一種透明質酸分子量分級方法
【專利摘要】本發明提供了一種透明質酸鈉分子量分級方法，其特征在于，包含以下步驟：(1)配制透明質酸鈉溶液；(2)向步驟(1)透明質酸鈉溶液中添加4％?40％(w/v)的強堿陰離子交換樹脂，攪拌吸附；(3)加入第一強電解質鹽溶液，靜置解析樹脂，收集第一解析液；(4)加入第二強電解質鹽溶液，攪拌解析樹脂，收集第二解析液；(5)加入第三強電解質鹽溶液和無機堿溶液再生樹脂，收集再生液；(6)分別對第一解析液、第二解析液和再生液進行乙醇沉淀；(7)干燥。該方法使用一種成本低，操作簡單的樹脂分離技術，且采用靜態吸附，適合于大規模化生產。
【專利說明】
一種透明質酸分子量分級方法
技術領域
[0001]本發明涉及一種透明質酸分子量分級方法。
【背景技術】
[0002]透明質酸(Hyaluronic acid，簡稱HA)又名玻璃酸，是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺雙糖單位反復交替而形成的一種線性大分子酸性黏多糖，水溶液中帶有負電荷，其重均分子量一般為1萬?1000萬Da，玻璃酸鈉(sodium hyaluronate)為玻璃酸的鈉鹽形式。目前商品化的HA—般為Na鹽形式，為白色纖維狀或粉末狀固體，存在較強的吸濕性，溶于水，不溶于有機溶劑。200萬Da以上的為高分子量HA; 100萬Da-200萬Da為中分子量HA; I萬Da-1OO萬Da為低分子量HA; I萬以下為寡聚HA。其分子量與其生理學功能密切相關，不同分子量的玻璃酸鈉具有不同的生物活性。HA分子量是一種重要的藥理學性質，由于HA分子量的重要性，對HA分子量的分級研究已經成為技術人員的研究熱點。
[0003]專利申請CN102516410 A采用酸堿水解結合法將高分子量的透明質酸鈉制備成不同小分子量的透明質酸鈉。很難得到經濟價值高、醫用級別要求的高分子量透明質酸鈉。
[0004]超濾膜分離技術如CN103319627A，對設備要求高，成本高，不適合大規模生產且只能得到兩種規格的透明質酸成品。
【發明內容】
[0005]本發明提供了一種透明質酸鈉分子量分級的方法。該方法采用了樹脂分離技術，可以用于透明質酸的生產過程中，或者用于對透明質酸成品進行再處理，根據需求可得到不同分子量的HA成品，能夠更好的提高HA的商業應用價值。
[0006]—方面，本發明提供了一種透明質酸鈉分子量分級的方法，其特征在于，包含以下步驟:
[0007](I)配制透明質酸鈉溶液；
[0008](2)向步驟(I)透明質酸鈉溶液中添加4%-40%(w/v)的強堿陰離子交換樹脂，攪拌吸附；
[0009 ] (3)加入第一強電解質鹽溶液，靜置解析樹脂，收集第一解析液；
[0010](4)加入第二強電解質鹽溶液，攪拌解析樹脂，收集第二解析液；
[0011 ] (5)加入第三強電解質鹽溶液和無機堿溶液再生樹脂，收集再生液；
[0012](6)分別對第一解析液、第二解析液和再生液進行乙醇沉淀；
[0013](7)干燥。
[0014]透明質酸鈉是一種高分子量的聚合物，其在水溶液中帶有聚陰子負電荷，使用強堿性的陰離子交換樹脂能夠將透明質酸鈉吸附，使用不同解析方法，如靜置解析和攪拌解析，可得到不同分子量規格的透明質酸鈉成品。本發明第一步采用靜態靜置解析而非常規的攪拌靜態解析，目的在于將被吸附于大孔強堿陰離子樹脂外表面的高分子量的透明質酸鈉解析出來;第二步采用攪拌靜態解析，目的在于將被吸附于大孔強堿陰離子樹脂孔徑內的中分子量的透明質酸鈉解析出來;第三步再生，將低分子量的透明質酸鈉解析出來。分步解析的可能機理解釋:透明質酸鈉是一種帶聚陰離子的線性高分子粘多糖決定了其與大孔陰離子樹脂的交換吸附行為受到:1、所帶電荷的；2、分子粒徑3、空間位阻的影響。小分子量的HA能夠鉆到大孔樹脂的孔徑內并多位點交換吸附。而高分子量的HA由于粒徑大不能進入孔內，且位阻較大，在樹脂的外表面形成較弱的吸附，容易被解析。
[0015]在一些實施例中，第一強電解質鹽、第二強電解質鹽和第三強電解質鹽各自獨立地為鹵代鹽、硫酸鹽和硝酸鹽。
[0016]在一些實施例中，無機堿是強堿。
[0017]在一些實施例中，第一強電解質鹽、第二強電解質鹽和第三強電解質鹽各自獨立地為 NaCl、CaCl2、ZnCl2、MgCl2、Na2S04、MgS04 或 NaNO3。
[0018]在一些實施例中，無機堿是NaOH或Κ0Η。
[0019]在一些實施例中，第一強電解質鹽、第二強電解質鹽和第三強電解質鹽各自獨立地為 NaCl、CaCl2、ZnCl2、Na2S04、MgCl2、MgS04 或 NaNO3 ；無機堿是 NaOH 或 Κ0Η。
[0020]在一些實施例中，步驟(I)透明質酸鈉分子量為50-95萬Da。
[0021]在一些實施例中，步驟(I)透明質酸鈉溶液濃度為l-10g/L。
[0022]在一些實施例中，步驟(I)透明質酸鈉溶液為水溶液。
[0023]在一些實施例中，步驟(I)中透明質酸鈉分子量為50-95萬Da，其為溶液濃度為1-1 Og/L的水溶液。
[0024]在一些實施例中，步驟(2)中攪拌吸附在室溫下進行。
[0025]在一些實施例中，室溫是指15°C至40°C。
[0026]在另一實施例中，室溫是指20°C至35°C。
[0027]在一些實施例中，步驟(2)中攪拌吸附3-24小時。
[0028]在另一些實施例中，步驟(2)中攪拌吸附3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13小時。
[0029]在一些實施例中，步驟(3)中第一強電解質鹽濃度為0.05-2M。
[0030]在一些實施例中，步驟(3)中第一強電解質鹽溶液為水溶液。
[0031 ]在一些實施例中，步驟(3)中靜置解析3-8小時。
[0032]在一些實施例中，步驟(3)中第一強電解質鹽溶液為濃度為0.05-2M的水溶液，靜置解析3-8小時。
[0033]在一些實施例中，步驟(4)中第二強電解質鹽濃度為0.05-2M。
[0034]在一些實施例中，步驟(4)中第二強電解質鹽溶液為水溶液。
[0035]在一些實施例中，步驟(4)中攪拌解析3-24小時。
[0036]在一些實施例中，步驟(4)中第二強電解質鹽溶液為濃度為0.05-2M的水溶液，攪拌解析3-24小時
[0037]在一些實施例中，步驟(5)中第三強電解質鹽濃度為0.05-2M。
[0038]在一些實施例中，步驟(5)中第三強電解質鹽溶液為水溶液。
[0039]在一些實施例中，步驟(5)中無機堿濃度為0.1-0.5M。
[0040]在一些實施例中，步驟(5)中無機堿溶液為水溶液。
[0041 ] 在一些實施例中，步驟(5)中再生3-24小時。
[0042]在一些實施例中，步驟(5)中第三強電解質鹽溶液為濃度為0.05-2M的水溶液，無機堿溶液為濃度為0.1-0.5M的水溶液，再生3-8小時。
[0043]不同的鹽濃度作為離子交換解析劑，能夠將不同分子量規格的透明質酸鈉聚合物從樹脂上置換出來，可得到不同分子量規格的透明質酸鈉成品。
[0044]在一些實施例中，步驟(6)中用1.5-2倍體積95 %乙醇沉淀。
[0045]在一些實施例中，本發明提供了一種透明質酸鈉分子量分級的方法，其特征在于，包含以下步驟:
[0046](a)配制分子量為50-95萬Da的透明質酸鈉溶液，其溶液濃度為l-10g/L;
[0047](b)向步驟(a)透明質酸鈉溶液中添加4%-40%(w/v)的強堿陰離子交換樹脂，室溫攪拌吸附3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13小時；
[0048](c)加入0.05-2M第一強電解質鹽水溶液，靜置解析樹脂3-8小時，收集第一解析液；
[0049](d)加入0.05-2M第二強電解質鹽水溶液，攪拌解析樹脂3-24小時，收集第二解析液；
[0050](e)加入0.05-2M第三強電解質鹽水溶液和0.1-0.5M無機堿水溶液再生樹脂3_24小時，收集再生液；
[0051 ] (f)分別對第一解析液、第二解析液和再生液用1.5-2倍體積95%乙醇沉淀；
[0052](g)干燥。
[0053]在一些實施例中，本發明提供的方法進一步的包括:攪拌吸附前，用酸或堿調節透明質酸鈉溶液的PH值為5-7。
[0054]本發明提供的透明質酸鈉分子量分級的方法，使用一種成本低，操作簡單的樹脂分離技術，且采用靜態吸附，適合于大規模化生產;特別是能夠將50-95萬Da的透明質酸分子量分級成醫藥用途以及化妝品用途所需的分子量，3種不同分子量規格的透明質酸鈉成品，充分提高其商業價值。
[0055]本發明所使用的術語“強電解質鹽”在溶液中全部以離子的形態存在，即不存在電解質的“分子”。
[0056]本發明所使用的術語“溶液”是指適用于本發明所述方法的任何溶液，包括單一溶劑溶液或混合溶劑溶液。在一些實施例中為水溶液。
[0057]本發明所使用的術語“鹵代鹽”是指在溶液中全部以離子的形態存在的強電解質型鹵代鹽。
[0058]本發明所使用的術語“硫酸鹽”是指在溶液中全部以離子的形態存在的強電解質型硫酸鹽。
[0059]本發明所使用的術語“硝酸鹽”是指在溶液中全部以離子的形態存在的強電解質型硝酸鹽。
[0060]本發明所使用的術語“強堿”是指堿金屬和部分堿土金屬對應的堿。
[0061 ]下面簡寫詞的使用貫穿本發明:
[0062]w/v 質量體積比
[0063]NaCl 氯化鈉
[0064]CaCl2 氯化鈣
[0065]ZnCl2 氯化鋅
[0066]Na2SO4硫酸鈉
[0067]NaNO3硝酸鈉
[0068]NaOH氫氧化鈉
[0069]KOH氫氧化鉀
[0070]Da道爾頓
[0071]g/L克每升
[0072]M摩爾每升
【具體實施方式】
[0073]本發明實施例公開了一種透明質酸鈉分子量分級的方法。本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
【發明內容】
、精神和范圍內對本文所述的產品及方法進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。
[0074]為了進一步理解本發明，下面結合實施例對本發明提供的一種透明質酸鈉分子量分級的方法進行詳細說明。
[0075]實施例1
[0076]取分子量為74.7萬Da的透明質酸鈉樣品1.0g，溶于600mL純化水中，得到濃度為1.67g//L的透明質酸鈉溶液，用lmol/L的NaOH或HCl調節透明質酸鈉溶液的pH值為6.5后加入強堿陰離子交換樹脂40.0g攪拌吸附8h。過濾溶液得樹脂。解吸附過程分為3個階段:先加入2M的NaCl 600mL溶液靜置解析3h，期間每隔Ih攪動一次，后過濾得第一解析液;再加入2M的NaCl 600mL溶液攪拌解析3h，攪拌轉速10rpm后過濾得到第二解析液;最后加入2M NaCl+0.1M NaOH 600mL溶液攪拌再生3h后過濾得到再生液。第一解析液與第二解析液和再生液分別用2倍體積95%的乙醇沉淀，真空干燥得到3種不同分子量的透明質酸鈉成品。
[0077]采用GPC凝膠色譜法測定分子量，第一解析液的透明質酸鈉分子量147萬Da收率25.18%;第二解析液的透明質酸鈉分子量106萬Da收率23.05%;再生液透明質酸鈉的分子量為35.8萬Da收率45.31 %。
[0078]實施例2
[0079]取分子量為74.7萬Da的透明質酸鈉樣品1.0g，溶于600mL純化水中，得到濃度為1.67g//L的透明質酸鈉溶液，用lmol/L的NaOH或HCl調節透明質酸鈉溶液的pH值為6.5后加入強堿陰離子交換樹脂樹脂40.0g攪拌吸附8h。過濾溶液得樹脂。解吸附過程分為3個階段:先加入0.1M的NaCl 600mL溶液靜置解析3h，期間每隔Ih攪動一次，后過濾得第一解析液;再加入2M的NaCl 600mL溶液攪拌解析3h，攪拌轉速10rpm后過濾得到第二解析液;最后加入2M NaCl+0.lM NaOH 600mL溶液攪拌再生3h后過濾得到再生液。第一解析液與第二解析液和再生液分別用2倍體積95%的乙醇沉淀，真空干燥得到3種不同分子量的透明質酸鈉成品O
[0080]采用GPC凝膠色譜法測定分子量，第一解析液的透明質酸鈉分子量98.8萬Da收率7.1 %，第二解析液的透明質酸鈉分子量132萬Da收率37.87%，再生液透明質酸鈉的分子量為 29.8 萬 Da 收率 40.31 %。[0081 ] 實施例3
[0082]取分子量為92.5萬Da的透明質酸鈉樣品1.0g，溶于600mL純化水中，得到濃度為I.67g/L的透明質酸鈉溶液，pH值為5.65。向其中加入強堿陰離子交換樹脂40.0g攪拌吸附8h。過濾溶液得樹脂。解吸附過程分為3個階段:先加入2M NaCl 600mL溶液靜置解析3h，期間每隔Ih攪動一次，后過濾得第一解析液;再加入2M的NaCl 600mL溶液攪拌解析3h，攪拌轉速10rpm后過濾得到第二解析液;最后加入2M NaCl+0.lM NaOH 600mL溶液攪拌再生3h后過濾得到再生液。第一解析液與第二解析液和再生液分別用2倍體積95 %的乙醇沉淀，真空干燥得到3種不同分子量的透明質酸鈉成品。
[0083]采用GPC凝膠色譜法測定分子量，第一解析液的透明質酸鈉分子量169.7萬Da收率26.5%，第二解析液的透明質酸鈉分子量110萬Da收率22.15%，再生液透明質酸鈉的分子量分子量為45.8萬Da收率41.65 %。
[0084]以上實施例的說明只是用于幫助理解本發明的方法及其核心思想。應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以對本發明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發明權利要求的保護范圍內。
【主權項】
1.一種透明質酸鈉分子量分級方法，其特征在于，包含以下步驟: (1)配制透明質酸鈉溶液； (2)向步驟(I)透明質酸鈉溶液中添加4%-40%(w/v)的強堿陰離子交換樹脂，攪拌吸附； (3)加入第一強電解質鹽溶液，靜置解析樹脂，收集第一解析液； (4)加入第二強電解質鹽溶液，攪拌解析樹脂，收集第二解析液； (5)加入第三強電解質鹽溶液和無機堿溶液再生樹脂，收集再生液； (6)分別對第一解析液、第二解析液和再生液進行乙醇沉淀； (7)干燥。2.根據權利要求1所述的方法，其特征是第一強電解質鹽、第二強電解質鹽和第三強電解質鹽各自獨立地為 NaCl、CaCl2、ZnCl2、Na2S04、MgCl2、MgS04 或 NaNO3;無機堿是 NaOH 或 KOH。3.根據權利要求1所述的方法，其特征是步驟⑴中透明質酸鈉分子量為50-95萬Da^為溶液濃度為1-1 Og/L的水溶液。4.根據權利要求1所述的方法，其特征是步驟(2)中攪拌吸附在室溫下進行3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 或13 小時。5.根據權利要求1-4任一項所述的方法，其特征是步驟(3)中第一強電解質鹽溶液為濃度為0.05-2M的水溶液，靜止解析3-8小時。6.根據權利要求1-4任一項所述的方法，其特征是步驟(4)中第二強電解質鹽溶液為濃度為0.05-2M的水溶液，攪拌解析3-24小時。7.根據權利要求1-4任一項所述的方法，其特征是步驟(5)中第三強電解質鹽溶液為濃度為0.05-2M的水溶液，無機堿溶液為濃度為0.1-0.5M的水溶液，再生3_24小時。8.根據權利要求1-4任一項所述的方法，其特征是步驟(6)中用1.5-2倍體積95%乙醇沉淀。9.根據權利要求1-4任一項所述的方法，其特征在于，包含以下步驟: (a)配制分子量為50-95萬Da的透明質酸鈉溶液，其溶液濃度為l-10g/L; (b)向步驟(a)透明質酸鈉溶液中添加4%-40%(w/v)的強堿陰離子交換樹脂，室溫攪拌吸附3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13小時； (c)加入0.05-2M第一強電解質鹽水溶液，靜置解析樹脂3-8小時，收集第一解析液； (d)加入0.05-2M第二強電解質鹽水溶液，攪拌解析樹脂3-24小時，收集第二解析液； (e)加入0.05-2M第三強電解質鹽水溶液和0.1-0.5M無機堿水溶液再生樹脂3_24小時，收集再生液； (f)分別對第一解析液、第二解析液和再生液用I.5-2倍體積95 %乙醇沉淀； (g)干燥。10.根據權利要求1所述的方法，其特征是進一步的包括:攪拌吸附前，用酸或堿調節透明質酸鈉溶液的PH值為5-7。
【文檔編號】C08B37/08GK105949348SQ201610289516
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月3日
【發明人】羅明明, 石江水, 林小鵲, 王海剛, 屈代鑫, 郭振權, 趙裕棟, 張鴻, 李文佳
【申請人】廣東東陽光藥業有限公司