體液體積1.5倍的噬菌體保存保護劑混合均勻，所述噬菌體保存保護劑所 述氨基酸以重量組分計，包括以下組分：5%蔗糖脫脂乳6份、硅藻土 0.3份、木糖醇5份、 DEAE-葡聚糖1.5份、阿拉伯膠0.05份、牛血清白蛋白0.9份、麥芽糖糊精0.2份、蜂蜜0.05份、 棉子糖0.9份、磷酸鋁0.03份、氯化鈉0.01份、硫酸鎂0.7份、氯化鈣1.2份、25%甘油3份、阿 拉西A 0.08份、防腐劑山梨酸鉀0.04份和去離子水100份；
[0057] 4)預降溫:將上述混合溶液冷凍降溫至5°C，并保持30min;進一步以l°C/min的速 度降溫到_5°C，并保持30min;再進一步以rC/min的速度降溫到-30°C，并保持lh;
[0058] 一級干燥:將上述溶液于_30°C、120mT〇rr壓強的真空條件下干燥14h;
[0059] 二級干燥：以0.1°C/min的速度，加熱上述溶液到25°C，再于上述真空條件下保持 6h后得噬菌體凍干粉；
[0060] 5)上述噬菌體凍干粉在無菌條件下密封于安瓿中保存，所述安瓿放入裝有硅膠的 密封容器中于20 °C保存。
[0061] 對使用實施例1-4的噬菌體保護劑的保存1、3、6、9個月后的噬菌體污染情況以及 存活率分別進行考察，如表1所示，噬菌體均未污染，并且如圖1所示，噬菌體在9個月內保持 60%以上的存活率。
[0062]表1噬菌體污染情況
[0063]
[0064] 以上所述僅是發明的幾個實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員 來說，在不脫離發明原理的前提下，還可以做出若干改進，這些改進也應視為本發明的保護 范圍。
【主權項】
1. 一種噬菌體的凍干保存方法，其特征在于:包括以下步驟： 1)噬菌體溶液于2-7°C靜置4-8h，出現絮狀沉淀，經過8000-12000r/min離心20-40min; 2 )向上述沉淀中加入噬菌體緩沖液，將沉淀溶解，得噬菌體液； 3) 噬菌體液體積1-2.5倍的噬菌體保存保護劑混合均勻，所述噬菌體保存保護劑所述 氨基酸以重量組分計，包括以下組分:脫脂乳6-18份、硅藻土 0.3-0.8份、糖醇2-5份、DEAE-葡聚糖0.8-1.5份、阿拉伯膠0.0卜0.16份、牛血清白蛋白0.7-1.2份、麥芽糖糊精0.Οδ?』 份、蜂蜜 0.01-0.08 份、棉子糖 0.8-1.6 份、磷酸鋁 0.03-0.06 份、氯化鈉 0.01-0.04 份、硫酸鎂0.3-0.7份、氯化鈣0.6-1.2份、甘油1-3份、阿拉西A 0.05-0.12份和水100 份； 4) 預降溫:將上述混合溶液冷凍降溫至5°C，并保持30min;進一步以TC/min的速度降 溫到_5°C，并保持30min;再進一步以rC/min的速度降溫到-30°C，并保持Ih; 一級干燥:將上述溶液于-30°(：、80-1501111'〇^壓強的真空條件下干燥12-1811; 二級干燥：以0 . TC/min的速度，加熱上述溶液到25°C，再于上述真空條件下保持4-8h 后得噬菌體凍干粉； 5) 上述噬菌體凍干粉在無菌條件下密封于安瓿中保存。2. 根據權利要求1所述的噬菌體的凍干保存方法，其特征在于:所述噬菌體保存保護劑 以重量組分計，還包括0.01-0.08份的防腐劑，所述防腐劑為尼泊金乙酯或苯甲酸鈉或山梨 酸鉀。3. 根據權利要求1所述的噬菌體的凍干保存方法，其特征在于:所述安瓿放入裝有無水 氯化鈣或無水甲醇或硅膠的密封容器中于室溫或2-7°C保存。4. 根據權利要求1所述的噬菌體的凍干保存方法，其特征在于:所述步驟在4-6%的濕度 條件下完成。5. 根據權利要求1所述的噬菌體的凍干保存方法，其特征在于:所述噬菌體緩沖液以重 量組分計，包括以下組分:三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽8-15份、氯化鈉0.05-0.2份、氯化鉀 1-5份、硫酸鎂5-20份、磷酸氫二鉀1-3份、磷酸二氫鈉8-12份、明膠0.05-0.1份、水100 份，并且調節pH到7-7.5。6. 根據權利要求1所述的噬菌體的凍干保存方法，其特征在于:所述脫脂乳為5%蔗糖脫 脂乳。7. 根據權利要求1所述的噬菌體的凍干保存方法，其特征在于:所述糖醇為木糖醇或山 梨醇或麥芽糖醇的一種。8. 根據權利要求1所述的噬菌體的凍干保存方法，其特征在于:所述甘油為20%-40%的 甘油。9. 根據權利要求1或5所述的噬菌體的凍干保存方法，其特征在于:所述的水為去離子 水或純化水。10. 根據權利要求5所述的噬菌體的凍干保存方法的制備方法，其特征在于:使用稀鹽 酸和/或氫氧化鈉調節溶液pH。
【文檔編號】C12R1/92GK105950475SQ201610422048
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月14日
【發明人】許維素, 宋增福, 陳彪
【申請人】蘇州埃瑞特生物技術有限公司