一種蛋白提取和分離純化方法
【專利摘要】本發明公開了一種蛋白提取和分離純化方法，所述蛋白提取和分離純化方法包括卵粘蛋白分離純化方法、雞蛋卵轉鐵蛋白分離純化方法和雞蛋免疫球蛋白提取純化方法；本發明采用先稀釋后均質的方法，蛋清液經生理鹽水稀釋后均質，不僅降低了蛋清液的黏度，而且破壞了其復雜的結構，從而使蛋清液過濾速度較快，膜清洗較為容易，降低了膜的污染程度，延長了膜的使用壽命當操作壓力在0.15MPa時，處于相對平穩的流通狀態，且在一定程度上一直濾液濃差極化現象。本發明以已水稀釋法為基礎，并結合聚乙二醇沉淀以及DEAE?Toyopearl 650M一步洗脫離子交換層析進行純化，得到高回收率高純度的雞卵黃IgY。
【專利說明】
一種蛋白提取和分離純化方法
技術領域
[0001] 本發明屬于糖蛋白技術領域，尤其涉及一種蛋白提取和分離純化方法。
【背景技術】
[0002] 雞卵類粘蛋白是由雞卵清中制得的一種糖蛋白，具有強烈的抑制胰蛋白酶的作 用，常用于胰蛋白酶的酶學性質的研究和胰蛋白酶的親和層析純化制備。分子量:28000Da， 分子由四個分子量相近的亞基組成糖蛋白組成，即D-甘露糖，D-半乳糖，葡萄糖胺，唾液酸； 化學穩定性，耐熱：在80°C條件下，理化性質不發生改變，耐有機溶劑:在50 %的丙酮溶液 中，能保持良好的溶解度，耐沉淀劑:在1 〇 %的TCA的溶液中不發生沉淀。等電點性質，等電 點:pi在3.9-4.5之間，溶液中的狀態:在pH3.0的溶液中穩定，在pH8.0的溶液中容易分解。 雞卵黃免疫球蛋白，簡稱IgY，又稱雞卵黃抗體。具有免疫原性，在蛋黃中以α-、β-和γ-卵黃 球蛋白三種形式存在。
[0003] 目前國際上采用的IgY分離純化方法主要包括水稀釋法、有機溶劑抽提沉淀法、超 濾、超臨界萃取法與凍融等物理化學法及鹽析與DEAE色譜相結合等方法。國內外有關于從 雞蛋清中分離提取活性物質已有較多研究和報道，且已有相關的工業化生產并產生了良好 的經濟效益，如溶菌酶，免疫球蛋白等。而從雞蛋清中提取卵轉鐵蛋白的研究主要還停留在 實驗室規模，并未實現工業化生產，研究進展相對緩慢。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一種蛋白提取和分離純化方法，旨在解決【背景技術】中所述 的問題。
[0005] 本發明是這樣實現的，一種蛋白提取和分離純化方法，所述蛋白提取和分離純化 方法包括卵粘蛋白分離純化方法、雞蛋卵轉鐵蛋白分離純化方法和雞蛋免疫球蛋白提取純 化方法；
[0006] 所述卵粘蛋白分離純化方法采用GaCL2或MgCl2制備卵粘蛋白；
[0007] 所述雞蛋卵轉鐵蛋白分離純化方法包括：新鮮雞蛋清原液，0.9生理鹽水稀釋， 3000r/min離心15min去除卵粘蛋白，再用等電點鹽析除去卵白蛋白；經離心和等電點沉淀 的樣品微濾除去〇. 1_1〇〇Μ?范圍的雜質，進而米用超濾，用聚諷樹脂衍生物膜去除lOOkDa以 上大分子蛋白質，再用聚砜樹脂衍生物膜截留分子量大于50kDa的蛋白質，得濃縮液，得到 的濃縮液進行透析處理，并冷凍干燥；
[0008] 所述雞蛋免疫球蛋白提取純化方法采用已水稀釋法結合聚乙二醇沉淀以及DEAE-Toyopearl 650M-步洗脫離子交換層析進行純化，得到高回收率高純度的雞卵黃IgY。
[0009] 進一步，所述卵粘蛋白分離純化方法包括以下步驟：
[0010] 全蛋清攪拌均勻后加5倍體積的鹽溶液，0.05mol/LMgCl2或〇.lmol/L NaCl，均質 后用0.1mol/L HC1調pH = 6.0,4°C靜置過夜，15,000g離心10min，4°C，沉淀用0.5mol/L NaCl重懸，4°C放置4h，15,000g離心10min，4°C，將得到的沉淀雙蒸水洗滌至上清中不含蛋 白質，沉淀部分即為卵粘蛋白粗提物；
[00?1 ] 粗提物溶解于1 〇mmo 1 /L硼酸鹽酸緩沖液pH = 9.6中配成5mg/ml溶液，4°C攪拌過 夜，0.45μπι微孔濾膜過濾后進行凝膠層析，洗脫液為含0.2mol/LMgCld^]TriS-HCl緩沖液， 20mmol/L，pH=8.4，流速0.5ml/min;收集各洗脫峰的凍干樣品經SDS-PAGE進行鑒定，目標 組分冷凍干燥后-20 °C保存。
[0012] 進一步，所述卵粘蛋白對大腸桿菌和沙門氏菌的最小抑菌濃度分別為0.05mg/mL 和0.2mg/mL。
[0013] 進一步，所述雞蛋卵轉鐵蛋白分離純化方法包括：
[0014] 連接好超濾裝置，通過0.2MPa超純水壓力持續lh，待水流通量穩定后，測定超濾膜 初始純水通量，超濾完畢后，取出超濾膜進行蒸餾水沖洗，并用0.1M NaOH和0.1M HC1浸泡 30min，最后用蒸餾水反復沖洗，再次測定膜純水流通量；
[0015] 新鮮雞蛋清原液，0.9生理鹽水稀釋，3000r/min離心15min去除卵粘蛋白，再用等 電點鹽析除去卵白蛋白；
[0016] 經離心和等電點沉淀的樣品微濾除去0.1 -1 ΟΟμπι范圍的雜質，進而采用超濾技術， 用聚砜樹脂衍生物膜去除l〇〇kDa以上大分子蛋白質，再用聚砜樹脂衍生物膜截留分子量大 于50kDa的蛋白質，得濃縮液，之后得到的濃縮液進行透析處理，并冷凍干燥。
[0017] 進一步，所述蛋白提取和分離純化方法的超濾裝置壓力為0.15MPa，0.9生理鹽水 稀釋倍數為10倍，攪拌速率為125r/min，此時膜通量值為39.80, pH為7。
[0018] 進一步，所述雞蛋免疫球蛋白提取純化方法包括：
[0019] 選取新鮮雞蛋，采用蛋清蛋黃分離器，分離得到蛋黃，用蒸餾水將蛋黃洗凈，置于 濾紙上吸干，刺破蛋黃膜，收集蛋黃液，以體積百分比計，用蒸餾水對蛋黃進行不同倍數的 稀釋8倍攪拌均勻，調節不同pH值5.0~5.6,4°C靜置不同時間（2h、4h、6h、8h、10h)，5000X 冷凍離心30min后，得澄清上清液含IgY水溶性組分WSF;
[0020] 向所得的WSF中加入不同質量分數的PEG6000,磁力攪拌器攪拌30min，22000Xg冷 凍離心，收集沉淀；
[0021] 透析，收集沉淀加入蒸餾水，攪拌，裝入透析袋，截留分子量為8000-14000KD中，4 °C透析除去部分殘留PEG6000,冷凍干燥即得粗IgY組分；
[0022] 離子交換色譜法純化IgY，用Na2HP〇4_NaH2P〇4緩沖液平衡，設置pH值為6.0，7.0， 8.0條件下不同緩沖液離子強度（0.03m〇l/L、0.05m〇l/L、0.1m〇l/L)上樣平衡、恒流洗脫 (0.075111 〇1/1，0.1111〇1/1)，洗脫流出液按每管51111/31^11自動收集;將層析所收集的組分裝入 透析袋截留分子量為8000-14000KD，置于蒸餾水中，4°C透析除鹽。
[0023]本發明提供的蛋白提取和分離純化方法，采用GaCL2與MgCl2結合的方法制備卵粘 蛋白效果最佳，制備的卵粘蛋白純度>97%，采用該方法制備的卵粘蛋白純度大于97%，終 產量408.65 ± 4.32mg/ 100g蛋清，回收率為(85.3 ± 1.08) %。經凝膠過濾分離，成功分離得 到純卵粘蛋白為302. lmg，總得率為57.03%。
[0024]本發明采用先稀釋后均質的方法，蛋清液經生理鹽水稀釋后均質，不僅降低了蛋 清液的黏度，而且破壞了其復雜的結構，從而使蛋清液過濾速度較快，膜清洗較為容易，降 低了膜的污染程度，延長了膜的使用壽命當操作壓力在〇.15MPa時，處于相對平穩的流通狀 態，且在一定程度上一直濾液濃差極化現象。
[0025] 本發明以已水稀釋法為基礎，并結合聚乙二醇沉淀以及DEAE-Toyopearl650M-步 洗脫離子交換層析進行純化，得到高回收率高純度的雞卵黃IgY。
【附圖說明】
[0026] 圖1是本發明實施例提供的蛋白提取和分離純化方法流程圖。
[0027 ]圖2是本發明實施例提供的ovomuc i η對大腸桿菌生長曲線影響示意圖。
[0028 ]圖3是本發明實施例提供的ovomuc i η對沙門氏菌生長曲線影響示意圖。
[0029] 圖4是本發明實施例提供的ovomucin對金黃色葡萄球菌生長曲線影響示意圖。
[0030] 圖5是本發明實施例提供的卵轉鐵蛋白超濾分離的工藝流程圖。
[0031] 圖6是本發明實施例提供的稀釋倍數對雞蛋清液相對粘度的影響示意圖。
[0032] 圖7是本發明實施例提供的剪切速率對雞蛋清液相對粘度的影響示意圖。
[0033] 圖8是本發明實施例提供的溫度對雞蛋清液相對粘度的影響示意圖。
【具體實施方式】
[0034]為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明 進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于 限定本發明。
[0035] 下面結合附圖對本發明的應用原理作詳細的描述。
[0036] 一、卵粘蛋白
[0037] 1.2卵粘蛋白分離純化
[0038] 1.2.1卵粘蛋白分離純化的工藝流程，如圖1所示。
[0039] S101:全蛋清攪拌均勻后加5倍體積的鹽溶液（0.05mol/LMgCl2或0.1m〇l/L NaCl)，均質后用0.1mol/L HC1 調pH = 6.0,4°C靜置過夜，15,000g離心 10min(4°C)，沉淀用 0.5mol/L NaCl重懸，4°C放置4h，15，000g離心10min(4°C )，將得到的沉淀雙蒸水洗滌至上 清中不含蛋白質，沉淀部分即為卵粘蛋白粗提物；
[0040] S102:粗提物溶解于10mmol/L硼酸鹽酸緩沖液(pH=9.6)中配成5mg/ml溶液，4°C 攪拌過夜，〇. 45μηι微孔濾膜過濾后進行凝膠層析(Sephacry IS-300HR，2.0*7cm)，洗脫液為 含0 · 2mol/LMgCl2的Tris-HCl緩沖液(20mmol/L，pH = 8.4)，流速0 · 5ml/min。收集各洗脫峰 的凍干樣品經SDS-PAGE進行鑒定，目標組分冷凍干燥后-20°C保存。
[0041] 1.2.2分步鹽析制備卵粘蛋白粗品
[0042] 全蛋清攪拌均勻后加5倍體積的鹽溶液(0.05mol/LMgCl2或0. lmol/L NaCl)，均質 后用0.1mol/L HC1調pH = 6.0,4°C靜置過夜，15,000g離心10min(4°C)，沉淀用0.5mol/L NaCl重懸，4°C放置4h，15,000g離心10min(4°C)，將得到的沉淀雙蒸水洗滌至上清中不含蛋 白質，沉淀部分即為卵粘蛋白粗提物。
[0043] 1.2.3凝膠過濾層析
[0044] 粗提物溶解于1 Ommo 1 /L硼酸鹽酸緩沖液(pH = 9.6)中配成5mg/ml溶液，4 °C攪拌過 夜，0.45μηι微孔濾膜過濾后進行凝膠層析（Sephacry IS-300HR，2.0*7cm)，洗脫液為含 0·2mol/LMgCl2的Tris-HCl緩沖液(20mmol/L，pH = 8.4)，流速0·5ml/min。收集各洗脫峰的 凍干樣品經SDS-PAGE進行鑒定，目標組分冷凍干燥后-20°C保存。
[0045] 1.2.4聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)
[0046] SDS-PAGE采用Tris-HCl緩沖系統進行垂直電泳，分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度 為5%，考馬斯亮藍R-250(2%)和Schifft試劑分別進行染色。蛋白質溶解液為含SDS(1%， w/v)和2-巰基乙醇（ΙΟμΙ/mL)的0·01mol/L Tris-HCl(pH=7·0)緩沖液。工作電壓8V/cm。
[0047] PAGE膠經凝膠成像系統成像后經Gelpro. 32蛋白質圖像分析軟件對目標條帶進行 分析。
[0048] 1.2.5純度測定
[0049] 采用HPLC法測定卵粘蛋白的純度，目標組分配制成lmg/mL的溶液進樣，RP-HPLC采 用C4柱，流動相為體積分數0.05 %三氟醋酸水溶液，柱溫30°C，進樣量20μ1，15-95 %乙腈梯 度洗脫，檢測波長280nm，流速為lmL/min 〇 [0050] 1.2.6產量和得率的測定
[0051]卵粘蛋白的含量用l〇〇g蛋清蛋白質中卵粘蛋白的毫克數表示。計算公式為：
[0053]其中，W=100g蛋清為原料制備的冷凍干燥后的粉末質量(g);
[0054]卵粘蛋白的得率即為制備樣品中含量與蛋清原料中含量的比率，計算公式為：
[0056]其中，Wi為干燥后樣品的質量，W2為蛋清質量 [0057] 1.2.7卵粘蛋白抗菌特性研究
[0058] 以大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌為實驗對象，對卵粘蛋白的體外抗菌性能 進行評價。
[0059] 1)菌種活化與接種
[0060] 菌種解凍后置無菌操作臺上接種到營養肉湯中，37°C恒溫震蕩培養12h，使菌落數 達1〇1()并制成菌懸液。
[00611 2)最小抑菌濃度的測定(MIC)
[0062] MIC采用二倍稀釋法測定。實驗過程參照文獻(左娟和馬美湖2010)。
[0063] 3)生長曲線的測定
[0064] 活化的菌種用滅菌的營養肉湯稀釋至菌體濃度為108CFU/ml，進而取100yL加到96 孔酶標板中，在樣品孔加入l〇〇yL經過0.45μπι的細菌過濾器過濾的卵粘蛋白溶液(0.05mg/ mL)混勻，37 °C恒溫培養箱中培養24h后于酶標儀上測定0D6QQnm。以0D6QQ對培養時間作圖繪 制菌體生長曲線，同時設空白對照，陽性對照和陰性對照，每孔5個平行，實驗重復3次。 [0065] 4)抑菌率的測定
[0066] 96孔板中依次加入稀釋的活化菌懸液100yL，0.05mg/mL卵粘蛋白溶液(0.45μπι細 菌過濾器過濾）l〇〇yL，混勻后于37 °C恒溫培養箱中培養24h，酶標儀上測定ODsoonm，空白對 照為100yL培養基加100yL生理鹽水，對照組為生理鹽水代替樣品組的卵粘蛋白溶液，抑菌 率按照以下公式計算(Kodama，Kimura，2001)。
[0068] 1.2.8卵黏蛋白體外抗病毒活性評價
[0069] 1.2.8.1病毒的活化及病毒懸液的制備
[0070] 取出低溫凍存的試驗病毒株，37°C溫水浴融化，加入l_2mL細胞維持液，然后接種 于已經長滿單層細胞的細胞培養瓶中，置37°C溫箱中使與細胞吸附、生長。逐日在顯微鏡下 觀察病變，待3/4細胞出現病變時，收集培養液，并反復凍融宿主細胞，釋放病毒。6000rpm離 心15min，去除沉淀(主要為細胞碎片），上清液即為所需要的病毒懸液。分裝存于-70°C冰箱 中，滴定效價備用。
[0071] 1.2.8.2雞紅細胞的制備
[0072]滅菌注射器預先用3.8%的檸檬酸鈉洗后吸取正常健康雞血，放于預先加入3倍體 積的阿氏液的滅菌離心管內，輕輕混勻后經1800r/min離心10min，棄上清液。再加滅菌的 PBS懸浮血球，1800r/min離心10min，棄上清液。重復該步驟3次，充分吸取白細胞與血小板 等后，將沉淀的紅細胞根據所需用量用生理鹽水配成1 %濃度。
[0073] 1.2.8.3病毒毒力的測定
[0074] 1)流感病毒的血凝滴度
[0075] 取塑料96孔板，自左至右歌加入30yL于第二孔，混勻，以此倍比稀釋至11孔，吸取 30yL吸棄至消毒液中。稀釋后各孔的稀釋度分別1:2、1:4，1:8……最后一孔為對照。各孔加 入1 %的雞RBC30yL，衛星混合器上搖振lmin，使血球與病毒充分混合。37 °C溫箱中作用15-30min，待對照孔的紅細胞沉淀可觀察結果。效價判定時對照管應不凝集，試驗管中以能使 發生"++"凝集的病毒最高稀釋度為凝集效價，該管稀釋度即為1個血凝單位。
[0076] 2)流感病毒的TCID50的測定
[0077] 取出一塊細胞培養板，每個孔大約傳 8000-10000個細胞，每個孔的細胞大約70% 豐度即可接種病毒。在EP管中用無血清孵育液10倍倍比稀釋病毒原液。用多道加樣器吸去 97孔板中的培養液，吸取孵育液加在每孔中再輕輕吹打一次，然后吸出孵育液。將稀釋好的 病毒液加到96孔板上，每孔100yL，設置正常的細胞對照。37 °C ω2培養箱中孵育1 h，取出培 養板，顯微鏡下觀察細胞病變。觀察CPE，找出能引起半數細胞瓶或管感染的病毒稀釋倍數， 按Reed-Muench法計算出該病毒液的TCID50。
[0078] lgTCID50 =距離比例X稀釋對數之間的差+高于50%病變率的稀釋度的對數
[0079] TCID50=Antilog高于50%病變的病毒最高稀釋度的對數+距離比例
[0081 ] 1.2.8.4對雞紅細胞的毒性
[0082] 用PBS將ovomucin配成10mg/mL的原液，在96孔V型微量血凝板中用PBS將ovomucin 原液依次倍比稀釋，每孔30此。然后每孔加1%紅細胞懸液30yL，并使之充分搖勻，于溫室靜 置30-60min，觀察紅細胞的凝聚情況。
[0083] 2結果與分析 [0084] 2.1卵粘蛋白的粗制備
[0085] 采用GaCL2與MgCl2結合的方法制備卵粘蛋白效果最佳。該方法制備的卵粘蛋白純 度>97 %，采用該方法制備的卵粘蛋白純度大于97 %，終產量408.65 ±4.32mg/100g蛋清，回 收率為(85·3±1·08)%。
[0086] 2.2卵粘蛋白的層析純化
[0087] 鹽析后卵粘蛋白粗提物在Sephacry S-300上洗脫，洗脫液為含0.05mol/ LMgCl2Tris-HCl (20mmo 1/L，pH8.4)，粗提物經凝膠層次西后有4個蛋白洗脫峰。將不同洗脫 峰的蛋白進行SDA-PAGE電泳分析，100g全蛋清中約有385.87 ± 5.32mg，得率約為73.83%， 經凝膠過濾分離，成功分離得到純卵粘蛋白為302. lmg，總得率為57.03%。
[0088] 2.3卵粘蛋白對不同細菌的抑制效果
[0089] 采用常量肉湯稀釋法研究了不同濃度的卵粘蛋白對本實驗室保存的沙門氏菌、大 腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果。結果如表1所示。
[0090] 表1卵粘蛋白對沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度(MIC)
[0092] 注：表示葡萄糖-酚紅肉湯培養基未變色；"+"表示葡萄糖-酚紅肉湯培養基變 成黃色，有菌落生長
[0093] Note :''-''represent that the color of Broth medium does not change,no bacterial grow;〃+〃represent that the color of Broth medium changed to yellow, bacterial grow.
[0094] 從表1中可以看出，卵粘蛋白對三種細菌的抗菌性有顯著差異，其中對大腸桿菌和 沙門氏菌均有不同程度的抑制作用，在卵粘蛋白濃度達到〇.2mg/mL以上時，沙門氏菌培養 基不變色，表明沙門氏菌生長受到明顯抑制。而在卵粘蛋白濃度達到0.050mg/mL以上時，大 腸桿菌培養基不變色，表明此時大腸桿菌生長受到明顯抑制。因此，卵粘蛋白對大腸桿菌和 沙門氏菌的最小抑菌濃度分別為0.05mg/mL和0.2mg/mL。而在試驗濃度度范圍內，卵粘蛋白 對金黃色葡萄球菌的影響則相反，加入卵粘蛋白的實驗組培養基均變為黃色，即各實驗組 均有菌落生長，且培養基顏色比空白對照組顏色較深，表明此時菌體生長不但未受到抑制， 反而受到促進，但各濃度組的效果差異不顯著(P>〇.05)。因此卵粘蛋白對金黃色葡萄球菌 無明顯抑制作用。
[0095] 2.4卵粘蛋白對細菌生長曲線的影響
[0096] 采用比濁法測定了不同濃度卵粘蛋白對三種細菌生長曲線的影響，結果分別如圖 2,圖3,圖4所示：
[0097] 由上述各圖可以看出，卵粘蛋白對實驗用三種細菌生長曲線的影響比較顯著。且 在圖2中可以看出，加入0.05mg/mL卵粘蛋白后大腸桿菌的生長曲線在整個生長周期均位于 對照組之下。表明大腸桿菌在整個生長周期的過程中均受到明顯抑制。在圖3中，沙門氏菌 在適應期和對數期受到抑制。因此，卵粘蛋白對沙門氏菌的發揮作用方式是延緩菌體的對 數期，無明顯殺菌活性。而卵粘蛋白對金黃色葡萄球菌(圖4)則無明顯抑制作用。
[0098] 2.5卵黏蛋白體外抗病毒活性評價
[0099] 2.5.1受試病毒株的毒力
[0100]將出他受試病毒株感染敏感細胞后每天倒置顯微鏡下觀察細胞的形態變化，以7d 內出現細胞病變的樣品孔為陽性孔，計算實驗病毒株的TCID5Q，并測定毒株的血凝效價。結 果發現HiNi受試病毒株的血凝效價為1:320，TCID 5Q為ΚΓ3·4。
[0101] 2.5.2不同樣品對雞紅細胞的毒性
[0102] 分別對卵粘蛋白進行稀釋，研究不同濃度稀釋液對HiNi-MDCK細胞的毒性，結果如 表2。
[0103]表2雞蛋卵粘蛋白對雞紅細胞的細胞毒性
[0105]注：表示發生血凝，不沉積；"+"輕微血凝；"++"不發生血凝，細胞完全沉積 [0106]由表所示，當卵粘蛋白濃度為5mg/mL或低于5mg/mL時，對雞血紅細胞無毒性作用， 但當卵粘蛋白濃度達到10mg/mL以后，細胞不能發生正常的沉積作用，而平鋪在微量血凝板 的V型孔中，因此認為10mg/mL卵粘細胞對紅細胞有細胞毒性作用。
[0107] 不同濃度卵粘蛋白對新城疫病毒的血凝效價隨濃度升高而降低，對新城疫病毒的 血凝效價抑制率隨濃度增加而上升。說明雞卵粘蛋白對新城疫病毒具有很強的抑制作用。
[0108] 二、雞蛋卵轉鐵蛋白（卵伴白蛋白）分離純化及體外抗菌研究
[0109] 國內外有關于從雞蛋清中分離提取活性物質已有較多研究和報道，且已有相關的 工業化生產并產生了良好的經濟效益，如溶菌酶，免疫球蛋白等。而從雞蛋清中提取卵轉鐵 蛋白的研究主要還停留在實驗室規模，并未實現工業化生產，研究進展相對緩慢。本實驗采 用兩步超濾法分離提取卵轉鐵蛋白，經冷凍干燥后得到產品，為工業生產提供參考。
[0110] 1材料與方法
[0111] 1.1材料
[0112] 1.1.1原材料
[0113] 鮮雞蛋金翼蛋品有限公司提供 [0114]卵轉鐵蛋白標準品sigma中國公司 [0115] 供試菌種：
[0116]金黃色葡萄球菌（Staphylovovvus aure，ATCC 29213)
[0117] 大腸桿菌(Escherichia coli，ATCC 25922)
[0118] 沙門氏菌(Salmonella，CICC 21382)均由本實驗室保存。
[0119] 1.1.2主要試劑
[0122] 1.2實驗方法
[0123] 1.2.1卵轉鐵蛋白超濾分離的工藝流程，如圖5所示。
[0124] 1.2.2超濾裝置及操作要點
[0125] 連接好超濾裝置，預先通過0.2MPa超純水壓力持續lh，待水流通量穩定后，測定超 濾膜初始純水通量，超濾完畢后，取出超濾膜進行蒸餾水沖洗，并用0.1M NaOH和0.1M HC1 浸泡30min，最后用蒸餾水反復沖洗，再次測定膜純水流通量，保證其初始通量達到98 %以 上。
[0126] 新鮮雞蛋清原液，0.9生理鹽水稀釋，3000r/min離心15min去除卵粘蛋白，再用等 電點鹽析除去卵白蛋白。經離心和等電點沉淀的樣品微濾除去〇. 1 -1 OOwn范圍的雜質，進而 采用超濾技術，用聚砜樹脂衍生物膜(截留分子量lOOkDa)去除lOOkDa以上大分子蛋白質， 再用聚砜樹脂衍生物膜(截留分子量50kDa)截留分子量大于50kDa的蛋白質，得濃縮液，之 后得到的濃縮液進行透析處理，并冷凍干燥
[0127] 1.2.3前處理對蛋清液粘度的影響
[0128] 1.2.3.1稀釋倍數對蛋清液黏度的影響
[0129] 取適量蛋清液，用0.9 %的NaCl溶液稀釋，稀釋倍數分別為5倍，10倍，15倍，20倍， 25倍，3000r/min冷凍離心10min，取上清液測定蛋清黏度。
[0130] 1.2.3.2剪切速率對蛋清液黏度的影響
[0131 ]稀釋后的蛋清分別在4000r/min，5000r/min，6000r/min，7000r/min，8000r/min 高 速分散均質器上進行均質，分別測定蛋清液黏度，考察均質對蛋清液黏度的影響。
[0132] 1.2.3.3溫度對蛋清液黏度的影響
[0133] 將經過稀釋的蛋清液分別加熱到30°C，35°C，40°C，45°C，50°C，測定不同溫度下蛋 清液的黏度，研究溫度對蛋清液黏度的影響。
[0134] 1.2.4超濾工藝條件的研究
[0135] 1.2.4.1物料稀釋倍數對卵轉鐵蛋白分離的影響
[0136]將雞蛋液攪拌速率固定為125r/min，操作壓力為0 . lOMPa，pH值為6以體積比5倍， 10倍，15倍，20倍進行稀釋，以單位時間膜通量為評價指標，考察蛋清液稀釋倍數對卵轉鐵 蛋白膜分離效果的影響。
[0137] 1.2.4.2攪拌速率對卵轉鐵蛋白分離的影響
[0138] 固定雞蛋清液稀釋倍數為10倍(v/v)，超濾裝置操作壓力為0. lOMPa，溶液pH值為 6。攪拌速率分別為50r/min，125r/min，200r/min，以單位時間膜通量為評價指標，研究攪拌 速率對雞蛋清卵轉鐵蛋白膜分離效果的影響。
[0139] 1.2.4.3操作壓力對卵轉鐵蛋白分離的影響
[0140]固定雞蛋清液稀釋倍數為10倍(v/v)，攪拌速率為125r/min，pH值為6,操作壓力分 別為0.05MPa，0. lOMPa，0.15MPa，以單位時間內膜通量為評價指標，研究操作壓力對蛋清卵 轉鐵蛋白膜分離效果的影響。
[0141] 1.2.4.4pH值對卵轉鐵蛋白分離的影響
[0142] 固定雞蛋清液稀釋倍數為10倍(v/v)，攪拌速率為125r/min，超濾裝置操作壓力為 0· lOMPa。用0· lmol/L NaOH和0· lmol/L HC1分別將蛋清液的pH值調至6、7、8,以單位時間內 膜通量為評價指標，研究pH值對卵轉鐵蛋白分離效果的影響。
[0143] 1.2.5相對黏度的測定
[0144] 使用烏氏黏度計測定。參考文獻尹業平、王輝憲2007。
[0145] 1.2.6膜通量的測定
[0146] 用來表征超濾膜過濾料液的速率，是衡量膜性能的重要指標。
[0147] 膜通量率計算公式：
[0149] 式中J:膜通量，L· (m'h'Q:通過量，L;t:操作時間，h;A:膜面積，m2
[0150] 1.3SDS-PAGE 電泳
[0151]凝膠制備:配置分離膠濃度為10%、濃縮膠濃度為5%。
[0152] 樣品處理:將樣品用緩沖液配成lmg/mL濃度，電泳前沸水加熱3~5min。
[0153] 電泳條件:濃縮膠中恒壓80V，待樣品進入分離膠調整電壓至120V，恒壓lh。
[0154] 1.4反向高效液相色譜(RT-HPLC)檢測卵轉鐵蛋白
[0155] 將lmg/mL卵轉鐵蛋白做標樣，色譜柱選用Vydac214TP54C4柱。
[0156] 1.5卵轉鐵蛋白的鑒定與純度分析
[0157] 將透析的蛋清液、層析后的收集液先經過10 %的SDS-PAGE電泳對卵轉鐵蛋白進行 鑒定，然后通過HPLC測定純度。
[0158]蛋白質樣品的預處理:取蛋白質樣液與樣品處理液等體積混勻，在100°C水浴中處 理2min，冷卻室溫后備用。
[0161] 1.6數據分析
[0162] 采用Excel建立數據庫，用0rigin7.5版本軟件繪圖，用DPS200，SAS8.1數據處理軟 件進行數據分析。
[0163] 2實驗結果與分析
[0164] 2.1降低蛋清黏度的單因素實驗
[0165] 2.1.1稀釋倍數對蛋清液黏度的影響結果
[0166] 采用先稀釋后均質的方法，蛋清液經生理鹽水稀釋后均質，不僅降低了蛋清液的 黏度，而且破壞了其復雜的結構，從而使蛋清液過濾速度較快，膜清洗較為容易，降低了膜 的污染程度，延長了膜的使用壽命
[0167] 由圖6可以看出，蛋清液的相對黏度隨稀釋倍數的增加而下降，稀釋倍數從5倍大 15倍，黏度下降明顯。進而緩慢，趨近于時間軸，確定最佳倍數15倍。
[0168] 2.1.2剪切速率對蛋清液黏度的影響結果
[0169]蛋清經稀釋后，蛋液的黏稠度還有可能阻塞活污染超濾膜，因此采用高速分散均 質機來降低蛋清液黏度。經過高速分散均質后的蛋白，相對黏度下降很快，如圖7所示：
[0170] 2.1.3溫度對蛋清液黏度的影響結果
[0171]溫度升高可降低蛋清液黏度，但溫度過高又會造成蛋白質變性，因此考察溫度對 蛋清液黏度的影響。如圖8所示：
[0172]如圖8所示，隨著溫度的升高，蛋清液黏度下降很明顯。但當溫度過高，超過45°C 后，卵轉鐵蛋白的黏度迅速增大，這和蛋清液中蛋白因高溫而改變結構有關。因此實驗選擇 45 °C為適宜操作溫度。
[0173] 2.1.4膜通量的單因素試驗
[0174] 2.1.4.1物料稀釋倍數對分離卵轉鐵蛋白膜通量的影響結果
[0175] 膜通量隨著超濾時間的延長而逐漸降低，前lOmin內膜通量下降均較快，lOmin后， 膜通量下降較為平緩。當稀釋倍數確定為15倍時，濾液的濃差極化現象較平緩且設備運行 較穩定，因此稀釋倍數控制在15倍以內（v/v)。
[0176] 2.1.4.2攪拌速率對分離卵轉鐵蛋白膜通量的影響結果
[0177]膜通量隨著蛋清液超濾的進行，下降較為平緩。攪拌速率為50r/min時超濾系統運 行平穩，但膜通量低。攪拌速率為125r/min時流通量下降較慢，相對流通量較大。攪拌速率 為200r/min時膜通量下降較快，且超濾后期流通量下降較快。綜合考慮，將攪拌速率控制在 125r/min 左右。
[0178] 2.1.4.3操作壓力對分離卵轉鐵蛋白膜通量的影響結果
[0179] 隨著濾液超濾時間的延長，蛋清液濃差極化現象加重，膜通量變小。當操作壓力在 0.15MPa時，處于相對平穩的流通狀態，且在一定程度上一直濾液濃差極化現象。
[0180] 2.1.4.4pH值對分離卵轉鐵蛋白膜通量的影響結果
[0181] 隨著超濾時間的延長，濾液的膜通量迅速下降，當pH為7時，整體超濾系統處于相 對穩定狀態。
[0182] 2.1.5超濾最佳條件的優化結果
[0183] 實驗選取操作壓力、稀釋倍數、攪拌速率3個因素進行正交實驗，以單位時間內膜 通量為考察指標，對超濾工藝條件進行優化。經組合實驗發現，影響超濾膜通量的主次順序 為操作壓力 > 稀釋倍數>攪拌速率，最優組合為超濾裝置壓力為〇.15MPa，溶液稀釋倍數10 倍，攪拌速率為125以11^11。此時膜通量值為39.80。
[0184] 2.1.6SDS-PAGE 電泳結果
[0185] 凍干后獲得的卵轉鐵蛋白樣品主要是78KDa左右的卵轉鐵蛋白和45KDa左右的卵 清蛋白，還有點雜蛋白條帶，原因可能是部分卵轉鐵蛋白與其他蛋白以結合態形式存在，不 易分開。
[0186] 2 · 1 · 7RT-HPLC 分析結果
[0187] 2.1.8體外抗菌研究
[0188] 表3卵轉鐵蛋白和防腐劑的抑菌活性比較
[0190] 注：牛津杯法又稱管蝶法，抑菌圈直徑蘭20mm為極敏感"+++"，15mm蘭抑菌圈直徑 蘭20mm為高敏感"++"，10mm蘭抑菌圈直徑蘭15mm為中敏感"+"，抑菌圈直徑蘭10mm為低敏或 無效"一"
[0191 ]由表可知，卵轉鐵蛋白對大腸桿菌抑菌效果最強，對沙門氏菌次之，對金黃色葡萄 球菌抑菌效果相對較弱。
[0192] 三、雞蛋免疫球蛋白提取純化及體外抑菌效果
[0193] 雞卵黃免疫球蛋白，簡稱IgY，又稱雞卵黃抗體。具有免疫原性，在蛋黃中以α-、β- 和γ-卵黃球蛋白三種形式存在。目前國際上采用的IgY分離純化方法主要包括水稀釋法、 有機溶劑抽提沉淀法、超濾、超臨界萃取法與凍融等物理化學法及鹽析與DEAE色譜相結合 等方法。本實驗在首先實驗室中操作，因此前期研究已水稀釋法為基礎，并結合聚乙二醇沉 淀以及DEAE-Toyopearl 650M-步洗脫離子交換層析進行純化，得到高回收率高純度的雞 卵黃IgY。
[0194] 1 方法
[0195] 1.1粗IgY 制備
[0196] 1.1.1水稀釋法獲得水溶性組分(WSF)
[0197] 選取新鮮雞蛋，采用蛋清蛋黃分離器，分離得到蛋黃，用蒸餾水將蛋黃洗凈，置于 濾紙上吸干，刺破蛋黃膜，收集蛋黃液，以體積百分比計，用蒸餾水對蛋黃進行不同倍數的 稀釋(2倍，4倍，6倍，8倍，10倍)攪拌均勻，調節不同pH值(4.6、4.8、5.0、5.2、5.4)，4°C靜置 不同時間（2h、4h、6h、8h、10h)，5000 X冷凍離心30min后，得澄清上清液含IgY水溶性組分 (ffSF)〇
[0198] 1.1.2PEG 沉淀蛋白
[0199] 向所得的WSF中加入不同質量分數的PEG6000,磁力攪拌器攪拌30min，22000Xg冷 凍離心，收集沉淀。
[0200] 1.1.3透析
[0201]收集沉淀加入一定量的蒸餾水，攪拌，裝入透析袋(截留分子量為8000-14000KD) 中，4°C透析除去部分殘留PEG6000,冷凍干燥即得粗IgY組分。
[0202] 1 · 1 · 4離子交換色譜法純化IgY
[0203] 用Na2HP〇4_NaH2P〇4緩沖液平衡，設置pH值為6.0，7.0，8.0條件下不同緩沖液離子 強度（0.03111〇1凡、0.051]1〇1凡、0.11]1〇1凡）上樣平衡、恒流洗脫（0.0751]1〇1凡，0.11]1〇1凡），通過 對比研究確定最佳緩沖液pH和洗脫液離子強度。洗脫流出液按每管5ml/3min自動收集。將 層析所收集的組分裝入透析袋(截留分子量為8000-14000KD)，置于蒸餾水中，4°C透析除 鹽。
[0204] 1.1.5蛋白質含量測定
[0205] 1.1.5.1粗蛋白含量測定以牛血清白蛋白為標準蛋白質，用考馬斯亮藍法測定蛋 白質含量。
[0206] 1.1.5.2粗 IgY 含量測定
[0207] 測定樣品280nm下吸光值。
[0208] 1.1.6IgY 純度測定
[0209] SDS-PAGE凝膠電泳分析，5 %的濃縮膠，10 %的分離膠，濃縮膠電泳電壓80V，分離 膠電壓120V，電泳樣品用G250考馬斯亮藍染色后再按照標準程序褪色。利用Lab-Image軟件 推算IgY純度。
[0210] 1.1.7IgY回收率測定
[0211] IgY回收率公式計算：
[0213] 2實驗結果
[0214] 2.1不同稀釋倍數對IgY分離效果的影響
[0215]分別取15mL蛋黃液，用不同量的無菌水稀釋，攪拌均勻，稀釋倍數為2,4,6,8，10 倍，考馬斯亮藍法測定蛋白質含量，確定最佳稀釋倍數為8倍，蛋白質含量為375.27mg/mL。 [0216] 2.2不同pH對IgY分離效果的影響
[0217] 上清液中蛋白質含量在pH5 · 0-5 · 6時回收率較高，均在300mg/mL以上，其中pH5 · 2 時達到最高值321.57mg/mL。
[0218] 2.3SDS-PAGE 凝膠電泳
[0219] 2.4IgY抗菌實驗效果
[0220] IgY對大腸桿菌，沙門氏菌，金黃色葡萄球菌生長曲線抗菌效果：
[0221] 當在細菌液中加入IgY和優爾蛋白后，IgY和優爾蛋白對枯草芽飽桿菌和大腸桿菌 在生長初期有明顯的抑制作用，試驗組和對照組的0D值有明顯的差異。而經過24小時后的 抑制作用下降，推測是由于溫度對其的影響導致IgY的失活，從而使IgY成為菌株的氮源有 利于菌株得生長。IgY對于金黃色葡萄球菌抑制作用不明顯，對照組的0D值較實驗組的值 小。
[0222] 以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精 神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種蛋白提取和分離純化方法，其特征在于，所述蛋白提取和分離純化方法包括卵 粘蛋白分離純化方法、雞蛋卵轉鐵蛋白分離純化方法和雞蛋免疫球蛋白提取純化方法； 所述卵粘蛋白分離純化方法采用GaCL2或MgCl2制備卵粘蛋白； 所述雞蛋卵轉鐵蛋白分離純化方法包括:新鮮雞蛋清原液，〇. 9生理鹽水稀釋，3000r/ min離心15min去除卵粘蛋白，再用等電點鹽析除去卵白蛋白；經離心和等電點沉淀的樣品 微濾除去0.1-IOOlWi范圍的雜質，進而采用超濾，用聚砜樹脂衍生物膜去除IOOkDa以上大分 子蛋白質，再用聚砜樹脂衍生物膜截留分子量大于50kDa的蛋白質，得濃縮液，得到的濃縮 液進行透析處理，并冷凍干燥； 所述雞蛋免疫球蛋白提取純化方法采用已水稀釋法結合聚乙二醇沉淀以及DEAE-Toyopearl 650M-步洗脫離子交換層析進行純化，得到高回收率高純度的雞卵黃IgY。2. 如權利要求1所述的蛋白提取和分離純化方法，其特征在于，所述卵粘蛋白分離純化 方法包括以下步驟： 全蛋清攪拌均勻后加5倍體積的鹽溶液，0.05mol/LMgCl2或O.lmol/L NaCl，均質后用 O.lmol/L HCl調pH=6.0,4°C靜置過夜，15,000g離心10min，4°C，沉淀用0.5mol/L NaCl重 懸，4°C放置4h，15，000 g離心10min，4°C，將得到的沉淀雙蒸水洗滌至上清中不含蛋白質， 沉淀部分即為卵粘蛋白粗提物； 粗提物溶解于I Ommo 1/L硼酸鹽酸緩沖液pH=9.6中配成5mg/ml溶液，4 °C攪拌過夜，0.45 μπι微孔濾膜過濾后進行凝膠層析，洗脫液為含0.2 mol/LMgCl2的Tris-HCl緩沖液，20mmol/ L，pH=8.4，流速0.5ml/min;收集各洗脫峰的凍干樣品經SDS-PAGE進行鑒定，目標組分冷凍 干燥后-20 °C保存。3. 如權利要求2所述的蛋白提取和分離純化方法，其特征在于，所述卵粘蛋白對大腸桿 菌和沙門氏菌的最小抑菌濃度分別為〇. 〇5mg/mL和0.2mg/mL。4. 如權利要求1所述的蛋白提取和分離純化方法，其特征在于，所述雞蛋卵轉鐵蛋白分 離純化方法包括： 連接好超濾裝置，通過〇. 2MPa超純水壓力持續Ih，待水流通量穩定后，測定超濾膜初始 純水通量，超濾完畢后，取出超濾膜進行蒸餾水沖洗，并用0.1 M NaOH和0.1 M HCl浸泡 30min，最后用蒸餾水反復沖洗，再次測定膜純水流通量； 新鮮雞蛋清原液，〇 .9生理鹽水稀釋，3000r/min離心15min去除卵粘蛋白，再用等電點 鹽析除去卵白蛋白； 經離心和等電點沉淀的樣品微濾除去0.1 -1 OOym范圍的雜質，進而采用超濾技術，用聚 砜樹脂衍生物膜去除IOOkDa以上大分子蛋白質，再用聚砜樹脂衍生物膜截留分子量大于 50kDa的蛋白質，得濃縮液，之后得到的濃縮液進行透析處理，并冷凍干燥。5. 如權利要求4所述的蛋白提取和分離純化方法，其特征在于，所述蛋白提取和分離純 化方法的超濾裝置壓力為0.15MPa，0.9生理鹽水稀釋倍數為10倍，攪拌速率為125r/min， 此時膜通量值為39.80，pH為7。6. 如權利要求1所述的蛋白提取和分離純化方法，其特征在于，所述雞蛋免疫球蛋白提 取純化方法包括： 選取新鮮雞蛋，采用蛋清蛋黃分離器，分離得到蛋黃，用蒸餾水將蛋黃洗凈，置于濾紙 上吸干，刺破蛋黃膜，收集蛋黃液，以體積百分比計，用蒸餾水對蛋黃進行不同倍數的稀釋8 倍攪拌均勻，調節不同pH值5.0~5.6，4°C靜置，5000 X冷凍離心30min后，得澄清上清液含 IgY水溶性組分WSF; 向所得的WSF中加入不同質量分數的PEG6000,磁力攪拌器攪拌30min，22000Xg冷凍離 心，收集沉淀； 透析，收集沉淀加入蒸餾水，攪拌，裝入透析袋，截留分子量為8000-14000KD中，4 °C透 析除去部分殘留PEG6000,冷凍干燥即得粗IgY組分； 離子交換色譜法純化IgY，用Na2HP〇4_NaH2P〇4緩沖液平衡，緩沖液離子強度上樣平衡、恒 流洗脫，洗脫流出液按每管5ml/3min自動收集;將層析所收集的組分裝入透析袋截留分子 量為8000-14000KD，置于蒸餾水中，4°C透析除鹽。
【文檔編號】C07K1/30GK105949300SQ201610344942
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月23日
【發明人】楊濤, 劉巖, 都韌寧, 于寒松
【申請人】吉林厚德食品有限公司