一種貽貝粘蛋白的提取方法
【專利摘要】本發明提供了一種貽貝粘蛋白的提取方法，在提取時加入殼聚糖原料，將殼聚糖和貽貝粘蛋白同時提取出來并混合，殼聚糖和貽貝粘蛋白能夠起到協同作用，極大減少了生產步驟，并提高了成品的效用。
【專利說明】
一種貽貝粘蛋白的提取方法
技術領域
[0001]本發明屬于蛋白質提取方法技術領域，具體涉及一種使用堿化和醚化法提取貽貝粘蛋白的方法。
【背景技術】
[0002]貽貝粘蛋白(Mussel adhesive p r o t e i η，MAP )，也叫貽貝足絲蛋白(Mytilusedulis foot protein，Mefp)，來自海洋貝類貽貝(Mytilus edulis)它有在近海耐受波浪影響的能力，貽貝在特殊腺體內生成和儲存一種蛋白膠，通過足絲釋放到巖石一類的固體表面上，形成抗水的結合，從而將自己固定。在玻璃上的研究顯示，蛋白膠形成了斑，從斑延伸開，有很強的抗張強度，而斑內物質包含了貽貝粘蛋白MAP。
[0003]貽貝粘蛋白含有L-3，4_二羥基苯丙氨酸(L-DOPA)，它由酪氨酸酶對酪氨酸殘基的作用形成。L-DOPA殘基由于氧化反應而相互交聯，交聯反應導致了貽貝和特殊表面纖維內強而持久的膠接。貽貝粘蛋白粘附對人沒有毒性和免疫原性，結合能力和壽命不受水的影響，作為醫用手術尤其是眼科手術膠已經引起注意。
[0004]貽貝粘蛋白具有促進細胞貼壁爬行、促進創面愈合、抑制瘙癢、廣譜粘接、形成抗水保護膜等作用。可廣泛用于表面化學、生物醫學、海洋工程、日化用品等領域。
[0005]貽貝粘蛋白一般采用工業色譜純化，獲得高純度的單一蛋白質，但是，目前使用的色譜純化的方法，具有設備材料昂貴，成本高的問題。
【發明內容】
[0006]為了解決現有技術存在的上述問題，本發明提供了一種貽貝粘蛋白的提取方法。所述提取方法利用蛋白質的物理化學性質，以非色譜的方法進行純化，克服色譜方法反應生成貽貝粘蛋白設備和材料成本高的問題，簡化了工藝，降低了貽貝粘蛋白提取的成本。另夕卜，在提取時加入殼聚糖原料，將殼聚糖和貽貝粘蛋白同時提取出來并混合，殼聚糖和貽貝粘蛋白能夠起到協同作用，極大減少了生產步驟，并提高了成品的效用。
[0007]本發明所采用的技術方案為:一種貽貝粘蛋白的提取方法，包括以下步驟:
[0008]A、以高氯酸或乙酸為提取劑，將100質量份的貽貝足絲和30-50質量份的殼聚糖原料加入300-1000體積份的提取劑中，浸泡后在提取劑中將貽貝足絲和殼聚糖原料打碎，并攪拌均勻，得到混合物I;
[0009]B、離心或過濾所述混合物I，取上清液或濾液作為提取液；
[0010]C、使用NaOH溶液將所述提取液堿化；
[0011 ] D、離心堿化后的提取液，收集沉淀，用乙酸將沉淀溶液溶解，得到溶解液；
[0012]E、將氯乙酸溶液加入溶解液中發生醚化反應后，使用透析袋截留分子量大于12000的物質，即得貽貝粘蛋白。
[0013]所述提取方法利用蛋白質的物理化學性質，以非色譜的方法進行純化，簡化了工藝，降低了貽貝粘蛋白提取的成本。另外，在提取時加入殼聚糖原料，將殼聚糖和貽貝粘蛋白同時提取出來并混合，殼聚糖和貽貝粘蛋白能夠起到協同作用，極大減少了生產步驟，并提高了成品的效用。
[0014]本發明中，所述殼聚糖原料為蝦殼、蟹殼等常見的用來提取殼聚糖的物質。
[0015]所述貽貝粘蛋白主要用來創面的愈合，而殼聚糖具有消炎殺菌的作用，二者的作用協同，得到更好的效用。
[0016]優選地，所述提取方法，包括以下步驟:
[0017]A、以0.5-2.5%的高氯酸或1-10%的乙酸為提取劑，將100質量份的貽貝足絲和30-50質量份的殼聚糖原料加入300-1000體積份的提取劑中，浸泡后在提取劑中將貽貝足絲和殼聚糖原料打碎，并攪拌均勻，得到混合物I;
[0018]B、離心或過濾所述混合物I，取上清液或濾液作為提取液；
[0019]C、使用6-12mo VL的NaOH溶液將所述提取液堿化;所述NaOH溶液的體積為所述提取液體積的1-6倍；
[0020]D、離心堿化后的提取液，收集沉淀，用1-3%的乙酸溶液將沉淀溶解，得到溶解液；
[0021]E、將0.5-3%的氯乙酸溶液加入溶解液中發生醚化反應后，使用透析袋截留分子量大于12000的物質，即得貽貝粘蛋白。
[0022]作為所述技術方案的進一步細化，步驟A中，以0.5-2.5%的高氯酸或1-10%的乙酸為提取劑，將100質量份的冷凍的貽貝足絲和30-50質量份的殼聚糖原料加入300-1000體積份的提取劑中，在10_20°C下浸泡5-15min后，在提取劑中將貽貝足絲和殼聚糖原料打碎，并攪拌均勻，得到混合物I。
[0023]所述貽貝足絲和殼聚糖原料均為冷凍后使用，便于打碎處理。
[0024]步驟B中，離心操作為:10000-16000r/min的轉速下離心30_50min;過濾所用的濾膜為孔徑45μπι濾膜。
[0025]步驟C中，使用6-12moVL的NaOH溶液在15-25°C下將所述提取液堿化l_5h;所述NaOH溶液的體積為所述提取液體積的2-6倍。
[0026]步驟D中，在4°C、10000-15000rpm下，將堿化后的提取液離心3-10min，收集沉淀，用1-3%的乙酸溶液將沉淀溶解后，重復一次上述離心和溶解操作，合并乙酸溶液得到溶解液。
[0027]步驟E中，在4°C下，將0.5-3%的氯乙酸溶液加入溶解液中發生醚化反應4-10h后，使用透析袋截留分子量大于12000的物質，即得貽貝粘蛋白，并于4°C下保存。
[0028]優選地，在步驟E之后，還包括通過分子量對貽貝粘蛋白鑒定的步驟:采用12-20%的十二烷基磺酸鈉一聚丙烷酰胺凝膠電泳，硝酸銀染色，10-25°C染色2-4h，以高分子量標準蛋白做標記，確認目標蛋白質分子量為130KD。
[0029]KD為千道爾頓的縮寫。
[0030]或者，在步驟E之后，還包括使用異性染色對貽貝粘蛋白的鑒定步驟:采用12-20%的乙酸一尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳，染色液采用pH為10的四氮唑藍一氨基乙酸溶液，10-25°C染色I _3h，貽貝粘蛋白特異性顯色。
[0031]再或者，在步驟E之后，還包括使用膠色譜柱分析貽貝粘蛋白純度的步驟:用CS反相鍵合相硅酸色譜柱分析貽貝粘蛋白的純度，以乙腈一水為流動相等度洗脫，280min檢測。
[0032]需要說明的是，本發明中的重量份和體積份，只是為了表明各物料的比例關系，并不具體表示某個數量值，在本發明中，所述重量份和體積份有如下對應關系:當I重量份為Ig時，I體積份為ImL。
[0033]本發明的有益效果為:
[0034]1、本發明提供了一種貽貝粘蛋白的提取方法，在提取時加入殼聚糖原料，將殼聚糖和貽貝粘蛋白同時提取出來并混合，殼聚糖和貽貝粘蛋白能夠起到協同作用，極大減少了生產步驟，并提高了成品的效用。
[0035]2、所述提取方法，使用NaOH溶液和氯乙酸溶液作為提取試劑，通過堿化和醚化反應，而非傳統的色譜的方法進行純化，克服色譜方法反應生成貽貝粘蛋白設備和材料成本高的問題，簡化了工藝，降低了貽貝粘蛋白提取的成本。
【具體實施方式】
[0036]下面結合實施例，更具體地說明本發明的內容。應當理解，本發明的實施并不局限于下面的實施例，對本發明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發明保護范圍。
[0037]在本發明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，百分數為質量百分數;所有的設備和原料等均可從市場購得或是本行業常用的。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領域的常規方法。
[0038]實施例1
[0039]本發明提供了一種貽貝粘蛋白的提取方法，包括以下步驟:
[0040]A、以2.5%的高氯酸為提取劑，將10g的冷凍的貽貝足絲和30g的殼聚糖原料加入100mL的提取劑中，在10 °C下浸泡1min后，在提取劑中將貽貝足絲和殼聚糖原料打碎，并攪拌均勻，得到混合物I;
[0041 ] B、離心所述混合物I，離心操作為:10000r/min的轉速下離心50min，取上清液作為提取液；
[0042]C、使用12mo VL的NaOH溶液在20°C下將所述提取液堿化4h;所述NaOH溶液的體積為所述提取液體積的5倍；
[0043]D、在4 °C、1000rpm下，將堿化后的提取液離心1min，收集沉淀，用2 %的乙酸溶液將沉淀溶解后，得到溶解液；
[0044]E、在4°C下，將1.5 %的氯乙酸溶液加入溶解液中發生醚化反應4h后，使用透析袋截留分子量大于12000的物質，即得貽貝粘蛋白，并于4°C下保存。
[0045]在步驟E之后，還包括通過分子量對貽貝粘蛋白鑒定的步驟:采用20%的十二烷基磺酸鈉一聚丙烷酰胺凝膠電泳，硝酸銀染色，10°C染色4h，以高分子量標準蛋白做標記，確認目標蛋白質分子量為130KD。
[0046]在步驟E之后，還包括使用異性染色對貽貝粘蛋白的鑒定步驟:采用12%的乙酸一尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳，染色液采用PH為10的四氮唑藍一氨基乙酸溶液，25°C染色lh，貽貝粘蛋白特異性顯色。
[0047]在步驟E之后，還包括使用膠色譜柱分析貽貝粘蛋白純度的步驟:用CS反相鍵合相硅酸色譜柱分析貽貝粘蛋白的純度，以乙腈一水為流動相等度洗脫，280min檢測。
[0048]實施例2
[0049]A、以0.5%的高氯酸為提取劑，將10g的冷凍的貽貝足絲和30g的殼聚糖原料加入100mL的提取劑中，在10 °C下浸泡15min后，在提取劑中將貽貝足絲和殼聚糖原料打碎，并攪拌均勻，得到混合物I;
[°°50] B、離心所述混合物I，離心操作為:16000r/min的轉速下離心30min，取上清液作為提取液；
[0051 ] C、使用6mol/L的NaOH溶液在25 °C下將所述提取液堿化Ih;所述NaOH溶液的體積為所述提取液體積的6倍；
[0052]0、在41:、1000rpm下，將堿化后的提取液離心1min，收集沉淀，用I %的乙酸溶液將沉淀溶解后，重復一次上述離心和溶解操作，合并乙酸溶液得到溶解液；
[0053]E、在4°C下，將3 %的氯乙酸溶液加入溶解液中發生醚化反應4h后，使用透析袋截留分子量大于12000的物質，即得貽貝粘蛋白，并于4°C下保存。
[0054]在步驟E之后，還包括通過分子量對貽貝粘蛋白鑒定的步驟:采用20%的十二烷基磺酸鈉一聚丙烷酰胺凝膠電泳，硝酸銀染色，10°c染色4h，以高分子量標準蛋白做標記，確認目標蛋白質分子量為130KD。
[0055]在步驟E之后，還包括使用異性染色對貽貝粘蛋白的鑒定步驟:采用12%的乙酸一尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳，染色液采用PH為10的四氮唑藍一氨基乙酸溶液，25°C染色lh，貽貝粘蛋白特異性顯色。
[0056]在步驟E之后，還包括使用膠色譜柱分析貽貝粘蛋白純度的步驟:用CS反相鍵合相硅酸色譜柱分析貽貝粘蛋白的純度，以乙腈一水為流動相等度洗脫，280min檢測。
[0057]實施例3
[0058]A、以I %的乙酸為提取劑，將1 O g的冷凍的貽貝足絲和5 O g的殼聚糖原料加入300mL的提取劑中，在20°C下浸泡5min后，在提取劑中將貽貝足絲和殼聚糖原料打碎，并攪拌均勻，得到混合物I;
[0059]B、過濾所述混合物I，過濾所用的濾膜為45μπι濾膜，取濾液作為提取液；
[0060]C、使用12mo VL的NaOH溶液在15°C下將所述提取液堿化5h;所述NaOH溶液的體積為所述提取液體積的2倍；
[0061 ] 0、在41:、15000rpm下，將堿化后的提取液離心3min，收集沉淀，用3%的乙酸溶液將沉淀溶解后，重復一次上述離心和溶解操作，合并乙酸溶液得到溶解液；
[0062]E、在4 °C下，將0.5 %的氯乙酸溶液加入溶解液中發生醚化反應1h后，使用透析袋截留分子量大于12000的物質，即得貽貝粘蛋白，并于4°C下保存。
[0063]在步驟E之后，還包括通過分子量對貽貝粘蛋白鑒定的步驟:采用12%的十二烷基磺酸鈉一聚丙烷酰胺凝膠電泳，硝酸銀染色，25°C染色2h，以高分子量標準蛋白做標記，確認目標蛋白質分子量為130KD。
[0064]在步驟E之后，還包括使用異性染色對貽貝粘蛋白的鑒定步驟:采用20%的乙酸一尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳，染色液采用PH為10的四氮唑藍一氨基乙酸溶液，10°C染色3h，貽貝粘蛋白特異性顯色。
[0065]在步驟E之后，還包括使用膠色譜柱分析貽貝粘蛋白純度的步驟:用CS反相鍵合相硅酸色譜柱分析貽貝粘蛋白的純度，以乙腈一水為流動相等度洗脫，280min檢測。
[0066]實施例4
[0067]A、以10%的乙酸為提取劑，將10g的冷凍的貽貝足絲和40g的殼聚糖原料加入650mL的提取劑中，在15°C下浸泡1min后，在提取劑中將貽貝足絲和殼聚糖原料打碎，并攪拌均勻，得到混合物I;
[0068]B、過濾所述混合物I，過濾所用的濾膜為45μπι濾膜，取濾液作為提取液；
[0069]C、使用9mol/L的NaOH溶液在20 °C下將所述提取液堿化3h;所述NaOH溶液的體積為所述提取液體積的4倍；
[0070]D、在4°C、12500rpm下，將堿化后的提取液離心6min，收集沉淀，用2%的乙酸溶液將沉淀溶解后，重復一次上述離心和溶解操作，合并乙酸溶液得到溶解液；
[0071 ] E、在4 °C下，將2 %的氯乙酸溶液加入溶解液中發生醚化反應7h后，使用透析袋截留分子量大于12000的物質，即得貽貝粘蛋白，并于4°C下保存。
[0072]在步驟E之后，還包括使用分子量對貽貝粘蛋白鑒定的步驟:采用16%的十二烷基磺酸鈉一聚丙烷酰胺凝膠電泳，硝酸銀染色，18°C染色3h，以高分子量標準蛋白做標記，確認目標蛋白質分子量為130KD。
[0073]在步驟E之后，還包括使用異性染色對貽貝粘蛋白的鑒定步驟:采用16%的乙酸一尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳，染色液采用PH為10的四氮唑藍一氨基乙酸溶液，17°C染色2h，貽貝粘蛋白特異性顯色。
[0074]在步驟E之后，還包括使用膠色譜柱分析貽貝粘蛋白純度的步驟:用CS反相鍵合相硅酸色譜柱分析貽貝粘蛋白的純度，以乙腈一水為流動相等度洗脫，280min檢測。
[0075]最后所應說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，所應理解的是，以上所述僅為本發明的【具體實施方式】而已，并不用于限定本發明的保護范圍，凡在本發明的精神和原則之內，所做的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1.一種貽貝粘蛋白的提取方法，其特征在于，包括以下步驟: A、以高氯酸或乙酸為提取劑，將100質量份的貽貝足絲和30-50質量份的殼聚糖原料加入300-1000體積份的提取劑中，浸泡后在提取劑中將貽貝足絲和殼聚糖原料打碎，并攪拌均勻，得到混合物I; B、離心或過濾所述混合物I，取上清液或濾液作為提取液； C、使用NaOH溶液將所述提取液堿化； D、離心堿化后的提取液，收集沉淀，用乙酸溶液將沉淀溶解，得到溶解液； E、將氯乙酸溶液加入溶解液中發生醚化反應后，使用透析袋截留分子量大于12000的物質，即得貽貝粘蛋白。2.根據權利要求1所述的提取方法，其特征在于，包括以下步驟: A、以0.5-2.5%的高氯酸或1-10%的乙酸為提取劑，將100質量份的貽貝足絲和30-50質量份的殼聚糖原料加入300-1000體積份的提取劑中，浸泡后在提取劑中將貽貝足絲和殼聚糖原料打碎，并攪拌均勻，得到混合物I; B、離心或過濾所述混合物I，取上清液或濾液作為提取液； C、使用6-12moVL的NaOH溶液將所述提取液堿化;所述NaOH溶液的體積為所述提取液體積的I _6倍； D、離心堿化后的提取液，收集沉淀，用1-3%的乙酸溶液將沉淀溶解，得到溶解液； E、將0.5-3%的氯乙酸溶液加入溶解液中發生醚化反應后，使用透析袋截留分子量大于12000的物質，即得貽貝粘蛋白。3.根據權利要求2所述的提取方法，其特征在于，步驟A中，以0.5-2.5 %的高氯酸或I_10%的乙酸為提取劑，將100質量份的冷凍的貽貝足絲和30-50質量份的殼聚糖原料加入300-1000體積份的提取劑中，在10-20°C下浸泡5-15min后，在提取劑中將貽貝足絲和殼聚糖原料打碎，并攪拌均勻，得到混合物I。4.根據權利要求2所述的提取方法，其特征在于，步驟B中，離心操作為:10000-16000r/min的轉速下離心30-50min;過濾所用的濾膜為孔徑45μηι濾膜。5.根據權利要求2所述的提取方法，其特征在于，步驟C中，使用6-12moI/L的NaOH溶液在15-25°C下將所述提取液堿化l_5h;所述NaOH溶液的體積為所述提取液體積的2-6倍。6.根據權利要求2所述的提取方法，其特征在于，步驟D中，在4°C、10000-15000rpm下，將堿化后的提取液離心3-10min，收集沉淀，用1_3 %的乙酸溶液將沉淀溶解后，重復一次上述離心和溶解操作，合并乙酸溶液得到溶解液。7.根據權利要求2所述的提取方法，其特征在于，步驟E中，在4°C下，將0.5-3%的氯乙酸溶液加入溶解液中發生醚化反應4-10h后，使用透析袋截留分子量大于12000的物質，SP得貽貝粘蛋白，并于4°C下保存。8.根據權利要求1-7任一所述的提取方法，其特征在于，在步驟E之后，還包括通過分子量對貽貝粘蛋白鑒定的步驟:采用12-20%的十二烷基磺酸鈉一聚丙烷酰胺凝膠電泳，硝酸銀染色，10-25°C染色2-4h，以高分子量標準蛋白做標記，確認目標蛋白質分子量為130KD。9.根據權利要求1-7任一所述的提取方法，其特征在于，在步驟E之后，還包括使用異性染色對貽貝粘蛋白的鑒定步驟:采用12-20%的乙酸一尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳，染色液采用pH為1的四氮唑藍一氨基乙酸溶液，10-25 0C染色1-3h，貽貝粘蛋白特異性顯色。10.根據權利要求1-7任一所述的提取方法，其特征在于，在步驟E之后，還包括使用膠色譜柱分析貽貝粘蛋白純度的步驟:用CS反相鍵合相硅酸色譜柱分析貽貝粘蛋白的純度，以乙腈一水為流動相等度洗脫，280min檢測。
【文檔編號】C07K14/435GK105949299SQ201610407209
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月8日
【發明人】楊子中
【申請人】楊子中