一種b/t淋巴細胞弱化因子免疫原多肽及其用圖
【專利摘要】本發明公開了一種B/T淋巴細胞弱化因子免疫原多肽，屬于抗癌疫苗領域。具體涉及用作抗癌疫苗的B/T淋巴細胞弱化因子免疫原的優化多肽，增強T細胞免疫應答。該氨基酸序列為全新的序列，在制備用于治療腫瘤藥物中的應用。尤其在制備用于腫瘤免疫細胞，增強T細胞免疫應答藥物中的應用，以及在制備用于CAR?T細胞免疫治療的應用。本發明的有益效果在于為全新的序列，可用于腫瘤免疫細胞技術中的免疫原，能（1）促進T細胞增殖，（2）能促進T細胞與腫瘤表面抗原的特異性結合，（3）在荷瘤小鼠體內，能抑制腫瘤的生長。作為細胞療法的靶標分子，應用于CAR?T等細胞療法。
【專利說明】
一種B/T淋巴細胞弱化因子免疫原多肽及其用途
技術領域
[0001] 本發明是有關抗癌疫苗領域。具體來說，本發明涉及用作抗癌疫苗的B/T淋巴細胞 弱化因子免疫原的優化多肽，增強T細胞免疫應答。
【背景技術】
[0002] 腫瘤細胞免疫治療是一種新興的、具有顯著療效的腫瘤治療模式，是一種自身免 疫抗癌的新型治療方法。它是運用生物技術和生物制劑對從病人體內采集的免疫細胞進行 體外培養和擴增后回輸到病人體內的方法，來激發，增強機體自身免疫功能，從而達到治療 腫瘤的目的。腫瘤細胞免疫療法是繼手術、放療和化療之后的第四大腫瘤治療技術。
[0003] B/T細胞弱化分子(BTLA)是最近發現的B/T淋巴細胞弱化因子家族共抑制分子，是 CD28家族成員，是與細胞毒T淋巴細胞相關抗原-4及程序性死亡分子-1類似的抑制性受體。 主要表達于B細胞、T細胞和抗原遞呈細胞表面。BTLA的配體是TNF超家族成員皰疹病毒進入 介質(HVEM) ^VEM-BTLA信號途徑對T、B細胞的活化起負調節作用，在調節機體免疫應答，維 持自身免疫穩定中起著十分重要的作用，是目前腫瘤免疫治療研究的熱點之一。
[0004] 最近Gertner-Dardenne等認為淋巴瘤細胞可能通過BTLA介導的信號途徑抑制γ δ Τ細胞的增殖(阻滯S期），使得腫瘤細胞免疫逃逸的發生。另外，BTLA在黑色素瘤特異性⑶8+ T細胞上高表達，并通過與其配體HVEM介導信號途徑抑制腫瘤特異性CD8+T細胞的功能，對 BTLA信號途徑封閉后可增強其增值活性及細胞因子的產生;對黑色素瘤患者接種CpG疫苗 后，可下調BTLA在腫瘤特異性CD8+T細胞和B細胞的表達，并且其下降程度與免疫接種的次 數呈正相關。Hobo等采用同種異基因干細胞過繼治療惡性血液病的研究中發現，BTLA在次 級組織相容性抗原(Minor histocompatibility antigens，MiHA)特異性⑶8+T細胞上高表 達并削弱T細胞的增值及細胞因子的產生，阻斷其信號途徑后可恢復其功能。這些研究均為 以BTLA作為靶點的腫瘤免疫治療提供了線索。BTLA可與多重共抑制性分子(如PD-1、??Μ-3 等）同時表達在腫瘤特異性⑶8+Τ細胞并使Τ細胞功能障礙。Radvanyi等采用體外擴增黑色 素瘤患者自體腫瘤浸潤淋巴細胞進行過繼細胞治療時發現，BTLA+CDS+TILs數量與臨床治 療療效呈高度正相關。提示BTLA在TILs細胞過繼治療惡性黑色素瘤中可能是一個新的重要 的生物標記物。
[0005] 隨著對BTLA的深入研究，我們發現BTLA不但在T、B淋巴細胞、巨噬細胞、DC、NK、單 核細胞等固有免疫細胞表面表達，而且新近發現γ ST細胞、血液系統腫瘤細胞B細胞型惡性 腫瘤、多發性骨髓瘤細胞(ΜΜ)、急性髓系白血病細胞(AML)上也有表達。BTLA在腫瘤細胞上 的表達提示其可能是一個腫瘤標記物，檢測其表達可能對臨床診斷具有重要指導作用。
[0006] B/T淋巴細胞弱化因子可以作為腫瘤疫苗的特異性免疫原。然而，B/T淋巴細胞弱 化因子由414個氨基酸的蛋白，分子量較大，較難得到純度高的B/T淋巴細胞弱化因子。這 樣，不僅會給后期的特異性T細胞免疫帶來困難，而且會導致患者的自身免疫。因此，本發明 提供了一種特異性強，純度較高的小分子多肽作為免疫原。
【發明內容】
[0007] 發明目的
[0008] 本發明提供一種B/T淋巴細胞弱化因子免疫原多肽，可用于腫瘤細胞免疫的免疫 原，增強T細胞免疫應答，具有分子量小、特異性免疫原性強的特點。
[0009] 技術方案
[0010] 本發明的技術方案在于提供一種B/T淋巴細胞弱化因子免疫原多肽，序列為 RPWLLYSLLPLGGLPLLITTCFCLFCCLRR(SEQ ID NO: 1)。該氨基酸序列為全新的序列，在制備用 于治療腫瘤藥物中的應用。尤其在制備用于腫瘤免疫細胞，增強T細胞免疫應答藥物中的應 用，以及在制備用于CAR-T細胞免疫治療的應用。
[0011] 有益效果
[0012] 本發明的B/T淋巴細胞弱化因子免疫原多肽，為全新的序列，可用于腫瘤免疫細胞 技術中的免疫原。有益效果在于（1)促進T細胞增殖，（2)能促進T細胞與腫瘤表面抗原的特 異性結合，⑶在荷瘤小鼠體內，能抑制腫瘤的生長。作為細胞療法的靶標分子，應用于CAR-Τ'等細胞療法。
【具體實施方式】
[0013] 多肽由上海生工吉爾合成。
[0014] 實施例1
[0015]用人彌漫性大B細胞淋巴瘤移植瘤模型檢測B/T淋巴細胞弱化因子免疫原多肽的 體內活力。
[0016] 6-8W齡SCID小鼠，小鼠隨機分成4組，雌雄各半，每組10只。（1)空白組；（2)多肽低 劑量組；（3)多肽中劑量組；（4)多肽高劑量組。建立人彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)移植瘤 模型，在接種DLBCL細胞后的第3、5、7天，分別進行免疫。方案為:空白組加入相同體積的溶 劑，實驗組多肽設3個劑量:0.5、1.0、2. Omg/Kg，在腫瘤周圍多點注射。21天后，觀察小鼠存 活數量，計算存活率。結果顯示，多肽可有效地保護小白鼠，在劑量〇.5、1.0、2.0mg/Kg時可 以提高荷瘤小鼠的生存率，生存率分別為40.98，68.92，79.01 %。
[0017] 實施例2
[0018]用人小細胞肺癌腫瘤模型檢測B/T淋巴細胞弱化因子免疫原多肽的體內活力。 [0019] 6-8w齡C57BL/6裸鼠，小鼠隨機分成4組，雌雄各半，每組10只。（1)空白組；（2)多肽 低劑量組；（3)多肽中劑量組；（4)多肽高劑量組。建立人小細胞肺癌腫瘤模型，在接種腫瘤 細胞后的第3、5、7天，分別進行免疫。方案為：空白組加入相同體積的溶劑，實驗組多肽設3 個劑量：1.0、2.0、4. Omg/Kg，在腫瘤周圍多點注射。21天后，觀察小鼠存活數量，計算存活 率。結果顯不，多妝可有效地保護小白鼠，在劑量1.0、2.0、4. Omg/Kg時可以提尚荷瘤小鼠的 生存率，生存率分別為32.34，54.98，63.37 %。
[0020] 實施例3
[0021] T淋巴細胞的增殖作用:無菌取小鼠脾臟，1640培養基清洗3次，5ml注射器芯研磨， 200目篩網過濾，制成單細胞懸液，離心（1000r/min，5min)，棄上清，TriS-NH4CL破解紅細 胞，冰水浴靜置3_5min，離心（1000r/min，5min)，棄上清，用無菌冷roS洗滌細胞兩次。最后 加入10%小牛血清的RPMI 1640培養液(5ml)懸浮細胞，細胞計數，調整細胞濃度為5 ΧΙΟ6 個/ml，于96孔培養板中培養。
[0022] 實驗設空白對照組、模型組(刀豆蛋白A，sigma公司購買）、多肽各劑量(5.0、10.0、 20.Omg/ml)組。各組分別加入脾臟淋巴細胞懸液100μΙ/孔后，空白對照組加入1640培養液 1〇〇μ1，模型組加入ConA(終濃度為5μg/ml)，多肽各劑量組在加入不同濃度的多肽基礎上加 ConA(終濃度為5卩8/1111)。37°(：細胞培養箱靜止培養48h，培養結束后每孔加入20μ1 MTT，繼 續培養4h，最后棄掉每孔所有溶液，每孔加入lOOylDMSO，震蕩，用酶標儀檢測570nm處0D值， 每孔設5個平行。
[0023]表1多肽對T淋巴細胞的增殖作用
[0024]
[0025] *P〈0 · 05，#P〈0 · 01 與模型組相比。
[0026]實驗結果見表1，與模型組比較，多肽能促進小鼠脾臟淋巴細胞的增殖，在劑量為5 ~20mg/ml的范圍呈現很好的劑量依賴關系，以20mg/ml的增殖率最高，為155.0%。
[0027] 實施例4
[0028] B/T淋巴細胞弱化因子免疫原多肽的T細胞結合試驗:采用玫瑰花環試驗評價T細 胞與人彌漫性大B細胞淋巴瘤細胞株(SUDHL-4)的結合能力。無菌取豚鼠胸腺，1640培養基 清洗3次，5ml注射器芯研磨，200目篩網過濾，制成單細胞懸液，離心1000轉/分，10分鐘，棄 上清，以Hank's液調細胞濃度為3 X 10%1。于96孔培養板中培養。
[0029] 實驗設空白對照組、多肽各劑量(5、10、20mg/ml)組。各組分別加入胸腺淋巴細胞 懸液100μΙ/孔后，空白對照組加入1640培養液500μ1，多肽各劑量組在加入不同濃度的多 肽。37°C細胞培養箱，培養48h，培養結束后每孔中加入100μΙ/孔人彌漫性大Β細胞淋巴瘤細 胞SUDHL-4(細胞濃度為1 X 106/ml，含10 %胎牛血清），混勻，500轉/分，離心5分鐘。棄上清， 加少量戊二醛，輕輕晃動，使細胞懸浮，加甲紫染色，400倍顯微鏡觀察。凡結合3個以上腫瘤 細胞的T淋巴細胞為花環陽性細胞。記數100個T細胞中形成花環的淋巴細胞百分率，即為T 細胞與SUDHL-4細胞的結合率。每孔設5個平行。
[0030] 實驗結果見表2,與空白組比較，B/T淋巴細胞弱化因子免疫原多肽可以顯著性增 加 T細胞與SUDHL-4細胞的結合率(P〈0.01)，低中高劑量組的結合率分別為67.33、81.33和 86.82%。在劑量為5~20mg/ml的范圍呈現很好的劑量依賴關系。
[0031] 表2多肽對T細胞結合的影響
[0033] *P〈〇 · 05，#P〈0 · 01 與空白組相比。
【主權項】
1. 一種B/T淋巴細胞弱化因子免疫原多肽，其特征在于:所述的多肽序列為SEQ ID NO: 1〇2. 根據權利要求1所述的多肽，其特征在于:在制備用于治療腫瘤藥物中的應用。3. 根據權利要求2所述的多肽，其特征在于:在制備用于腫瘤免疫細胞，增強T細胞免疫 應答藥物中的應用。4. 根據權利要求2所述的多肽，其特征在于:在制備用于CAR-T細胞免疫治療的應用。
【文檔編號】C07K14/705GK105949306SQ201610437933
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月19日
【發明人】羅瑞雪
【申請人】蘇州普羅達生物科技有限公司