Fap來源的抗腫瘤ctl表位肽p639及其應用
【專利摘要】本發明屬于生物化學領域中的多肽技術領域，具體涉及一種FAP來源的抗腫瘤CTL表位肽及其在制備腫瘤治療性多肽疫苗中的應用。所述抗腫瘤CTL表位肽為九肽，為表位肽P639，分子量907.14，具體為：GLFKCGIAV。本發明中，我們利用90%以上的上皮性腫瘤高表達而正常組織中幾乎不表達的特異性抗原FAP，根據其一級結構，對FAP進行HLA?A2限制性的CTL表位進行了預測與篩選，確定這兩種CTL表位肽能夠與HLA?A2分子產生較強的結合能力，且可有效激活特異性CTL反應，具有成為治療性腫瘤多肽疫苗的可行性。
【專利說明】
FAP來源的抗腫瘤CTL表位肽P639及其應用
技術領域
[0001] 本發明屬于生物化學領域中的多肽技術領域，具體涉及一種FAP來源的抗腫瘤CTL 表位肽P639及其應用。
【背景技術】
[0002] 成纖維細胞激活蛋白（Fibroblast Activation Protein a，FAP)存在于腫瘤基質 成纖維細胞中，于1986年首次發現，1990年正式命名為FAPJAP表達于90%以上的上皮性腫 瘤的基質成纖維細胞的胞膜和胞漿中，包括卵巢癌，結腸癌，膀胱癌，肺癌，乳腺癌等，而在 正常的成纖維細胞中幾乎不表達，是一個特異性非常強的腫瘤診斷和治療的靶點。而且作 用于腫瘤基質成纖維細胞相對于直接作用于腫瘤細胞自身而言也有一些吸引人的優點：如 腫瘤基質成纖維細胞是非轉化細胞，與快速增殖的腫瘤細胞相比其基因組更加穩定，其表 面抗原表達相對來說也更加穩定，而且基質細胞在各種腫瘤中的差異較小，針對腫瘤基質 的治療可用于多種實體腫瘤。尤其近幾年來發現其在腫瘤免疫抑制方面發揮著很大的作 用。因此，綜合來看，FAP作為一種腫瘤基質抗原，在免疫治療等方面具有較大的應用價值。
[0003] 如今，隨著對免疫學的研究進展，人們逐漸發現細胞毒性T淋巴細胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)在抗病毒、抗細菌、抗腫瘤等過程中發揮的重要作用，是機體免疫的一條 重要防線。尤其是近些年來發現的其在腫瘤免疫過程中發揮的重要作用更是引起了研究人 員的廣泛興趣。
[0004] 腫瘤抗原為內源性抗原，主要通過MHC-I類分子途徑所遞呈。基于MHC-I類分子封 閉的結構特性，其只能識別由8~12個氨基酸所組成的短肽段，這些肽段被稱為抗原表位。月中 瘤抗原經APC細胞攝取加工后形成相應的短肽，進而與MHC-I類分子結合，并最終遞呈到細 胞表面以便CD8+ T細胞表面的TCR所識別，從而活化CTL細胞，引發CTL特異性免疫應答。目 前，研究較多的抗原表位為九肽。該領域的發現也逐漸催生了治療性腫瘤多肽疫苗的研究。 然而，如何快速尋找并利用CTL表位去有效激發其介導的特異性細胞免疫應答，發揮抗腫瘤 作用，卻成為難點。
[0005] 而隨著現代生物信息學與免疫學的迅速發展與融合，研究人員已經可以利用多種 在線抗原表位預測工具，準確、快速的尋找到理想的抗原表位，大大的提升了工作效率。目 前常用的有BMAS(主要是計算8~10肽與MHC-I類分子解離的半衰期）、NetCTL 1.2(主要是 能夠對12種MHC-I類超型限制性的表位進行預測）和SYFPEITHI(主要預測抗原肽與MHC的親 和力）等。不同的軟件有不同的特點，因此，綜合運用這些軟件可以提高抗原表位預測的準 確性，這也是本領域研究的一般策略。
[0006] 各種動物特別是哺乳動物都有MHC，為避免混淆，人類中的MHC基因稱為人白細胞 抗原(HLAs)，其編碼產物稱為HLA分子或HLA抗原，分別為對應的HLA-I類和HLA-II類分子。 而HLA-I類分子具有高度的多態性，具有幾十種亞型，而在中國人群中，HLA-A2人群所占多 數，比例高達53%，因此篩選由HLA-A2分子遞呈的限制性CTL表位在腫瘤免疫治療中具有廣 泛的應用價值。
【發明內容】
[0007] 本發明主要是利用FAP的一級結構，通過WMAS、NetCTL 1.2以及SYFPEITHI等多種 表位預測軟件，篩選、合成并提供了一種FAP來源的HLA-A2限制性的CTL表位肽P639。
[0008] 下面對本發明的技術方案介紹如下： FAP來源的抗腫瘤CTL表位肽P639，該類表位肽與HLA-A2特異性結合，為九肽，具體為： 表位肽P639，分子量907.14，其序列如SEQ ID NO. 1所示，具體為:GLFKCGIAV，SP:Gly-Leu- Phe- Lys- Cys- Gly- lie- Ala- Val〇
[0009]所述FAP來源的抗腫瘤CTL表位肽，采用Fmoc固相合成法制備而成，具體過程如下： (1) 從C端到N端開始合成，合成肽C端的第一個Fmoc-氨基酸的羧基與Wang樹脂以共價 鍵結合，這樣C端第一個氨基酸就連接到固相載體上，隨后將氨基端的Fmoc保護基脫去； (2) 然后以第一個氨基酸的氨基末端作為結合位點，與下一個氨基酸的羧基末端在縮 合劑的活化作用發生縮合反應形成肽鍵，生成一個帶有保護基的二肽;然后不斷重復這一 過程，直至合成目的肽； (3) 最后將目的肽段從樹脂上切割下來，經過洗滌、沉淀等步驟獲得粗肽； (4) 再經HPLC純化后，得到精肽，其純度大于95%，最后經質譜分析并驗證其分子量是否 符合理論值。
[0010]所述FAP來源的抗腫瘤CTL表位肽作為腫瘤治療藥劑的應用，具體而言，可作為治 療性多肽疫苗應用。
[0011] 在腫瘤多肽疫苗研究當中，目前大多數選用的都是腫瘤細胞自身所表達的抗原， 較少有人關注腫瘤基質抗原。而隨著研究的進展，腫瘤基質在腫瘤的發生、發展過程中所發 揮的巨大作用逐漸得到揭示，其參與了多種病理進程，如：腫瘤血管的生成、腫瘤細胞的增 殖侵潤和轉移、慢性炎癥、腫瘤免疫抑制等。腫瘤相關成纖維細胞是腫瘤基質中所占比例最 大的類群，而FAP是其所表達的特異性抗原，因此，靶向于FAP可有效破壞腫瘤基質，進而抑 制腫瘤的發生發展。
[0012] 在本發明中，我們利用90%以上的上皮性腫瘤高表達而正常組織中幾乎不表達的 特異性抗原FAP，利用其一級結構，通過BMAS、NetCTL 1.2以及SYFPEITHI等多種表位預測 軟件分別對FAP進行HLA-A2限制性的CTL表位進行了預測與篩選，在綜合各預測篩選結果的 基礎上，進一步通過實驗驗證，篩選確定了 P639這種具有抗腫瘤活性的表位肽結構，確定這 種CTL表位肽能夠與HLA-A2分子產生較強的結合能力，且可有效激活特異性CTL反應，具有 成為治療性腫瘤多肽疫苗的可行性。
【附圖說明】
[0013] 圖1是本發明所述表位肽P639的質譜分析圖譜； 圖2是本發明所述表位肽在體外活性實驗中誘導的特異性CTL的ELISP0T檢測結果； 圖3是本發明所述表位肽在體外活性實驗中誘導的特異性CTL對T2A2細胞的殺傷實驗 的檢測結果。
[0014] 圖4是本發明所述表位肽在進行HLA-A2.1/Kb轉基因小鼠實驗時體重變化； 圖5是本發明所述表位肽在轉基因小鼠體內活性實驗中誘導的特異性CTL的ELI SPOT檢 測結果； 圖6是本發明所述表位肽在轉基因小鼠體內活性實驗中誘導的特異性CTL對T2A2細胞 的殺傷實驗的檢測結果。
【具體實施方式】
[0015] 下面結合具體實施例及實驗對本發明的技術方案進行詳細介紹，介紹具體實施例 前，首先對本發明中所用到部分實驗試劑、實驗設備、細胞來源等簡單介紹如下，其他未說 明試劑、實驗設備等以本領域常用為準，不再重復介紹。
[0016] 主要實驗試劑： 人β2微球蛋白，Merck公司； rhIL-2、rhIL-7、rmlL-2，PEPR0TECH公司； IFN-γ ELISP0T試劑盒、單克隆抗體Anti-Human HLA-A2，eBioscience公司； LDH細胞毒性檢測試劑盒，Promega公司； 主要實驗設備： RP-HPLC分析儀，日本島津公司； 流式細胞儀(Calibur)，美國K)公司； 酶標儀，MD公司； 血液來源： HLA-A2+健康供者的外周血來自鄭州大學學生中招募的志愿者，樣品的采集經鄭州大 學倫理委員會備案批準； 陽性對照肽 P321:參考《Identification of a new broad-spectrum CD8+ T cell epitope from over-expressed antigen COX-2 in esophageal carcinoma》（Cancer Letters，2009，24( 1) : 55~61)，由發明人自行合成獲得； 細胞來源： T2A2細胞(TAP缺陷），由第三軍醫大學吳玉章教授惠贈;所用T2A2細胞系是轉入了人 HLA-A*0201的T、B淋巴母細胞的雜交系，其不表達HLA-DR和MHC -II類分子，可以很好的用 于MHC-I類分子的抗原遞呈和T細胞識別的研究;且所使用的T2A2細胞呈TAP缺陷狀，抗原肽 不能進入到內質網中與HLA-I分子進行組裝，空載的HLA-I分子被遞呈到靶細胞表面，但是 其在低溫條件下極其不穩定，構象極易發生改變，此時HLA-A2 mAb不能檢測出HLA-A2陽性 的細胞，而當HLA-A2分子處于抗原肽荷載狀態時，構象便被穩定下來，通過孵育HLA-A2抗 體便能檢測出HLA-A2陽性的細胞;如此，抗原肽結合力便可通過靶細胞表面HLA-A2的表達 情況加以反映； 小鼠來源： HLA-A2.1/KbR基因小鼠為第二軍醫大學曹雪濤院士惠贈，于IVC獨立送風隔離籠具中 飼養;實驗室選擇6~8周齡的轉基因小鼠進行實驗。
[0017] 實施例！ 本發明所提供的FAP來源的抗腫瘤CTL表位肽P639，與HLA-A2特異性結合，為九肽，具體 為： 表位肽P639，分子量907.14，其序列如SEQ ID NO. 1所示，具體為:GLFKCGIAV，即：Gly- Leu- Phe- Lys- Cys- Gly- lie- Ala- Val〇
[0018] 所述CTL表位肽P639采用Fmoc固相合成法制備而成。合成時，合成肽從C端到N端逐 個延長。合成時所用氨基酸均為α-氨基被Fmoc(芴甲氧羰酰基)所保護的氨基酸，其中個別 氨基酸的側鏈也有保護基團，分別為Cys(Trt，三苯甲基），Lys(Boc，叔丁氧羰基）。詳細制備 步驟如下所述。
[0019] ⑴稱量0.3g Wang樹脂用DMF(N，N-二甲基甲酰胺)充分溶脹，置于合成儀當中；然 后在DIC (N，N-二異丙基碳二亞胺，促進氨基酸縮合）、H〇Bt(l-羥基苯并三唑，活化羧基、抑 制外消旋）、DMAP(4-二甲氨基吡啶，催化縮合反應，只在添加第一個氨基酸時使用）的作用 下，加入C端第一個氨基酸，即將Fmoc-Val-OH連接到Wang樹脂上，連接時，將合成儀置于搖 床中，室溫、200r、反應2.5小時； 反應結束后依次使用DMF洗滌2次，無水甲醇洗滌2次，DCM(二氯甲烷）洗滌3次，最后 再用DMF洗滌2次，每次均為2min，洗滌時溶液量控制在高出樹脂表面lcm左右，不宜過多或 過少； 洗滌結束后，挑出少量樹脂（lmg左右），烘干，用紫外分光光度計于290 nm下測量其0D 值，以備取代值計算，取代值SD=0D/( 1.65 X樹脂質量）； 隨后用封頭液(體積比，醋酸酐:吡啶=1:1)封閉未反應的樹脂，恒溫震蕩15 min，將液 體負壓條件下抽干;此步驟的主要目的是對未發生反應的基團進行封閉，以減少副產物； 洗滌后（洗滌步驟同上），加入脫保護液（體積比，DMF:哌啶=4:1)，恒溫震蕩反應20 min，除去Fmoc保護基，按前述方法再次洗滌； 隨后進行茚檢(Kaiser法）：取少量樹脂于玻璃試管中，加入茚檢試劑，沸水浴lmin，觀 察溶液顏色改變情況;若溶液以及樹脂顆粒顏色變成藍色，說明氨基酸保護基團已經被成 功脫除，可以進行下一個氨基酸的縮合;反之則說明氨基酸的保護基團沒有或者只是極少 部分被脫除； 然后，根據取代值SD計算C端下一個氨基酸，即Fmoc- Ala -OH的所需質量，計算公式 為:ne=M_X2.5Xm?旨XSD;在DIC、HoBt的作用下，將其連接到Val的氨基上，再次按 前述方法洗滌； 茚檢結束后(此次茚檢后溶液和樹脂顆粒顏色應為無色，才能說明氨基酸成功加上，因 為此時第二個氨基酸加入后還未進行脫保護），得到Ala - Val -Wang樹脂； (2) 重復步驟（1)，依次按順序將Ile、Gly、Cys、Lys、Phe、Leu、Gly連接到肽鏈上； (3) 最后用脫保護液脫去Fmoc保護基，按前述方法洗滌后，用切割試劑(體積比，三蒸 水:苯酚:苯甲硫醚：1，2-乙二硫醇:三氟乙酸=2:2:2:1:33)將P639從Wang樹脂上切下，經 旋轉蒸發、離心、洗滌、沉淀、烘干等步驟，得到抗腫瘤CTL表位肽P639粗肽； (4) RP-HPLC分離純化：用HPLC制備柱(0DS-39.4 X 250mm，安捷倫公司）分離純化，具體 為： 取步驟(3 )中表位肽P639粗肽15~20mg溶于4mL三氟乙酸和乙腈的混合溶液(二者體積 比4:1)中，過濾并超聲波震蕩除氣； 制備時，選擇流動相A為含有0.1%的TFA的超純水溶液，流動相B為100%的色譜級乙 腈溶液，二者比例為4:1，進行梯度洗脫，流速設置為5mL/min，收集主峰，用凍干機 (Genentech，US)冷凍干燥獲得精肽(高純度肽）。
[0020] 對所制得的精肽采用電噴霧電離質譜(ESI/MS)進行質譜分析(此部分由上海科肽 生物科技有限公司完成），以進行分子量鑒定。
[0021] 表位肽P639鑒定結果如圖1所示，從圖中可以看出，所制得精肽分子量為908.0,與 理論值相吻合。
[0022] 實施例2 對于實施例1所制備的表位肽P639,為驗證其是否具有免疫活性，本實施進行了一系列 體內外實驗。首先，運用結合力實驗對其表位肽與HLA-A2分子的親和性進行了檢驗；隨后， 通過酶聯免疫斑點實驗^1^13?01')檢測了表位肽誘導獲得的正1丫+的(：11頻率，同時〇)!1革巴 細胞殺傷實驗和CTL胞內因子染色實驗;最后，根據所建立的HLA-A2.1/K b轉基因動物模型， 對表位肽的體內免疫效果進行了測定。相關實驗簡要介紹如下。
[0023] 一、細胞結合力、及表位肽/MHC復合物的穩定性實驗（即CTL表位肽與HLA-A2分子 間的結合力和結合穩定性實驗） 具體實驗過程如下： (1) 取培養中的T2A2細胞，選擇分裂增殖明顯狀態較好的細胞進行實驗，實驗時，用電 動移液器輕輕貼壁吹吸培養體系均勻的細胞懸液，收集于15 mL離心管中，SOOrpm離心10分 鐘收集T2A2細胞，無血清頂DM培養基洗滌3次，棄上清，調整細胞密度為IX 106/mL，鋪于無 菌24孔板中，每孔lmL; (2) 分別設置空白對照組(不加任何肽）、P321陽性對照組、PBS陰性對照組和實驗組，各 兩個復孔； 除空白對照組外，各孔分別加入PBS(陰性對照組)和50 yg/mL的表位肽(實驗組和陽性 對照組）以及3 yg/rnL的β2微球蛋白，置于37°C、5% C02培養箱中孵育18 h; (3) 18h后，用預冷的PFA buffer(100 mL PBS7.4+ 5 mL FBS+ 90mg疊氮化鈉）洗滌三 次，棄掉上清， 細胞結合力時，避光加入50 μL已用PFA緩沖液50:1稀釋后的帶有PE熒光標記的單克 隆抗體Anti-Human HLA-A2 PE_Cyanine7,4°C避光孵育35min; 表位肽/MHC復合物的穩定性實驗時，每孔加入10 yg/mL的BFA(BrefeldinA， eBioscience公司）孵育lh，洗滌后，置于37°C、5%C02培養箱中分別孵育詘、211、411、611 ;孵育 結束后，洗滌，再避光加入50yL已用PFA溶液50:1稀釋后的鼠抗人單克隆抗體Anti-Human HLA-A2 PE-Cyanine7，4°C避光孵育35min; (4) 預冷的PFA buffer洗滌后，置于冰上，流式細胞儀檢測，記錄各組平均熒光值MFI (MEAN Fluorescence Intensity)和DCs。值(DC50表示50%肽/MHC分子復合物解離所需的時 間）。
[0024] 熒光指數FI=(實驗組MFI -背景組MFI)/背景組MFI;結果分析：當FI > 1.5時，表 明實驗組肽(表位肽)與HLA-A2分子具有高結合力；當1.5>FI >0.5時，表明其結合力中等； 當FI <0.5時，表明其結合力較弱。
[0025]結合力及穩定性的統計結果如下表所示：
結果顯示，P639顯示出了中等結合力且半衰期>6h，表明表位肽與MHC分子形成的復 合物穩定性很好，可較好激活免疫反應，具有一定的應用潛力。
[0026]二、CTL體外免疫活性檢測 CTL體外免疫活性檢測主要是先體外誘導激活CTL，然后通過ELISP0T技術對IFN- γ的 分泌情況的檢測和LDH細胞殺傷情況的檢測對免疫活性情況進行評價，相關實驗過程介紹 如下。
[0027] 1、體外誘導激活CTL 該實驗主要是對外周血的單個核細胞進行誘導，使其激活轉化為特異性表達CD8+的 CTL(細胞毒性Τ淋巴細胞），相關實驗過程介紹如下。
[0028] (1)選取若干名健康的HLA-A2+的志愿者，由醫護人員抽取每人20 mL外周血，加入 到有肝素鈉(抗凝血試劑)的50 mL無菌離心管中，按1:1的體積比例與的PBS(pH =7.2)進行 等體積混合，緩慢吹打混勻； (2) 在15 mL無菌離心管中加入4 mL淋巴細胞分離液(天津灝洋），然后輕輕緩慢地加入 步驟(1)中的混勾的抗凝血8 mL;室溫、2000 rpm，離心30 min; (3) 離心完畢后，緩慢取出，可見液體明顯的分為四層，從上到下依次為血漿層，淋巴細 胞層，分離液層，紅細胞層。用彎管小心吸取第二層乳白色的外周血單個核細胞層(PBMCs) 于已加有約5倍體積PBS的離心管中，2000 rpm、離心15 min; (4) 離心完畢后，盡棄上清，用含10%胎牛血清的頂DM培養基重懸細胞，計數，調整細胞 密度為卜1.5 X 106個/mL，鋪于24孔板中，每孔1 mL，置于37°C、5%C02培養箱中過夜； (5) 設置陽性對照組(C0X-2321-329，即P321)、PBS陰性對照組、無關肽對照組(HBVc 18-27,即HBV)和實驗組； 于次日分別加入各組的多肽10yg/mL，P2微球蛋白（3yg/mL)，第三日加入50 U/mL的 rhIL-2，其后隔天加入rhIL-2進行刺激，到第七天結束為一輪周期； 共三輪刺激； 刺激過程中，實時觀察細胞狀態，根據需要每2~3 d進行半量換液； 第三輪需要額外補加 lOyg/mL的rhIL_7(Peprotech公司）和5yg/mL 0)3刺激性單克隆 抗體(eBioscience&3)。
[0029] 三輪刺激后，在第21d時即得到效應CTL細胞。
[0030] 2、ELISP0T技術檢測體外誘導的CTL分泌產生IFN- γ的能力 取體外誘導的CTL細胞，利用ELISP0T實驗技術對其分泌產生的IFN- γ的量進行檢測， 具體過程介紹如下： (1) 包被板條:板條使用的是密理博公司(Mi 11 ipore )的非預包被板，先用15yL、35%乙 醇活化PVDF膜lmin，然后用200yL的roS(pH=7.2)洗3遍，每次停留一分鐘；完成后，4°C過夜 孵育IFN-γ 抗體（Capture Antibody IFN_y，eBioscience); (2) 封閉：于次日每孔加入200 yL含10% FBS的RPMI-1640培養基，室溫放置10 min后盡 棄培養基； (3) 細胞荷肽:調整T2A2細胞的濃度為2X106個/mL，加入相應的表位肽(加入量50 yg/ mL)、和人β2Μ(β2微球蛋白，3yg/mL)、或PBS后，置于37 °C、5%C02培養箱中孵育4 h，作為刺激 細胞； (4) 收集體外誘導的CTL，即上述三輪刺激后所得效應CTL細胞，用無血清的頂DM洗2次， 調整細胞密度為2 X 106個/mL，作為效應細胞； (5) 以總體積lOOyL，接種到已活化的Millipore板條上(步驟(2)中所制備），設置各組 如下： 實驗孔：（荷載表位肽的T2A2細胞懸液50 yL+效應細胞懸液50 yL)(效應細胞和刺激細 胞按1:1的數量比計數）； 陰性對照孔:荷載PBS的Τ2Α2懸液50 yL+效應細胞懸液50 yL; 自發對照孔:效應細胞懸液50 yL+無血清頂DM培養基50 yL; 陽性對照孔:效應細胞懸液50 yL+荷載表位肽P321的T2A2細胞懸液50 yL; 空白對照孔：100 yL無血清頂DM培養基； 每組設置三個復孔，鋪板完成后，放入無菌錫紙袋內，置于37°C、5% C02培養箱中孵育 18 h;期間避免培養箱的頻繁開閉和不必要的震動，以免影響斑點的形成； (6) 18h后，將板條內液體扣干，加入200yL預冷的無菌三蒸水，4°C裂解lOmin; 然后將孔內液體扣干，1 XWashing Buffer洗6次，每次停留lmin，扣干時需在無菌、無 粉的衛生紙上扣干； (7) 每孔加入100yL生物素標記的IFN-γ檢測抗體(eBioscience)，置于37°C、5%C02培 養箱中孵育1 h，時間到后盡棄孔內液體，重復上述步驟(6)洗滌； (8) 然后每孔加入100yL的酶聯親和素溶液(eBioscience)，置于37°C、5%C02培養箱中 孵育1 h，完成后盡棄孔內液體，重復上述步驟(6)洗滌； (9) 按要求配制AEC底物顯色液，100μL7孔，室溫條件下，避光顯色約35 min，逐漸能觀 察到淡紅色斑點； 顯色結束后，盡棄孔內液體，將孔板底座去掉(避免背景加深），用蒸餾水反復沖洗孔板 以終止反應，然后將板條置于避光干燥處，室溫自然晾干；用超微距相機拍照，記錄各孔中 的斑點數。
[0031]對其中3名志愿者的具體統計結果如圖2所示。
[0032]從圖2中可以看出，通過檢測IFN-γ的分泌情況，可以發現表位肽P639均能成功誘 導產生特異性CTL;斑點數分別為76、52和49個，其數目與陽性對照P321組(分別為72、69和 12個)基本相當甚至還多于它。雖然在不同志愿者之間表位肽P639表現出一定的差異性，但 這可能是由于個體間的差異所造成。綜合分析考慮，表位肽P639具有誘導特異性CTLs的能 力。
[0033] 3、LDH細胞殺傷實驗 參考CytoTox 96? Non-Radioactive Cytotoxicity Assay試劑盒（Promega公司）說 明書，進一步進行了 LDH細胞殺傷實驗，相關實驗過程介紹如下。
[0034] (1)收集效應細胞:將第三輪誘導的CTL收集起來（即步驟1中體外誘導的CTL)，調 整細胞密度為5X106個/mL; (2) 準備靶細胞:收集T2A2細胞，調整細胞密度為1 X105 /mL，加入相應的表位肽(加入 量50 yg/mL)、和人β2Μ(β2微球蛋白，3yg/mL)，置于37°C、5% C02培養箱中孵育4 h; (3) 檢測板的設立：100yL體系;具體分組情況為： 實驗組：以T2A2細胞作為靶細胞，按12.5 :1、25 :1、50 :1的效靶比加入各相關細胞； (12.5:1效靶比組，12.5 yL CTL+50 yL荷載表位肽的T2A2細胞+37.5yL無血清MDM培養 基;25:1效靶比組，25以1^(：孔+50以1^荷載表位肽的了242細胞+25以1^無血清頂01培養基； 50:1效靶比組，50yL CTL+50 yL荷載表位肽的T2A2細胞） 背景對照組：100 yL無血清頂DM培養基； 靶細胞最大釋放LDH組:50 yL荷載表位肽的T2A2細胞+50 yL無血清頂DM培養基； 靶細胞自發釋放LDH組:50 yL荷載表位肽的T2A2細胞+50 yL無血清頂DM培養基； 效應細胞自發釋放LDH組:12.5:1自發組，12.5 yL CTL+87.5yL無血清頂DM培養基； 25:1自發組，25 yL CTL+75yL無血清頂DM培養基；50:1自發組，50yL CTL+50 yL無血清 頂DM培養基； 體積校正對照組：100 yL無血清頂DM培養基； 以上各組均設3個復孔； (4) 按上述加入相應細胞后，置于37°C、5%C02培養箱中孵育4 h; (5) 在孵育結束前45min時，在靶細胞最大釋放LDH組和體積校正對照組中分別加入10μ L裂解液； (6) 1000 rpm、離心10min;然后取50yL上清轉入到另一個96孔酶標板對應的孔中，每孔 加入50 yL 37°C預熱的已稀釋的底物混合液，在室溫條件下避光反應30 min; 時間到后，每孔加入終止液50 yL;去除氣泡（以免影響OD值）； 在1 h內，用酶標儀(Bio-Red公司），490 nm處檢測OD值。
[0035]細胞殺傷率計算公式： 細胞殺傷率(％)=(實驗組釋放-靶細胞自發釋放-效應細胞自發釋放)/(靶細胞最大釋 放-靶細胞自發釋放）X1 〇〇%， 所有組均需減去背景對照組，而靶細胞最大釋放組應減去體積校正組。
[0036]實驗結果如圖3所示。可以看出，在志愿者1中，P639組在各個效靶比下的殺傷率均 明顯高于P321陽性對照組，分別為43%、60%和25%。在志愿者2中，P639組在效靶比為12.5:1 和25:1時殺傷率均高于陽性對照P321組，分別為37%和62%，而在50:1時殺傷率與P321組相 當，為56%。而在志愿者3中，P639組的殺傷率隨著效靶比的升高而逐漸升高，分別為27%、38% 和54%，均高于P321組。綜合以上分析，我們認為P639組能誘導出特異性CTLs，并且能在體外 表現出對靶細胞較明顯的殺傷作用。
[0037]三、HLA_A2.1/Kb轉基因小鼠體內免疫活性檢測實驗 基于上述體外實驗結果，發明人進一步對表位肽P639在小鼠體內的免疫性能進行了進 一步檢測實驗，具體過程介紹如下。
[0038](一)轉基因小鼠的免疫 (1) 選取6~8周齡的小鼠，稱量并記錄體重后進行分組，每組3雌2雄，且盡量使得每組小 鼠的平均體重基本一致;共分為3組： P639+Th表位（I-Ab乙肝病毒核心抗原來源的Th細胞表位，序列為:TPPAYRPPNAPID+ IFA(弗氏不完全佐劑，Sigma公司）組， PBS +IFA 組， Th表位+IFA組； 分別于第1天、第6天、第11天免疫三次(免疫方式如下述步驟(3)所述）； (2) 表位肽的乳化:免疫時采用乳化后混合物，具體乳化方式為， 按CTL表位肽100 yg/只、Th表位140 yg/只的量與IFA按1:1的質量比例混勻； 將各體系在10 mL離心管中混合均勻后，將滅菌的玻璃注射器插入離心管中反復吹打 約30 min;起初體系粘稠度低，很難掛壁，隨著不斷吹吸乳化的進行，體系最后呈現粘稠度 較高的狀態;此時，取一盛有冰水混合物的小燒杯，用1 mL注射器吸取少許乳白色的乳化 液，滴入冰水混合物中，若是凝聚為滴狀漂浮于水面說明乳化成功，若是入水后彌散，說明 乳化操作并不充分，還未形成理想的油包水狀態，需要繼續連續吸打； 乳化成功后用1 mL注射器吸取乳化的表位肽，小心反復磕實，以免有氣柱殘存而影響 免疫效果； (3)免疫注射時，采用背部皮下多點免疫方式進行免疫注射;免疫期間每隔一天稱量小 鼠體重并進行詳細記錄。
[0039]體重統計結果如圖4所示。從圖4中可以看出，免疫期間小鼠體重未發生明顯波動， 初步表明表位肽P639未對小鼠造成明顯的毒副作用。
[0040](二)小鼠脾臟及腿部淋巴結來源的⑶8+ CTL體外誘導刺激 (1) 第16天處死小鼠（即步驟(一）中免疫16天后），75%酒精浸泡10 min后在超凈臺內進 行解剖，取其脾臟及腿部淋巴結用一次性200目篩網進行研磨； 組織及細胞懸液轉移入15 mL離心管，每管約10 mL;水平離心機離心，1300 rpm、10 min，棄上清； 加入紅細胞裂解液，置于4°C裂解10 min;離心，1300 rpm、10 min，棄上清； 加入含有2%?83的？83(?!17.2)離心洗滌一次，1300印111、1〇1^11，棄上清； 加入10% FBS的RPMI-1640培養基，調整密度為5X 106個/mL，鋪入6孔板中； (2) 第二天加入表位肽，10 yg/mL，02_M，3 yg/mL，rmIL_2，50 U/mL;5天后進行實驗。 [0041 ](三)ELISP0T 和 LDH 實驗 利用ELISP0T技術對CTL分泌產生IFN- γ的量進行檢測，并進一步進行LDH細胞殺傷實 驗，以對免疫效果進行評價，相關實驗參考前述即可，不再重復。（注:小鼠 LDH實驗的效靶比 設置不同于之前，分別為20:1，40:1和80:1)。
[0042] ELISP0T結果見圖5。從統計結果可以看出，經體內免疫并進行體外誘導刺激得到 的轉基因小鼠 CTLs同樣具有顯著分泌IFN-γ的能力。Ρ639實驗組的斑點數為98個極顯著高 于Th表位組和PBS組(P<0.01**)。初步表明我們所構建的免疫模型基本可靠，得到的CTLs 能夠用于后續的細胞毒性檢測等實驗。
[0043] LDH結果見圖6。從統計結果可以看出，P639組在效靶比為40:1和80:1時殺傷率分 別為35%和34%，極顯著（P<0.01**)高于Th組和PBS組(Ρ<0.0Γ~)。而在效靶比為20:1時， 殺傷率最低，為26%，顯著(Ρ<0.01*)高于Th組和PBS組(Ρ<0.0Γ)。結果表明Ρ639組所誘導 的轉基因小鼠 CTLs對靶細胞也有較明顯的殺傷作用。綜上，表位肽Ρ639在轉基因小鼠體內 也具有一定的免疫活性。
[0044]結合上述所有實驗結果可知FAP來源的抗腫瘤CTL表位肽能夠在治療性腫瘤多肽 疫苗的研究中加以應用。
【主權項】
1. FAP來源的抗腫瘤CTL表位肽P639，其特征在于，所述CTL表位肽P639為九肽，其分子 量907.14,序列如SEQ ID NO. 1所示，具體為：GLFKCGIAV，即：Gly- Leu- Phe- Lys- Cys-Gly- He- Ala- Val〇2. 權利要求1所述FAP來源的抗腫瘤CTL表位肽P639的制備方法，其特征在于，采用Fmoc 固相合成法制備而成。3. 權利要求1所述FAP來源的抗腫瘤CTL表位肽P639在制備腫瘤治療藥劑中的應用。
【文檔編號】C07K1/04GK105949302SQ201610361348
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月27日
【發明人】陳鯉翔, 王成功, 王婷, 祁元明, 安秀麗, 高艷鋒, 李國棟
【申請人】鄭州大學