埃可病毒1型vp1蛋白特異性抗原表位及其融合蛋白的制備、應用

埃可病毒1型vp1蛋白特異性抗原表位及其融合蛋白的制備、應用
【專利摘要】本發明埃可病毒1型VP1蛋白特異性抗原表位及其融合蛋白的制備、應用涉及基因工程技術、疫苗和診斷試劑領域。本發明是通過計算機分析埃可病毒1型表面蛋白VP1氨基酸序列，篩選出含強特異性抗原表位的蛋白片段，即第75位氨基酸至第140位氨基酸，第203位氨基酸至第236位氨基酸，這兩個蛋白片段之間通過兩個甘氨酸和一個絲氨酸連接，形成一個抗原表位融合蛋白。選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學合成該抗原表位融合蛋白的全新基因序列，利用基因工程技術，表達制備埃可病毒1型VP1蛋白抗原表位融合蛋白，用于埃可病毒抗體檢測試劑的研制，及用于埃可病毒單抗和多抗制備。
【專利說明】
埃可病毒1型VP1蛋白特異性抗原表位及其融合蛋白的制備、 應用
技術領域
[0001] 本發明埃可病毒1型VP1蛋白特異性抗原表位及其融合蛋白的制備、應用涉及的是 篩選出含強抗原表位的埃可病毒1型的表面VP1蛋白片段，利用基因工程技術，制備埃可病 毒1型的VP1蛋白抗原表位的融合蛋白。選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學合成全 新的VP1蛋白抗原表位融合蛋白的基因序列，利用基因工程技術表達融合蛋白，表達的融合 蛋白可用于埃可病毒疫苗及抗體檢測試劑的研制等，本發明涉及基因工程技術、疫苗和診 斷試劑領域。
【背景技術】
[0002] 人腸道致細胞病變孤兒病毒（Enteric Cytopathogenichuman Orphan Virus， ECHO)，簡稱埃可病毒，是一類單股正鏈RNA的腸道病毒，有34個血清型。最初對其致病性并 不清楚，后來證明埃可病毒與無菌腦膜炎、嬰兒腹瀉、手足口病等多種疾病有關。大量研究 和數據分析最終顯示，本病遍布世界各地，在人群中引起廣泛傳播或流行，其感染可引起無 菌性腦膜炎、發疹、胃腸道疾病、肝炎和肺炎等多種人類疾病，其中無菌性腦膜炎最為常見， 可通過呼吸道和消化道傳播。孕婦感染后可通過胎盤傳播給胎兒，可引起胎兒畸形甚至死 胎。研究調查發現，埃可病毒1型可導致無菌性腦膜炎、麻痹、腦炎、心包炎、心肌炎、皮疹和 輕度呼吸道和腸道疾病，也曾在河南病患兒童中引起手足口病，應該受到廣泛的關注。
[0003] 埃可病毒VP1與決定血清型的抗原決定因子密切相關，由于VP1區序列分型結果與 中和試驗鑒定結果具有一致性，而VP1蛋白是病毒中和的主要決定因子，其保守性有利于疫 苗開發，也使其作為檢測試劑提供可行性和可能性。目前對其全基因序列已經測定，為利用 基因工程技術研究診斷試劑、疫苗及篩選抗病毒藥物奠定了基礎。
[0004] 目前，對埃可病毒的檢測方法主要包括平板分離培養法、酶聯免疫吸附試驗、分子 生物學方法。但是，這些方法所需成本較高、需要特定設備、耗時且需要對樣品進行復雜的 處理，限制其在生活中的廣泛應用。建立一種簡單、快速、適合現場應用的埃可病毒的檢測 方法有重要意義。而研制特異的基因重組抗原是建立埃可病毒特異抗體檢測試劑的發展方 向。

【發明內容】

[0005] 本發明目的是針對上述不足之處提供一種埃可病毒1型VP1蛋白特異性抗原表位 及其融合蛋白的制備、應用，本發明是篩選出含強抗原表位的埃可病毒1型的表面VP1蛋白 片段，利用基因工程技術，制備埃可病毒1型的表面VP1蛋白片段的融合蛋白。通過計算機分 析，從埃可病毒1型表面蛋白VP1中篩選出2個含強抗原表位的蛋白片段，分別為第75位氨基 酸至第140位氨基酸，第203位氨基酸至第236位氨基酸，選擇真核和原核生物均偏愛的密碼 子，兩段蛋白片段之間通過兩個甘氨酸和一個絲氨酸連接，構成總長度為103個氨基酸的序 列，化學合成全新的基因序列，利用基因工程技術在大腸桿菌BL2UDE3)中表達該基因。表 達的蛋白可用于疫苗研制，亦可用于單克隆抗體和多克隆抗體的制備，為埃可病毒檢測方 法的建立奠定了基礎。
[0006] 埃可病毒外層的VP1蛋白，是介導病毒和宿主細胞結合的主要蛋白，同時其又具有 較高的保守性，在各型的埃可病毒中變異很小，所以是用作抗原研制埃可病毒抗體檢測試 劑的理想蛋白。通過計算機分析埃可病毒1型VP1蛋白的氨基酸序列，我們篩選出抗原表位 的富集區，選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子優化基因序列，化學合成全新的基因序列， 利用基因工程技術表達融合蛋白，表達的融合蛋白具有較好的抗原性和特異性，可用于單 克隆抗體和多克隆抗體的制備，組裝膠體金試劑條，為埃可病毒快速檢測方法的建立奠定 基礎。
[0007] 埃可病毒1型VP1蛋白特異性抗原表位及其融合蛋白的制備、應用是采取以下步驟 實施的： 一種埃可病毒1型VP1蛋白抗原表位的融合蛋白，由2段含強特異性抗原表位的VP1蛋白 片段組成，2段蛋白片段之間由甘氨酸和絲氨酸連接，整合為全長103個氨基酸的融合蛋白， 氨基酸序列如下：
[0008] 所述的埃可病毒1型VP1蛋白抗原表位的融合蛋白，其中2段含強特異性抗原表位 的VP1蛋白片段具體為第75位氨基酸至第140位氨基酸、第203位氨基酸至第236位氨基酸， 各段氨基酸序列如下： Seqencel:第75位aa -第 140位aa:
[0009] 所述的埃可病毒1型VP1抗原表位融合蛋白中，2段含強特異性抗原表位的表面VP1蛋白 片段，這2段VP1蛋白片段的單個或任意組合的融合蛋白。
[0010]所述的埃可病毒1型表面蛋白vpi的融合蛋白，通過基因重組技術，利用細菌、酵母 細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞及轉基因動植物進行重組表達、制備。
[0011] 所述的埃可病毒1型2個VP1蛋白片段的單個或任意組合的融合蛋白用于埃可病毒 抗體檢測試劑的制備及用于免疫制備抗埃可病毒單抗和多抗制備。
[0012] 埃可病毒1型VP1蛋白特異性抗原表位及其融合蛋白的制備方法如下： 1.埃可病毒1型VP1蛋白抗原表位的篩選及其基因片段的化學合成： 利用ANTHEWIN、DNAStar等軟件，通過計算機分析埃可病毒1型VP1蛋白的全氨基酸序 列，篩選出2個含強抗原表位的蛋白片段，分別為第75位氨基酸至第140位氨基酸，第203位 氨基酸至第236位氨基酸含有較強的抗原表位。2段蛋白片段之間通過兩個甘氨酸和一個絲 氨酸連接，構成總長度為103個氨基酸的融合蛋白。選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子， 化學合成該融合蛋白的全新基因序列。在合成的基因片段的5'端增加的酶切位點 (下畫線部分），在3'端增加了終止密碼子TAA和處 〇 I酶切位點（下畫線部分），使合成的基 因片段易于克隆至質粒PGEX-4T-2內的你通1和處〇頂每切位點內。
[0013] 篩選的埃可病毒1型VP1蛋白內2個含強抗原表位的蛋白片段： Seqencel:第75位aa -第 140位aa:
2個含強抗原表位蛋白片段連接在一起形成融合蛋白，該融合蛋白的氨基酸序列：
化學合成的埃可病毒1型表面蛋白VP1抗原表位融合蛋白的DNA序列(324bp) 2.表達埃可病毒1型VP1抗原表位融合蛋白重組質粒的構建：
提取質粒PGEX-4T-2,用I雙酶切，電泳后回收酶切的質粒大片段，溶于 去離子水內；同時用你通1和處〇 I雙酶切化學合成埃可病毒1型VP1抗原表位融合蛋白的基 因片段，電泳回收后，溶于去離子水內。
[0014]取等摩爾濃度的上述酶切后DNA片段，在同一離心管內用T4 DNA連接酶連接，使 化學合成埃可病毒1型VP1蛋白基因片段插入到載體PGEX-4T-2內的I位點之 間，與載體上的起始密碼子翻譯框架一致，表達一個埃可病毒1型VP1抗原表位融合蛋白。
[0015] 3.重組質粒的篩選與鑒定： 將重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)，涂布含100μg/ml氨芐霉素的LB平板，置37°C過 夜，次日隨機挑取轉化菌落和含PGEX-4T-2質粒的對照菌，接種至含4mlLB培養基(含氨芐霉 素 100μg/ml)的試管內振搖，分別提取質粒，用feMn肩7處〇 I雙酶切驗證，1.0%的瓊脂糖凝 膠電泳結果表明，切下324bp的目的基因片段。同時，將含有外源基因的質粒進行DNA測序分 析，測序結果證實重組質粒含有埃可病毒1型表面蛋白VP1基因片段，序列完全正確：
構建的重組質粒表達埃可病毒1型VP1抗原表位融合蛋白基因片段（103個氨基酸），在 其N端融合了載體上的226個氨基酸，全長329個氨基酸，其氨基酸序列如下：

4. 表達融合蛋白工程菌的篩選鑒定： 將含有重組質粒的陽性轉化子，接種至含4ml LB培養基(含氨芐毒素 lOOμg/ml)的試管 內，37°C振蕩培養4h，加 IPTG至終濃度0.2 mmol/L，繼續振蕩培養誘導4h，離心收集菌體進 行SDS-PAGE檢測，重組子表達相對分子量為35 kD的埃可病毒1型VP1抗原表位融合蛋白，而 對照菌PGEX-4T-2無此蛋白條帶。
[0016] 5. 表達埃可病毒1型VP1抗原表位融合蛋白的純化： 1)表達埃可病毒1型VP1抗原表位融合蛋白工程菌的超聲裂解 將誘導表達融合蛋白的工程菌離心(8000 rpm、20 min、4°C)收菌，菌體重懸于原培養 液 1/10體積的細菌裂解液（20 mmol/L PB pH8.0、10 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT、5% 甘 油）內，冰浴超聲破菌75次，8000rpm，4°C，離心20min收集上清。收集的上清用于下一步的親 和層析純化。
[0017] 2)表達埃可病毒1型VP1抗原表位融合蛋白的純化 上清溶液加已經平衡的High-Affinity GST Resin 10ml，4°C結合過夜，上樣，收集穿 透液。用十倍柱床體積的1 X (含ImM PMSF)洗滌柱子，接著用50ml高濃度的GSH洗脫液， 洗脫液為50 mmol/L Tris-HCl pH8.5 + 10 mmol/L GSH，分三次洗脫目的蛋白，即為純化 的埃可病毒1型VP1抗原表位融合蛋白。
[0018] 6. 純化的埃可病毒1型VP1抗原表位融合蛋白用于埃可病毒疫苗研制； 7.將表達的埃可病毒1型VP1抗原表位融合蛋白，用于免疫新西蘭大白兔，制備多克隆 抗體。
[0019] 8. 將制備的埃可病毒1型VP1抗原表位融合蛋白和多克隆抗體組裝膠體金試劑條，把埃 可病毒1型VP1抗原表位融合蛋白作為抗原，研制抗體檢測試劑。
[0020] 9. 將埃可病毒1型表面蛋白VP1篩選優化的抗原表位連接，以融合蛋白的形式進行表 達、制備。
[0021] 10. 通過基因重組技術，利用細菌、酵母細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞及轉基因動植物 進行重組表達、制備埃可病毒1型VP1抗原表位融合蛋白。
[0022] 上述所述的方法制備的埃可病毒1型VP1抗原表位融合蛋白的基因片段，用于埃可病毒 抗體的檢測及單抗和多抗的制備，并用于膠體金試劑條的組裝。
[0023] 英文縮寫說明:EDTA:四甲基乙二胺；IPTG:異丙基硫代半乳糖苷；DTT:二硫蘇糖醇； SDS:十二烷基磺酸納;PAGE:聚丙烯酰胺凝膠電泳；PB:磷酸鹽緩沖液；DNA:脫氧核糖核 酸；RNA:核糖核酸；kD:千道爾頓;PMSF:苯甲基磺酰氟;GSH:谷胱甘肽。
[0024] 本發明與現有技術相比具有的優點 我們表達的埃可病毒1型VP1抗原表位融合蛋白，有較多優點： 1.現在應用的埃可病毒抗體檢測試劑，多采用進口抗原或病毒培養抗原，生產不便、且 成本高。表達的埃可病毒1型VP1抗原表位融合蛋白用作抗原可克服上述缺點。
[0025] 2.根據篩選出的埃可病毒1型VP1抗原表位氨基酸序列，選擇真核和原核生物均偏 愛的密碼子，化學合成全新的基因序列，該基因適宜在真核及原核細胞內高表達。
[0026] 3.構建表達埃可病毒1型表面蛋白VP1抗原表位融合蛋白的工程菌，表達量高，且 表達的蛋白以可溶性形式存在，易于純化，且不需要復性處理。
[0027] 4.傳統的滅活疫苗的研究取得了一定進展，但是生產成本高、危險大，使臨床應用 受限。埃可病毒1型表面蛋白VP1是病毒中和的主要決定因子，是病毒與宿主結合的主要蛋 白，并且具有良好的保守性，所以VP1蛋白是研制疫苗的首選蛋白。本發明就篩選出的VP1蛋 白中抗原表位富集區進行重組，利用基因工程技術進行表達制備，得到的全新融合蛋白為 研制基因工程疫苗奠定基礎。基因工程疫苗具有安全、成本低的優點。
【附圖說明】
[0028] 以下將結合附圖對本發明作進一步說明： 圖1是分子生物學軟件對埃可病毒1型表面蛋白VP1的抗原表位進行分析結果。結果顯 示，在埃可病毒1型VP1蛋白N端從第75位氨基酸至第140位氨基酸，第203位氨基酸至第236 位氨基酸，含有強的親水性抗原表位，即圖內箭頭標示的位置。
[0029]圖2是表達埃可病毒1型VP1蛋白2個片段的融合蛋白的重組質粒構建流程圖。 [0030] 圖3是用1.0%的Agarose凝膠檢測重組質粒的雙酶切圖。M: DNA marker DL10000 (TaKaRa) ; 1:重組質粒pGEX-4T-2-VPl經I雙酶切下324bp的目的基因片段，即 圖中箭頭標示的位置;2:質粒pGEX-4T-2經及拙瓜1?酶切沒有目的條帶出現。
[0031]圖4是表達埃可病毒1型表面蛋白VP 1重組菌的SDS-PAGE分析結果。將構建的重組 質粒轉化到大腸桿菌中，挑單菌落后篩選高產菌株的SDS-PAGE電泳圖。Μ:蛋白marker (賽默 飛）;E1①-⑥:埃可病毒1型表面蛋白VP1重組菌，六個重組子均表達相對分子量35kDa的融 合蛋白，即圖中箭頭標示的位置;陰參:對照菌含PGEX-4T-2質粒。
[0032]圖5是表達埃可病毒1型VP1抗原表位融合蛋白純化后的SDS-PAGE分析結果。M:蛋 白marker; 1:BSA，濃度為lmg/ml ;2:High-Affinity GST Resin親和層析柱純化后的埃可 病毒1型表面蛋白VP1，0D28Q=0.3，濃度為0.4mg/ml，相對分子量35kDa處的蛋白條帶。
[0033]圖6是ELISA檢測兔抗血清結果。表達的埃可病毒1型表面蛋白VP1免疫的新西蘭大 白兔 制備抗血清，血清效價達1:10240000。
【具體實施方式】
[0034]本發明實施方式的詳細說明： 埃可病毒1型表面蛋白VP1抗原表位的分析、基因合成及表達 通過計算機分析埃可病毒1型的表面蛋白VP1的氨基酸序列，篩選出含強抗原表位的埃 可病毒1型的VP1蛋白片段，發現2個含有較強抗原表位的蛋白片段，分別為第75位氨基酸至 第140位氨基酸，第203位氨基酸至第236位氨基酸，2個蛋白片段之間通過2個甘氨酸和1個 絲氨酸連接，構成總長度為103個氨基酸的抗原表位融合蛋白。選擇真核和原核生物均偏愛 的密碼子，化學合成上述表位融合蛋白的全新基因序列。在合成的基因片段的5'端增加了 的酶切位點，在3 '端增加了終止密碼子I酶切位點，使合成的基因片段易于 克隆至質粒PGEX-4T-2內的和處〇頂每切位點內，與載體上的起始密碼子的翻譯框架 一致，表達埃可病毒1型的VP1抗原表位融合蛋白。將重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)，篩 選獲得了高效表達埃可病毒1型的VP1抗原表位融合蛋白的工程菌，表達的埃可病毒1型的 VP1抗原表位融合蛋白占菌體蛋白總量的20%，并且為可溶性蛋白。
[0035]材料與方法 1.菌種與質粒：宿主菌BL21(DE3)及表達載體PGEX-4T-2為南京軍區軍事醫學研究所 醫藥生物所保存。
[0036] 2.分子生物學試劑：限制性內切酶I、及T4 DNA連接酶為TaKaRa公司 產品。質粒純化試劑盒及從瓊脂糖凝膠內回收DNA片段的試劑盒為TaKaRa公司產品。DTT及 IPTG為BI0SHARP公司產品。其它試劑為進口或國產分析純試劑。
[0037] 3.基因片段的合成：由南京金斯瑞生物科技有限公司幫助合成。
[0038] 4.基因克隆方法：DNA的酶切、連接、電泳；質粒的提取、轉化；蛋白的SDS-PAGE 分析等一般分子克隆方法按常規方法進行。其它試劑盒按說明書進行操作。
[0039] 5. DNA序列分析:用TaKaRa公司質粒純化試劑盒純化質粒，用DNA全自動測序儀測 序。
[0040] 結果 1.埃可病毒1型的表面蛋白VP1抗原表位的篩選及其基因片段的化學合成： 利用ANTHEWIN、DNAStar等軟件，通過計算機分析埃可病毒1型VP1蛋白的全氨基酸序列 (GeneBank，接通號:AFV34557.1)，發現VP1蛋白的第75位氨基酸至第140位氨基酸和第203 位氨基酸至第236位氨基酸含有較強的抗原表位（如圖1)。
[0041] 篩選出的氨基酸序列如下： Seqencel:第75位aa -第 140位aa:
根據篩選出的埃可病毒1型的表面蛋白VP1內的抗原表位氨基酸序列，2個蛋白片段之 間通過兩個甘氨酸和一個絲氨酸連接，整合為一個全長為103個氨基酸的表位融合蛋白，氨 基酸序列如下：
根據篩選和設計連接的氨基酸序列，選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學合成 上述表位融合蛋白的全新基因序列。在合成的基因片段的5'端增加了I的酶切位點 (下畫線部分），在3'端增加了終止密碼子TAA和處 〇 I酶切位點（下畫線部分），使合成的基 因片段易于克隆至質粒PGEX-4T-2內的你通1和處〇頂每切位點內。
[0042]化學合成的埃可病毒1型VP1蛋白抗原表位融合蛋白的DNA序列(324 bp):
2. 表達埃可病毒1型VP1表位融合蛋白重組質粒的構建： 提取質粒PGEX-4T-2，用I雙酶切，1.0%的瓊脂糖凝膠電泳后回收酶切的 質粒大片段，溶于去離子水內；同時用你虛1和處〇 I雙酶切化學合成埃可病毒1型VP1表位 融合蛋白基因片段，電泳回收后，溶于去離子水內。
[0043]取等摩爾濃度的上述酶切后DNA片段，在同一離心管內用T4 DNA連接酶16°C，過 夜連接，使化學合成埃可病毒1型VP1表位融合蛋白基因片段插入到載體PGEX-4T-2內的 Banill 和 處〇 I位點之間，與載體上的起始密碼子翻譯框架一致，表達一個埃可病毒1型VP1抗原 表位融合蛋白。構建流程見圖2。
[0044] 3. 重組質粒的篩選與鑒定： 將上步連接的重組質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)，將轉化產物涂布含氨芐霉素（100μ g/ml)的固體LB培養基上，置37 °C培養過夜。次日隨機挑選6個轉化子菌落(分別標記為1 一 6 號），同時，挑一個空質粒PGEX-4T-2轉化的對照菌，標記為陰參，分別接種到含4 ml液體LB 培養基(含氨芐霉素 lOOwg/ml)的試管內，置37°C振蕩培養5h，提取重組質粒。用你通1和處〇 I雙酶切，用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。重組質粒切出324bp的目的基因片段，見圖3， 而含質粒PGEX-4T-2的對照菌沒有切出該基因片段。初步證實，轉化子含有埃可病毒1型VP1 表位融合蛋白的基因片段。
[0045]提取重組子的質粒，DNA序列分析證實，重組質粒含有埃可病毒1型VP1表位融合蛋 白的基因片段，序列完全正確：
構建的重組質粒可表達病毒1型VP1表位融合蛋白，長103個氨基酸，在其N端融合了載 體上的226個氨基酸，全長329個氨基酸，其氨基酸序列如下：
4.表達融合蛋白工程菌的篩選鑒定：
將含有重組質粒的陽性轉化子和一個空質粒PGEX-4T-2轉化的對照菌，接種至含4ml LB培養基的試管中，試管內培養基含氨節霉素100μg/ml，37°C振蕩培養4h，保存菌種并對于 編號后，加 IPTG至終濃度0.2 mmol/L，繼續在25°C下振蕩培養誘導4h，離心收集菌體進行 SDS-PAGE檢測，第1-6號6個轉化子均表達了相對分子量為35kDa的埃可病毒1型的VP1抗原 表位融合蛋白，表達量為20%，并選取3號菌種為高表達菌株，用于后面的蛋白純化，而對照 菌無此蛋白條帶，見圖4。
[0046] 表達埃可病毒1型的VP1抗原表位融合蛋白的純化 根據表達埃可病毒1型的VP1抗原表位融合蛋白的氨基酸序列，分析其理化特性，確定 適當的純化方法。我們所表達的埃可病毒1型的VP1表位融合蛋白融合有載體上的GST蛋白， 表達的GST融合蛋白可很方便的用GSH瓊脂糖凝膠FF分離，因此我們決定采用親和層析法， 用High-Affinity GST Resin進行純化。具體步驟如下： 材料和方法 1. 主要試劑： High-Affinity GST Resin為南京金斯瑞生物科技有限公司產品，IPTG、DTT為 BI0SHARP公司產品。其它試劑均為國產或進口分析純試劑。
[0047] 2. 表達埃可病毒1型的VP1抗原表位融合蛋白工程菌的誘導表達及超聲裂解： 把保存的3號菌株接種到含200ml LB液體培養基的三角燒瓶內，加氨芐霉素至終濃度 lOOpg/ml，置37°C搖床內培養過夜。次日，將菌液接種到4個分別含200 ml LB液體培養基的 三角燒瓶，每瓶接種菌液50 ml，置37°C搖床內振蕩培養1小時，然后加 IPTG至終濃度0.2 mmol/L,誘導表達4小時。
[0048] 將誘導表達融合蛋白的1000 ml工程菌離心(8000 rpm、20 min、4°C)收菌，菌體重 懸于300 ml的細菌裂解液（20 mmol/L PB pH8.0、10 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT、5% 甘 油）內，冰浴超聲破菌10 min，離心(8000rpm、20 min、4°C )收集上清。收集的上清用于親和 層析純化。
[0049] 3.表達埃可病毒1型的VP 1抗原表位融合蛋白的純化： 上清溶液加已經平衡的High-Affinity GST Resin 10 ml，4°C結合過夜，上樣，收集穿 透液。用十倍柱床體積的1 XTOS(含ImM PMSH洗滌柱子，接著用50 ml高濃度的GSH洗脫液， 洗脫液為50 mmol/L Tris-HCl pH8.5 + 10 mmol/L GSH，分三次洗脫目的蛋白，即為純化 的埃可病毒1型VP1蛋白片段。
[0050] 結果 將Hi gh-Af f ini ty GST Res in凝膠柱上洗脫的蛋白進行SDS-PAGE分析，結果顯示，經誘 導明顯表達出VP1-GST融合蛋白，表達產物主要存在于上清液中，分子量35kDa，見圖5。洗脫 測得的0D28Q=0.3，通過計算得濃度為0.4mg/ml，SDS-PAGE顯示表達產物純度在90%以上。
[0051] 純化的埃可病毒1型VP1表位融合蛋白的應用 將純化的重組埃可病毒1型VP1抗原表位融合蛋白用作抗原，免疫新西蘭大白兔，制備 多克隆抗體血清。采用間接ELISA法檢測抗血清效價，結果證實，埃可病毒1型VP1表位融合 蛋白具有較好的免疫原性和抗原性。
[0052]材料和方法 1. 主要材料： 新西蘭大白兔購自南京市浦口區萊芙養殖場，96孔酶標板為美國Costar公司產品，完 全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑為sigma公司產品，Goat Anti-rabbit IgG HRP為北京博奧 森公司產品，TMB顯色液為Beyot ime公司產品。其他試劑均為國產或進口分析純。
[0053] 2. 動物免疫及抗血清制備： 挑取兩只2kg左右的健康雌性新西蘭大白兔，耳緣靜脈取血約lml，制備免疫前正常血 清，作為陰性對照。首次免疫將純化獲得的埃可病毒1型VP1表位融合蛋白與弗氏完全佐劑 按體積比1:1在注射器內推成乳劑，進行背部皮下多點注射。在初次免疫后第2W、第4W將純 化獲得的VP1表位融合蛋白與弗氏不完全佐劑按體積比1:1在注射器內推成乳劑，進行背部 皮下多點注射。在第6W注射VP1表位融合蛋白，1W后取血檢測血清效價。勁動脈取血，室溫放 置lh，4°C靜置過夜，以3000rpm離心15 min，取上清，重復離心一次，取上清，即為得到的多 克隆抗體，-20°C保存。
[0054] 3. 免疫動物血清的ELISA檢測： 將純化獲得的埃可病毒1型VP1表位融合蛋白稀釋至lμg/ml，每孔100μ1包被96孔酶聯 板，4 °C過夜。用TBST洗滌3次，每孔加20%的小牛血清封閉液150μ1，37 °C封閉2h。兔抗血清從 1:1000開始稀釋，陰性對照按相同比例稀釋，37°C反應lhJBST洗滌3次后，加入有HRP標記 的山羊抗兔的I gG( 1:5000)，37°C反應30 miruPBST洗滌5次后，加入TMB顯色液，37°C避光顯 色20 min，以lmol/L HC1終止反應，用酶標儀檢測A45Q值。以P/N彡2.1的抗體最大稀釋度作 為效價終值。
[0055] 結果 采用ELISA法檢測抗血清的效價，兔抗血清從1:1000開始稀釋，同時取免疫前的血清作 為陰性對照，ELISA結果顯示，VP1表位融合蛋白加強免疫后血清效價大于1:10240000,陰性 對照不顯色，見圖6。說明制備的埃可病毒1型VP1表位融合蛋白具有良好的免疫原性和抗原 性。
[0056] 化學合成的VP1表位融合蛋白的基因片段序列表見附件文檔:核苷酸或氨基酸序列表 計算機可讀載體。
【主權項】
1. 一種埃可病毒1型VP1蛋白抗原表位的融合蛋白，由2段含強特異性抗原表位的VP1蛋 白片段組成，2段蛋白片段之間由甘氨酸和絲氨酸連接，整合為全長103個氨基酸的融合蛋 白，氨基酸序列如下：2. 權利要求1所述的埃可病毒1型VP1抗原表位融合蛋白，其特征在于，所述的埃可病毒 1型VP1蛋白抗原表位的融合蛋白，其中2段含強特異性抗原表位的VP1蛋白片段具體為第75 位氨基酸至第140位氨基酸和第203位氨基酸至第236位氨基酸，各段氨基酸序列如下：3.權利要求1所述的埃可病毒1型VP1蛋白抗原表位的融合蛋白的制備方法，其特征在 于:采用基因工程技術表達、純化制備該蛋白，具體方法如下， 埃可病毒1型VP1蛋白抗原表位的篩選及其基因片段的化學合成： 利用ANTHEWIN、DNAStar等軟件，通過計算機分析埃可病毒1型VP1蛋白的全氨基酸序 列，篩選出2個含強抗原表位的蛋白片段，分別為第75位氨基酸至第140位氨基酸，第203位 氨基酸至第236位氨基酸含有較強的抗原表位； 2段蛋白片段之間通過兩個甘氨酸和一個絲氨酸連接，構成總長度為103個氨基酸的融 合蛋白； 選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學合成該融合蛋白的全新基因序列； 在合成的基因片段的5'端增加了 feMlI的酶切位點（下畫線部分），在3'端增加了終止 密碼子TAA和處〇1酶切位點（下畫線部分），使合成的基因片段易于克隆至質粒pGEX-4T-2內 的你通1和處〇頂每切位點內； 篩選的埃可病毒1型VP1蛋白內2個含強抗原表位的蛋白片段：2個含強抗原表位蛋白片段連接在一起形成融合蛋白，該融合蛋白的氨基酸序列：化學合成的埃可病毒1型表面蛋白VP1抗原表位融合蛋白的DNA序列(324bp)表達埃可病毒1型VP1抗原表位融合蛋白重組質粒的構建： 提取質粒PGEX-4T-2,用雙酶切，電泳后回收酶切的質粒大片段，溶于去 離子水內；同時用你通1和處〇1雙酶切化學合成埃可病毒1型VP1抗原表位融合蛋白的基因 片段，電泳回收后，溶于去離子水內； 取等摩爾濃度的上述酶切后DNA片段，在同一離心管內用T4 DNA連接酶連接，使化學 合成埃可病毒1型VP1蛋白基因片段插入到載體PGEX-4T-2內的肩《7?〇 I位點之間，與 載體上的起始密碼子翻譯框架一致，表達一個埃可病毒1型VP1抗原表位融合蛋白； 重組質粒的篩選與鑒定： 將重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)，涂布含100μg/ml氨芐霉素的LB平板，置37°C過 夜，次日隨機挑取轉化菌落和含PGEX-4T-2質粒的對照菌，接種至含4mlLB培養基(含氨芐霉 素100μg/ml)的試管內振搖，分別提取質粒，用你通1和處〇 I雙酶切驗證，1.0%的瓊脂糖凝 膠電泳結果表明，切下324bp的目的基因片段； 同時，將含有外源基因的質粒進行DNA測序分析，測序結果證實重組質粒含有埃可病毒 1型表面蛋白VP1基因片段，序列完全正確：構建的重組質粒表達埃可病毒1型VP1抗原表位融合蛋白基因片段（103個氨基酸），在 其N端融合了載體上的226個氨基酸，全長329個氨基酸，其氨基酸序列如下：表達融合蛋白工程菌的篩選鑒定： 將含有重組質粒的陽性轉化子，接種至含4ml LB培養基(含氨芐毒素 lOOμg/ml)的試管 內，37°C振蕩培養4h，加 IPTG至終濃度0.2 mmol/L，繼續振蕩培養誘導4h，離心收集菌體進 行SDS-PAGE檢測，重組子表達相對分子量為35 kD的埃可病毒1型VP1抗原表位融合蛋白，而 對照菌PGEX-4T-2無此蛋白條帶； 表達埃可病毒1型VP1抗原表位融合蛋白的純化： 將誘導表達融合蛋白的工程菌離心（8000 rpm、20 min、4°C)收菌，菌體重懸于原培養 液 1/10體積的細菌裂解液（20 mmol/L PB pH8.0、10 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT、5% 甘 油）內，冰浴超聲破菌75次，8000rpm，4°C，離心20min收集上清，收集的上清用于下一步的親 和層析純化； 上清溶液加已經平衡的High-Affinity GST Resin 10 ml，4°C結合過夜，上樣，收集穿 透液； 用十倍柱床體積的1 X PBS洗滌柱子，接著用50ml高濃度的GSH洗脫液，洗脫液為50 mmol/L Tris- HC1 pH8.5 + 10 mmol/L GSH，分三次洗脫目的蛋白，即為純化的埃可病毒 1型VP1抗原表位融合蛋白。4. 根據權利要求2所述的埃可病毒1型VP1抗原表位融合蛋白，其特征在于:所述的埃可 病毒1型VP1抗原表位融合蛋白中，2段含強特異性抗原表位的表面VP1蛋白片段，這2段VP1 蛋白片段的單個或任意組合的融合蛋白。5. 權利要求1所述的埃可病毒1型表面蛋白VP1的融合蛋白，通過基因重組技術，也可利 用酵母細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞及轉基因動植物進行重組表達、制備。6. 權利要求1或4所述的埃可病毒1型2個VP1蛋白片段的單個或任意組合的融合蛋白用 于埃可病毒抗體檢測試劑的制備，及用于免疫制備抗埃可病毒單抗和多抗制備。
【文檔編號】C07K19/00GK105949320SQ201610269754
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年4月27日
【發明人】李越希, 李素梅, 齊勇, 李佳萌, 潘英, 陳晨, 王新國, 李素芹, 陳紅霞, 徐亦非
【申請人】李越希