一種β-葡萄糖苷酶單克隆抗體及其制備方法
【專利摘要】本發明提供一種β?葡萄糖苷酶單克隆抗體的制備方法，包括以下步驟S1取抗原β?葡萄糖苷酶注射免疫小鼠；S2間接ELISA法測免疫小鼠的血清效價；S3挑選血清效價為20000以上的小鼠，取脾細胞與骨髓瘤細胞融合；S4融合后采用HAT培養液培養和間接ELISA檢測篩選，獲得陽性雜交瘤細胞；S5用有限稀釋法對陽性雜交瘤細胞進行克隆化直至出現陽性單克隆率為100％；S6采用小鼠體內誘生腹水法制備β?葡萄糖苷酶單克隆抗體；S7純化β?葡萄糖苷酶單克隆抗體。通過本發明方法制備的β?葡萄糖苷酶單克隆抗體具有高效價、高穩定性和高特異性。
【專利說明】
一種β-葡萄糖苷酶單克隆抗體及其制備方法
技術領域
[0001 ]本發明涉及單克隆抗體技術領域，尤其涉及一種β-葡萄糖苷酶單克隆抗體及其制 備方法。
【背景技術】
[0002] β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase，EC3.2.1.21)，又稱β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶， 分子量一般在40_250Kd之間，不同來源的β-葡萄糖苷酶相對分子量由其結構和組成不同而 差異較大。它能夠水解結合于末端非還原性的β-D-葡萄糖苷鍵，同時釋放出β-D-葡萄糖和 相應的配基。1837年，Liebig和Wohler首次在苦杏仁中發現。后來的研究發現，β-葡萄糖苷 酶存在于自然界許多植物、昆蟲、酵母、曲霉、木霉及細菌體內。它參與生物體的糖代謝，對 維持生物體正常生理功能起著重要作用。木薯(cassava)，別名木番薯、樹薯，是世界三大薯 類(馬鈴薯、甘薯、木薯)之一，也是全球六大糧食作物之一。木薯的塊根可作為食物、飼料以 及工業原料，到目前為止，世界上木薯產量的65 %用于人類食用，但是木薯塊根、莖葉等除 種子外各部分均含有生氰糖苷，當其進入人畜體內后，可被水解為有劇毒的氫氰酸(HCN)， 使組織細胞室息中毒。Anne Vinther Morant等研究發現木薯組織在受到破壞后，位于液泡 中的生氰糖苷與來源于乳管或者細胞壁中的葡萄糖苷酶相互作用就會被降解成氫氰酸， 而氫氰酸容易揮發，不容易檢測。本研究提供一種高純度的葡萄糖苷酶單克隆抗體及其 制備方法，為后續用免疫學檢測方法檢測木薯中葡萄糖苷酶，從而間接檢測木薯中氫氰 酸含量提供實驗基礎。
【發明內容】
[0003] 鑒以此，本發明提出一種β_葡萄糖苷酶單克隆抗體的制備方法，獲得的β_葡萄糖 苷酶單克隆抗體具有高效價和高穩定性。
[0004] 本發明的技術方案是這樣實現的：
[0005] -種β_葡萄糖苷酶單克隆抗體的制備方法，包括以下步驟：
[0006] S1:取抗原β_葡萄糖苷酶注射免疫小鼠；
[0007] S2:間接ELISA法測免疫小鼠的血清效價；
[0008] S3:挑選血清效價為20000以上的小鼠，取脾細胞與骨髓瘤細胞融合；
[0009] S4:融合后采用HAT培養液培養和間接ELISA檢測篩選，獲得陽性雜交瘤細胞；
[0010] S5:用有限稀釋法對陽性雜交瘤細胞進行克隆化直至出現陽性單克隆率為100%;
[0011] S6:采用小鼠體內誘生腹水法制備β-葡萄糖苷酶單克隆抗體；
[0012] S7:純化β-葡萄糖苷酶單克隆抗體。
[0013] 進一步的，所述步驟S1中：無菌條件下取出5周小鼠快速免疫佐劑，與含有抗原β-葡萄糖苷酶的生理鹽水等體積混勻，通過小鼠后腿肌肉注射免疫小鼠，按葡萄糖苷酶50μ g八鼠的劑量注射免疫小鼠；第21天按同樣方式再加強免疫1針。
[0014] 進一步的，所述步驟S2中：第35天小鼠斷尾采血，全血于4°C條件下放置8-12h，然 后在4°C條件下，以lOOOOr/min的轉速離心10min，收集血清，通過間接ELISA法對血清的效 價進行檢測。
[0015]進一步的，所述步驟S3中：挑選血清效價為20000以上的小鼠，取50ygi3-葡萄糖苷 酶溶于500ul生理鹽水，混勻后于小鼠腹腔加強免疫，72小時后摘其眼球取全血，然后使用 體積濃度為75%的酒精中浸泡5min，無菌條件下取出小鼠脾臟，將分離后的脾細胞和骨髓 瘤細胞混合，以1500r/min的轉速離心10min，加入體積分數為50%的PEG中進行融合。
[0016] 進一步的，所述步驟S6中：將克隆化后的陽性雜交瘤細胞接種于小鼠腹腔中誘導 產生大量腹水，同時分泌大量葡萄糖苷酶單克隆抗體于腹水中。
[0017] 進一步的，所述步驟S7中：腹水用濾紙濾去沉淀和脂質，濾液用4倍體積的醋酸緩 沖液稀釋，調節pH至4.5，逐滴加入辛酸至終濃度為25μ1/πι1，室溫攪拌30min后，以10000r/ min離心20min，收集的上清液在冰浴條件下等體積加入飽和硫酸銨，冰浴攪拌30min后靜置 8-12h，以10000r/min離心20min，所得沉淀用磷酸緩沖鹽溶液透析，獲得β-葡萄糖苷酶單克 隆抗體。
[0018] -種β_葡萄糖苷酶單克隆抗體，根據上述的方法制得。
[0019] 本發明的有益效果是：
[0020] 本發明方法用β-葡萄糖苷酶免疫小鼠，取免疫小鼠脾臟和SP2/0細胞融合，經間接 ELISA發檢測和有限稀釋法進行克隆，得到抗β-葡萄糖苷酶抗體陽性細胞株，經體內誘生腹 水法得到抗體，用辛酸-硫酸銨法純化獲得高純度的葡萄糖苷酶單克隆抗體。本發明所提 供的一種葡萄糖苷酶單克隆抗體的制備方法，獲得了高純葡萄糖苷酶單克隆抗體。通 過本發明的方法制備的葡萄糖苷酶單克隆抗體具有高效價、高穩定性和高特異性，為后 期用于葡萄糖苷酶的免疫檢測奠定良好基礎。
【附圖說明】
[0021] 為了更清楚地說明本發明實施例中的技術方案，下面將對實施例描述中所需要使 用的附圖作簡單地介紹。
[0022] 圖1為抗體純化前后SDS-PAGE效果圖。
【具體實施方式】
[0023] 為對本發明中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，發明人結合實施例進行說 明，但以下實施例所描述的僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明 中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施 例，都屬于本發明保護的范圍。
[0024] 實施例一
[0025] 本發明提供的β_葡萄糖苷酶單克隆抗體的制備方法，步驟如下：
[0026] S1:取抗原β_葡萄糖苷酶注射免疫小鼠：
[0027] 無菌條件下取出250μ1 QuickAntibody-mouse 5w(5周小鼠快速免疫佐劑），與含 有250yg抗原β-葡萄糖苷酶的250μ1生理鹽水混勻后，通過小鼠后腿肌肉注射免疫小鼠，按 β-葡萄糖苷酶50yg八鼠的劑量注射免疫小鼠，本實驗每只小鼠注射100μ1，共注射免疫5只小 鼠；第21天按上述同樣方式，每只小鼠再加強免疫1針。
[0028]本實施例采用5周小鼠快速免疫佐劑取代傳統的弗氏佐劑，使得β-葡萄糖苷酶抗 原在小鼠體內可以緩慢釋放，該佐劑不需要乳化，不會破壞抗原結構，避免了使用弗氏佐劑 乳化過程中對抗原結構的破壞。
[0029] S2:間接ELISA法測免疫小鼠的血清效價：
[0030]第35天將小鼠斷尾采血，全血于4°C條件下放置8-12h，然后在4°C條件下，以 10000r/min的轉速離心10min，收集血清，通過間接ELISA法對血清的效價進行檢測。
[0031] S3:挑選血清效價為20000以上的小鼠，取脾細胞與骨髓瘤細胞融合：
[0032] 挑選血清效價為20000以上的小鼠，取50ygf3-葡萄糖苷酶溶于500ul生理鹽水，混 勻后于小鼠腹腔加強免疫，72小時后摘其眼球取全血，然后使用體積濃度為75%的酒精中 浸泡5min，無菌條件下取出小鼠脾臟，將分離后的脾細胞和骨髓瘤細胞混合，以1500r/min 的轉速離心10min，加入PEG中融合。為保證高融合率得到特異性雜交瘤細胞的可能，融合過 程采用體積分數為50 %的PEG，當濃度過大或過低時，細胞融合率明顯降低。
[0033] S4:融合后采用HAT培養液培養和間接ELISA檢測篩選，獲得陽性雜交瘤細胞。
[0034] S5:用有限稀釋法對陽性雜交瘤細胞進行克隆化直至出現陽性單克隆率為100%。 為了防止無關克隆的過度生長，對陽性雜交瘤細胞需進一步克隆化，陽性雜交瘤細胞用有 限稀釋法克隆細胞直至出現陽性單克隆率為100%，以確保抗體由單個克隆所產生。
[0035] S6:采用小鼠體內誘生腹水法制備β-葡萄糖苷酶單克隆抗體：
[0036] 將陽性雜交瘤細胞接種于小鼠腹腔中誘導產生大量腹水，同時分泌大量β_葡萄糖 苷酶單克隆抗體于腹水中。
[0037] S7:純化β-葡萄糖苷酶單克隆抗體：
[0038]腹水用濾紙濾去沉淀和脂質，濾液用4倍體積的0.06mol/L，pH=4.0的醋酸緩沖液 稀釋，使用氫氧化鈉溶液調節pH至4.5,逐滴加入辛酸至辛酸終濃度為25yl/ml，室溫攪拌 30min后，以10000r/min離心20min，收集的上清液在冰浴條件下等體積加入飽和硫酸銨，冰 浴攪拌30min后靜置8-12h，以10000r/min離心20min，所得沉淀用0.02mol/L的磷酸緩沖鹽 溶液(PBS)透析72小時后獲得β-葡萄糖苷酶單克隆抗體，于-20°C凍存。采用辛酸一硫酸銨 法比直接用硫酸銨法能獲得更高純度的β-葡萄糖苷酶單克隆抗體。
[0039]小鼠血清效價檢測結果
[0040] 通過間接ELISA法對小鼠血清的效價進行檢測，用采血前小鼠的血清作為陰性對 照，得到5只小鼠血清效價如表1所示，挑選效價較高的1#和2#小鼠取脾臟進行細胞融合。
[0041] 表1小鼠血清效價
[0043] β_葡萄糖苷酶單克隆抗體的效價和亞型測定
[0044]抗體檢測效價的測定采用棋盤法，蛋白用0.05Μ ΡΗ 9.6的碳酸鹽緩沖液梯度包 被，100μL7孔包被，37 °C避光反應2h，封閉lh，加 lOOyL/孔梯度稀釋的抗體，37 °C反應30min， 洗滌液洗滌4-5次，加 lOOyL/孔酶標羊抗鼠抗體，37 °C反應30min，洗滌液洗滌4-5次，TMB底 物液37°C反應15min，0 · 5M H2S04終止反應后于450nm和620nm雙波長條件下讀數。選擇陽性 吸光度值大于陰性吸光度值的2.1倍時，抗原抗體的稀釋倍數為抗原抗體的效價。抗體亞型 用購買的分型試劑盒根據說明書進行檢測。
[0045]如表2所示，融合后的細胞經過2-3次的克隆和間接ELISA方法篩選得到6株陽性單 克隆細胞，6株陽性單克隆細胞分別體外誘導法制備腹水。6株抗體效價均達到105及以上， 所有細胞株產生的抗體亞型都是IgG型，其中3C10為IgG2a型，其余抗體均為IgGl型。
[0046] 表2抗體效價和亞型測定
[0049] β-葡萄糖苷酶單克隆抗體純化前后的SDS-PAGE效果
[0050] 6株抗體分別對比純化前后的SDS-PAGE效果，參見圖1，從左到右的序號分別表示 為：1: 1G2純化前，2: 1G2純化后，3: 1Α4純化前，4: 1Α4純化后，5: 3F6純化前，6: 3F6純化后，7: Marker，8: 3C10 純化前，9: 3C10 純化后，10: 3Η12 純化前，11: 3Η12 純化后，12: 4Η5 純化前，13: 4H5純化后。圖1表明，辛酸-硫酸銨純化方法除去了大部分的雜質，達到了純化的目的。
[0051 ] β-葡萄糖苷酶單克隆抗體的穩定性測定
[0052]將所有純化后的抗體分別取100ul，置-20°C反復凍融5次、4°C保存30天，37°C作用 7天，56 °C作用30min，比較處理前后抗體效價的變化情況。6株抗體熱穩定性效價檢測結果 見表3,所有抗體在56°C處理30min都有不同程度的失活，大部分抗體在-20°C凍融5次和在4 °C保存30天活性下降不明顯，只有3C10效價下降相對較多，說明該抗體對溫度變化相對敏 感，其他抗體活性相對較穩定。
[0053]表3不同條件下抗體穩定性測定
[0056] β-葡萄糖苷酶單克隆抗體的特異性檢測：
[0057] 如表4所示，將6株抗體分別加到事先包被好β_葡萄糖苷酶、鈣調蛋白、牛血清白蛋 白的酶標孔中反應，顯色結果表明葡萄糖苷酶單克隆抗體只結合葡萄糖苷酶抗原，不 結合鈣調蛋白、牛血清白蛋白，說明本發明方法制備得到的抗體為葡萄糖苷酶特異性抗 體，g卩β-葡萄糖苷酶單克隆抗體。
[0058] 表4 β_葡萄糖苷酶單克隆抗體的特異性檢測
[0060] 對比例一
[0061] 對比例一與實施例一的區別在于:步驟S2中，無菌條件下取出弗氏佐劑與含有β- 葡萄糖苷酶的生理鹽水混勻，按照5〇yg/只的劑量注射免疫小鼠。經測定，獲得的小鼠血清 效價大部分低于10000。這是因為弗氏佐劑在乳化過程中破壞了抗原結構。
[0062] 對比例二
[0063]對比例二與實施例一的區別在于：步驟S4中，融合過程采用體積分數為60%的 PEG。
[0064] 對比例三
[0065]對比例三與實施例一的區別在于：步驟S4中，融合過程采用體積分數為40%的 PEG。
[0066] 融合率=(視野內發生融合的細胞總數/視野內的細胞總數)*100% AEG濃度對細 胞融合率的影響如表5所示。
[0067] 表5細胞融合結果
[0069]結果表明體積分數為50%PEG，細胞融合率最佳，當濃度過大或過低時，細胞融合 率明顯降低。
[0070] 綜上所述，采用本發明所提供的一種β-葡萄糖苷酶單克隆抗體的制備方法，獲得 了高純β-葡萄糖苷酶單克隆抗體。通過本發明的方法制備的β-葡萄糖苷酶單克隆抗體具有 高效價、高穩定性和高特異性，為后期用于β-葡萄糖苷酶的免疫檢測奠定良好基礎。
[0071] 以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精 神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種β-葡萄糖苷酶單克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： Sl:取抗原β-葡萄糖苷酶注射免疫小鼠； S2:間接ELISA法測免疫小鼠的血清效價； S3:挑選血清效價為20000以上的小鼠，取脾細胞與骨髓瘤細胞融合； S4:融合后采用HAT培養液培養和間接ELI SA檢測篩選，獲得陽性雜交瘤細胞； S5:用有限稀釋法對陽性雜交瘤細胞進行克隆化直至出現陽性單克隆率為100%; S6:采用小鼠體內誘生腹水法制備β-葡萄糖苷酶單克隆抗體； S7:純化β-葡萄糖苷酶單克隆抗體。2. 根據權利要求1所述β_葡萄糖苷酶單克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟Sl 中：無菌條件下取出5周小鼠快速免疫佐劑，與含有抗原β-葡萄糖苷酶的生理鹽水等體積混 勻，通過小鼠后腿肌肉注射免疫小鼠，按β-葡萄糖苷酶50yg八鼠的劑量注射免疫小鼠；第21 天按同樣方式再加強免疫1針。3. 根據權利要求2所述β-葡萄糖苷酶單克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟S2 中：第35天小鼠斷尾采血，全血于4°C條件下放置8-12h，然后在4°C條件下，以10000r/min的 轉速離心10min，收集血清，通過間接ELISA法對血清的效價進行檢測。4. 根據權利要求3所述β-葡萄糖苷酶單克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟S3 中：挑選血清效價為20000以上的小鼠，取50ygi3-葡萄糖苷酶溶于500ul生理鹽水，混勻后于 小鼠腹腔加強免疫，72小時后摘其眼球取全血，然后使用體積濃度為75 %的酒精中浸泡 5min，無菌條件下取出小鼠脾臟，將分離后的脾細胞和骨髓瘤細胞混合，以1500r/min的轉 速離心10min，加入體積分數為50 %的PEG中進行融合。5. 根據權利要求4所述β-葡萄糖苷酶單克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟S6 中：將克隆化后的陽性雜交瘤細胞接種于小鼠腹腔中誘導產生大量腹水，同時分泌大量β_ 葡萄糖苷酶單克隆抗體于腹水中。6. 根據權利要求5所述β-葡萄糖苷酶單克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟S7 中：腹水用濾紙濾去沉淀和脂質，濾液用4倍體積的醋酸緩沖液稀釋，調節pH至4.5，逐滴加 入辛酸至終濃度為25yl/ml，室溫攪拌30min后，以lOOOOr/min離心20min，收集的上清液在 冰浴條件下等體積加入飽和硫酸銨，冰浴攪拌30min后靜置8-12h，以10000r/min離心 20min，所得沉淀用磷酸緩沖鹽溶液透析，獲得β-葡萄糖苷酶單克隆抗體。7. -種β-葡萄糖苷酶單克隆抗體，根據權利要求1至7任一項所述的方法制得。
【文檔編號】C07K16/40GK105949315SQ201610568754
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年7月19日
【發明人】余厚美, 張振文, 林立銘, 王琴飛, 徐媛
【申請人】中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所