醋酸阿托西班雜質、制備及檢測方法
【專利摘要】本發明涉及醋酸阿托西班雜質、制備及檢測方法。雜質為雜質A、雜質B、雜質C、雜質D或雜質E，序列如下：雜質A：c[Mpa(S＝O)-D-Tyr(Et)-Ile-Thr-Asn-Cys]-Pro-Orn-Gly-NH2、雜質B：c[Mpa-D-Tyr(Et)-Ile-Thr-Asn-Cys(S＝O)]-Pro-Orn-Gly-NN2、雜質C：c[Mpa-D-Tyr(Et)-Ile-Thr-D-Asn-Cys]-Pro-Orn-Gly-NH2、雜質D：c[Mpa-D-Tyr(Et)-Ile-Thr-Asp-Cys]-Pro-Orn-Gly-NH2雜質E：c[Mpa-D-Tyr(Et)-Ile-Thr-Asn-Cys]-Pro-Orn-Gly-OH。所述雜質A、雜質B、雜質C、雜質D或雜質E可作為醋酸阿托西班合成過程中產生的工藝雜質或者降解雜質的可靠對照，可用于醋酸阿托西班合成中的雜質定性和定量的分析，為進一步控制醋酸阿托西班的質量開通了道路。
【專利說明】
醋酸阿托西班雜質、制備及檢測方法
技術領域
[0001] 本發明涉及一種活性多肽雜質及其制備方法，尤其涉及醋酸阿托西班雜質、制備 及檢測方法。
【背景技術】
[0002] 阿托西班，英文名:Atosiban，阿托西班是一個九肽，肽鏈中包含三個非天然氨基 酸D-Tyr(Et)，Mpa和Orn及一對在Mpa與Cys之間成環的二硫鍵，其結構式為：
[0003 ] c[Mpa-D-Tyr(Et)-Ile-Thr-Asn-Cys]-Pr〇-〇rn-Gly-NH2 〇
[0004] 阿托西班是一種可以直接與催產素競爭催產素受體，抑制催產素和催產素受體結 合，從而直接抑制催產素作用于子宮，抑制子宮收縮;也可以抑制磷脂酰肌醇的水解作用， 阻斷第二信使的生成以及Ca 2+的活動，從而間接抑制子宮對催產素的反應，使子宮收縮得到 抑制。
[0005] 阿托西班在藥品中以醋酸鹽的形式存在，通用名為醋酸阿托西班。醋酸阿托西班 是一種合成多肽，是子宮催產素受體的競爭性拮抗劑，在早產治療中已發展成為一種新的 宮縮抑制劑。可以延遲分娩，使母親有足夠的時間服用類固醇促使胎兒肺成熟。醋酸阿托西 班是催產素拮抗劑，代表一種新的抗分娩藥。
[0006] 目前，關于醋酸阿托西班的合成，包括固相合成和液相合成，技術上均較為成熟， 但在合成過程中，由于合成步驟較多，加入的原料數量較多，造成產物雜質種類比較多，已 知的雜質包括 ：[Gly9-0H]_阿托西班、[Asp5-0H]-阿托西班、[D-Asn 5]-阿托西班等，產生的 未知工藝雜質和降解雜質還有很多，值得仔細研究。而且多肽合成過程中產生的許多工藝 雜質和降解雜質，與主成分結構極為相似，這些雜質如果控制不好，有可能產生嚴重的毒副 作用。
[0007] 雜質研究是藥物質量研究的一項重要內容，是藥物質量保證的關鍵因素之一。因 此為了提高臨床用藥安全，對合成過程中產生的雜質和降解雜質進行了詳細的研究，在研 究中通過分析發現了新的雜質。因此，確定醋酸阿托西班所含的新的雜質結構并合成之，對 于醋酸阿托西班雜質的相關研究意義重大，是提高醋酸阿托西班藥品質量急需的問題，也 是解決醋酸阿托西班合成過程中產生的工藝雜質或者降解雜質的可靠對照。它可以用于醋 酸阿托西班合成中的雜質定型和定量的分析，從而可以提高醋酸阿托西班的質量標準，有 效地保障和控制醋酸阿托西班的質量，對醋酸阿托西班原料藥的質量研究以及制劑研究有 重要應用價值，為安全用藥提供重要的指導意義。
【發明內容】
[0008] 本發明所要解決的技術問題是提供一種醋酸阿托西班雜質及其制備方法，該方法 簡單，原料易得，產品容易純化，純度較高，能作為雜質檢測中的對照品使用，為進一步控制 醋酸阿托西班的質量開通了道路。
[0009] 為實現本發明的目的，本發明采用如下技術方案：
[0010] 醋酸阿托西班雜質，其特征在于，所述的醋酸阿托西班雜質為雜質A、雜質B、雜質 C、雜質D或雜質E，其結構序列分別為：
[0011] 雜質A: c[Mpa(S = 0)-D-Tyr(Et)-Ile-Thr-Asn-Cys]-P;r〇-0;rn-Gly-NH2;
[0012] 雜質B: c[Mpa-D-Tyr(Et)-Ile-Thr-Asn-Cys(S = 0) ]-Pr〇-〇rn-Gly-NN2;
[0013] 雜質C: c[Mpa-D-Tyr(Et)-Ile-Thr-D-Asn-Cys]-P;r〇-〇;rn-Gly-NH2;
[0014] 雜質D: c[Mpa-D-Tyr(Et)-Ile-Thr-Asp-Cys]-P;r〇-〇;rn-Gly-NH2;
[0015] 雜質E: c[Mpa-D-Tyr(Et)-Ile-Thr-Asn-Cys]-P;r〇-〇;rn-Gly-〇H〇 [0016]本發明還提供上述雜質A、雜質B、雜質C、雜質D或雜質E的制備方法。
[0017] 具體地說，本發明所述的醋酸阿托西班雜質A或雜質B的制備方法包括如下步驟：
[0018] 1)將醋酸阿托西班原料藥采用雙氧水氧化，得到氧化后的溶液；
[0019] 2)將氧化后的溶液過濾后采用反相C18柱進行分離純化，分離純化時，每次上樣量 為10ml，以乙腈為流動相A，0.05 %TFA/H20為流動相B，檢測波長為220nm，15 %流動相A保持 lOmin，在lOmin到50min內流動相A變為45 %，分別收集36_39min組分或40_43min組分，再分 別經濃縮、凍干后得到所述的醋酸阿托西班雜質A和雜質B。
[0020] 上述制備方法中，步驟1)中所述的醋酸阿托西班原料藥與雙氧水的質量體積比為 lg: 5~15ml，優選lg: 10ml;所述的氧化時間為1~3h，優選2h;所述的雙氧水為質量百分比 為30 %的雙氧水;所述的醋酸阿托西班原料藥在采用雙氧水氧化前先用高純水超聲溶解； 步驟2)中所述的濃縮為在35~45 °C、優選在40 °C下濃縮。
[0021] 采用本發明的方法制得的醋酸阿托西班雜質A和雜質B的純度達99.9%，可作為醋 酸阿托西班合成過程中產生的工藝雜質或者降解雜質的可靠對照，可用于醋酸阿托西班合 成中的雜質定性和定量的分析，為進一步控制醋酸阿托西班的質量開通了道路。
[0022] 本發明所述的醋酸阿托西班雜質C的制備方法包括如下步驟：
[0023] 1)以Fmoc-Gly-Rink Amide AM樹脂為起始物料，溶脹后脫除Fmoc保護，得到Gly- Rink Amide AM樹脂；
[0024] 2)以Gly-Rink Amide AM樹脂為載體，以DIC/HOBT為縮合試劑，按照Fmoc/tbu固相 多肽合成的方法在Gly-Rink Amide AM樹脂上偶聯Fmoc-〇rn(Boc)-〇H;
[0025] 3)再按照上述方法依次偶聯?111〇(3-?1'〇-〇!1、？1]1〇(3-〇5^(1'1'1:)-〇!1、？1]1〇(3-〇-4811(1'1'1:)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-〇H、Fmoc-Ile-〇H、Fmoc-D-Tyr(Et)-〇H、Mpa(T;rt)-〇H;
[0026] 4)用碘進行固相環化；
[0027] 5)用裂解試劑進行切割得醋酸阿托西班雜質C粗肽，用乙醚沉淀粗肽；
[0028] 6)用反相高效液相色譜法純化分離，再經濃縮、凍干后即得所述的醋酸阿托西班 雜質C。
[0029] 進一步，步驟1)中Fmoc-Gly-Rink Amide AM樹脂的取代度為0.3~1 .Ommol/g。
[0030] 進一步，所述的步驟2)為:取Fmoc-〇rn(Boc)-〇H和HOBt，加 DMF于0°C ±5°C下冷卻， 攪拌溶解，加 DIC活化;將活化后的氨基酸加入步驟1)所得的樹脂中30°C±5°C通氮氣攪拌 反應至茚三酮檢測法檢測樹脂顆粒為無色透明時，抽干反應液，用DMF洗滌，用哌啶/DMF脫 Fmoc保護，再依次用DMF、DCM洗滌，抽干。
[0031] 進一步，步驟5)中所述的裂解試劑是按：三氟乙酸：三異丙基硅烷：H20 = 95 % : 2.5 % : 2.5 %的體積比配制而成;所述的裂解試劑的用量為每克樹脂用6~10ml裂解試劑； 所述的裂解反應為在25°C±5°C下裂解反應1~3h，優選2h。
[0032]進一步，步驟6)中用反相高效液相色譜法純化分離時，采用梯度洗脫，以乙腈為流 動相4,0.05%1?4/出0為流動相8，檢測波長為22011111，15%流動相4保持101^11，在101^11到 50min內流動相A變為45%，收集33~39min組分。
[0033]采用本發明的方法制得的醋酸阿托西班雜質C的純度達99.9%，可作為醋酸阿托 西班合成過程中產生的工藝雜質或者降解雜質的可靠對照，可用于醋酸阿托西班合成中的 雜質定性和定量的分析，為進一步控制醋酸阿托西班的質量開通了道路。
[0034]本發明所述的醋酸阿托西班雜質D的制備方法包括如下步驟：
[0035] 1)以Fmoc-Gly-Rink Amide AM樹脂為起始物料，溶脹后脫除Fmoc保護，得到Gly- Rink Amide AM樹脂；
[0036] 2)以Gly-Rink Amide AM樹脂為載體，以DIC/HOBT為縮合試劑，按照Fmoc/tbu固相 多肽合成的方法在Gly-Rink Amide AM樹脂上偶聯Fmoc-〇rn(Boc)-〇H;
[0037] 3)再按照上述方法依次偶聯?111〇(3-?1'〇-0!1、？1]1〇(3-05^(1'1'1:)-0!1、？1]1〇(3-48口（01:1311)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-〇H、Fmoc-Ile-〇H、Fmoc-D-Tyr(Et)-〇H、Mpa(T;rt)-〇H;
[0038] 4)用碘進行固相環化；
[0039] 5)用裂解試劑進行切割得醋酸阿托西班雜質D粗肽，用乙醚沉淀粗肽；
[0040] 6)用反相高效液相色譜法純化分離，再經濃縮、凍干后即得所述的醋酸阿托西班 雜質D。
[0041] 進一步，步驟1)中Fmoc-Gly-Rink Amide AM樹脂的取代度為0.3~1 · lmmol/g。
[0042] 進一步，所述的步驟2)為:取Fmoc-〇rn (Boc) -OH和HOBt，加 DMF于0 °C ± 5 °C下冷卻， 攪拌溶解，加 DIC活化;將活化后的氨基酸加入步驟1)所得的樹脂中30°C±5°C通氮氣攪拌 反應至茚三酮檢測法檢測樹脂顆粒為無色透明時，抽干反應液，用DMF洗滌，用哌啶/DMF脫 Fmoc保護，再依次用DMF、DCM洗滌，抽干。
[0043] 進一步，步驟5)中所述的裂解試劑是按：三氟乙酸：三異丙基硅烷：H20 = 95 % : 2.5 % : 2.5 %的體積比配制而成;所述的裂解試劑的用量為每克樹脂用6~10ml裂解試劑； 所述的裂解反應為在25°C±5°C下裂解反應1~3h，優選2h。
[0044] 進一步，步驟6)中用反相高效液相色譜法純化分離時，采用梯度洗脫，以乙腈為流 動相4,0.05%1?4/出0為流動相8，檢測波長為22011111，15%流動相4保持101^11，在101^11到 50min內流動相A變為45%，收集33~39min組分。
[0045] 采用本發明的方法制得的醋酸阿托西班雜質D的純度達99.8%，可作為醋酸阿托 西班合成過程中產生的工藝雜質或者降解雜質的可靠對照，可用于醋酸阿托西班合成中的 雜質定性和定量的分析，為進一步控制醋酸阿托西班的質量開通了道路。
[0046] 本發明所述的醋酸阿托西班雜質E的制備方法包括如下步驟：
[0047] 1)以Wang樹脂為起始物料，溶脹洗滌后，以DIC/H0BT為縮合試劑，將Fmoc-Gly-OH 的羧基與樹脂的羥基以酯鍵相連，得到Fmoc-Gly-Wang樹脂；
[0048] 2)以Fmoc-Gly-Wang樹脂為載體，以DIC/H0BT為縮合試劑，按照Fmoc/tbu固相多肽 合成的方法在Fmoc-Gly-Wang樹脂上偶聯Fmoc-〇rn(Boc)-〇H;
[0049] 3)再按照上述方法依次偶聯?111〇(3-?1'〇-〇!1、？111〇(3-〇5^(1'1'1:)-〇!1、？111〇(3-4811(1'1'1:)- OH、Fmoc-Thr(tBu)-〇H、Fmoc-Ile-〇H、Fmoc-D-Tyr(Et)-〇H、Mpa(T;rt)-〇H;
[0050] 4)用碘進行固相環化；
[0051 ] 5)用裂解試劑進行切割得醋酸阿托西班雜質E粗肽，用乙醚沉淀粗肽；
[0052] 6)用反相高效液相色譜法純化分離，再經濃縮、凍干后即得所述的醋酸阿托西班 雜質E。
[0053] 進一步，步驟1)中所述的Wang樹脂的取代度為0.3~1. lmmol/g。
[0054] 進一步，所述的步驟2)為:取Fmoc-Orn (Boc) -OH和HOBt，加 DMF于0 °C ± 5 °C下冷卻， 攪拌溶解，加 DIC活化;將活化后的氨基酸加入步驟1)所得的樹脂中30°C±5°C通氮氣攪拌 反應至茚三酮檢測法檢測樹脂顆粒為無色透明時，抽干反應液，用DMF洗滌，用哌啶/DMF脫 Fmoc保護，再依次用DMF、DCM洗滌，抽干。
[0055] 進一步，步驟5)中所述的裂解試劑是按：三氟乙酸：三異丙基硅烷：H20 = 95 % : 2.5 % : 2.5 %的體積比配制而成;所述的裂解試劑的用量為每克樹脂用6~10ml裂解試劑； 所述的裂解反應為在25°C±5°C下裂解反應1~3h，優選2h。
[0056]進一步，步驟6)中用反相高效液相色譜法純化分離時，采用梯度洗脫，以乙腈為流 動相4,0.05%1?4/出0為流動相8，檢測波長為22011111，15%流動相4保持101^11，在101^11到 50min內流動相A變為45%，收集33~39min組分。
[0057]采用本發明的方法制得的醋酸阿托西班雜質E的純度達99.7%，可作為醋酸阿托 西班合成過程中產生的工藝雜質或者降解雜質的可靠對照，可用于醋酸阿托西班合成中的 雜質定性和定量的分析，為進一步控制醋酸阿托西班的質量開通了道路。
[0058] 本發明還提供所述的醋酸阿托西班雜質的序列檢測方法，所述的序列分析方法為 采用MS/MS測序。
[0059] 具體地說，所述的采用MS/MS測序為采用傅里葉變換離子回旋共振質譜分別對雜 質A、雜質B、雜質C、雜質D或雜質E進行一級質譜掃描，得到分子離子峰，然后對準分子離子 峰施加能量裂解，得到該分子離子峰的二級質譜碎片信息，通過分析軟件分析確定雜質的 序列結構。
[0060] 更具體地說，所述的雜質A、雜質B、雜質C、雜質D和雜質E的一級質譜分子離子峰分 別為 1010 · 44275、1010 · 43629、994 · 43356、995 · 42536 和995 · 42429。
[0061] 本發明還進一步提供所述的醋酸阿托西班雜質A、雜質B、雜質C、雜質D和/或雜質E 在醋酸阿托西班質量檢測中作為雜質對照品的應用。
[0062] 根據本發明的方法對原料藥中的雜質進行制備、分析和結構鑒定，可以為雜質的 毒理學研究和闡明不良反應發生機制提供基礎，同時也可以為工藝合成實驗條件的選擇提 供參考，有利于生產過程中藥品質量的控制。
[0063] 本發明所涉及到的英文縮寫具有以下含義：
[0064] Mpa:疏基丙酸 [0065] Tyr:酪氨酸 [0066] lie:異亮氨酸 [0067] Thr:蘇氨酸 [0068] Cys:半胱氨酸 [0069] Asn:天冬酰胺 [0070] Asp:天冬氨酸
[0071] D~Asn:D型-天冬醜胺
[0072] Pro:脯氨酸
[0073] Orn:鳥氨酸
[0074] Gly:甘氨酸
[0075] Trt:三苯甲基
[0076] Otbu:叔丁氧基
[0077] Et:乙基
[0078] Boc:叔丁基
[0079] Fmoc:荷甲氧羰基
[0080] H0BT:1-羥基苯并三氮唑
[0081 ] DIC:二異丙基碳二亞胺
[0082] TFA:三氟乙酸
[0083] TIS:三異丙基硅烷
[0084] DMF:N，N_二甲基甲酰胺
[0085] DCM:二氯甲烷
[0086] Rink Amide AM Resin:氨基甲酰胺樹脂
[0087] Wang Resin:王樹脂
[0088] 與現有技術相比，本發明具有如下優點：
[0089] 本發明確定了醋酸阿托西班所含的新的雜質A、雜質B、雜質C、雜質D和雜質E并合 成之，對于醋酸阿托西班雜質的相關研究意義重大，是提高醋酸阿托西班藥品質量急需的 問題，也是解決醋酸阿托西班合成過程中產生的工藝雜質或者降解雜質的可靠對照。它可 以用于醋酸阿托西班合成中的雜質定性和定量的分析，從而可以提高醋酸阿托西班的質量 標準，有效地保障和控制醋酸阿托西班的質量，對醋酸阿托西班原料藥的質量研究以及制 劑研究有重要應用價值，為安全用藥提供重要的指導意義。
【附圖說明】
[0090] 圖1為醋酸阿托西班雜質A的一級質譜分離圖；
[0091] 圖2為醋酸阿托西班雜質A的質譜測序圖；
[0092] 圖3為醋酸阿托西班雜質B的一級質譜分離圖；
[0093] 圖4為醋酸阿托西班雜質B的質譜測序圖；
[0094] 圖5為醋酸阿托西班雜質C的一級質譜分離圖；
[0095] 圖6為醋酸阿托西班雜質C的質譜測序圖；
[0096] 圖7為醋酸阿托西班雜質D的一級質譜分離圖；
[0097] 圖8為醋酸阿托西班雜質D的質譜測序圖；
[0098] 圖9為醋酸阿托西班雜質E的一級質譜分離圖；
[0099] 圖10為醋酸阿托西班雜質E的質譜測序圖。
【具體實施方式】
[0100]以下為本發明的【具體實施方式】，所述的實施例是為了進一步描述本發明，而不是 限制本發明。
[0101] 【實施例1】雜質A的制備
[0102] (1)稱取醋酸阿托西班成品2g，用80ml高純水超聲溶解，攪拌下加入30%的雙氧水 20ml，氧化反應2h，得到雜質A的溶液；
[0103] (2)將氧化后的溶液經過0.45um濾膜過濾，半制備型高效液相色譜儀純化，所用的 色譜柱為C 18填料，（1〇11111，21111111\25〇111111);每次上樣量為1〇1111(0.28)，以乙腈為流動相八， 0.05%了?六/!120為流動相8，檢測波長為220腦，15%流動相4保持101^11，在101^11到501^11內 流動相A變為45 %，收集36-39min組分，為雜質A組分，在40°C下濃縮去除乙腈，然后裝瓶凍 干，得到雜質A。雜質A用液相色譜法測定其純度為99.9%。
[0104] 【實施例2】雜質A的制備
[0105] (1)稱取醋酸阿托西班成品2g，用80ml高純水超聲溶解，攪拌下加入30%的雙氧水 l〇ml，氧化反應lh，得到雜質A的溶液；
[0106] (2)將氧化后的溶液經過0.45um濾膜過濾，半制備型高效液相色譜儀純化，所用的 色譜柱為C 18填料，（1〇11111，21111111\25〇111111);每次上樣量為1〇1111(0.28)，以乙腈為流動相八， 0.05%了?六/!120為流動相8，檢測波長為220腦，15%流動相4保持101^11，在101^11到501^11內 流動相A變為45 %，收集36-39min組分，為雜質A組分，在35°C下濃縮去除乙腈，然后裝瓶凍 干，得到雜質A。雜質A用液相色譜法測定其純度為99.8%。
[0107] 【實施例3】雜質A的制備
[0108] (1)稱取醋酸阿托西班成品2g，用80ml高純水超聲溶解，攪拌下加入30%的雙氧水 30ml，氧化反應3h，得到雜質A的溶液；
[0109] (2)將氧化后的溶液經過0.45um濾膜過濾，半制備型高效液相色譜儀純化，所用的 色譜柱為C 18填料，（1〇11111，21111111\25〇111111);每次上樣量為1〇1111(0.28)，以乙腈為流動相八， 0.05%了?六/!120為流動相8，檢測波長為220腦，15%流動相4保持101^11，在101^11到501^11內 流動相A變為45 %，收集36-39min組分，為雜質A組分，在45°C下濃縮去除乙腈，然后裝瓶凍 干，得到雜質A。雜質A用液相色譜法測定其純度為99.8%。
[0110] 【實施例4】雜質A的制備
[0111] (1)稱取醋酸阿托西班成品2g，用80ml高純水超聲溶解，攪拌下加入30 %的雙氧水 25ml，氧化反應2.5h，得到雜質A的溶液；
[0112] (2)將氧化后的溶液經過0.45um濾膜過濾，半制備型高效液相色譜儀純化，所用的 色譜柱為C 18填料，（1〇11111，21111111\25〇111111);每次上樣量為1〇1111(0.28)，以乙腈為流動相八， 0.05%了?六/!120為流動相8，檢測波長為220腦，15%流動相4保持101^11，在101^11到501^11內 流動相A變為45 %，收集36-39min組分，為雜質A組分，在38°C下濃縮去除乙腈，然后裝瓶凍 干，得到雜質A。雜質A用液相色譜法測定其純度為99.7%。
[0113] 【實施例5】雜質B的制備
[0114] (1)稱取醋酸阿托西班成品2g，用80ml高純水超聲溶解，攪拌下加入30%的雙氧水 20ml，氧化反應2h，得到雜質B的溶液；
[0115] (2)將氧化后的溶液經過0.45um濾膜過濾，半制備型高效液相色譜儀純化，所用的 色譜柱為C 18填料，（1〇11111，21111111\25〇111111);每次上樣量為1〇1111(0.28)，以乙腈為流動相八， 0.05%了?六/!120為流動相8，檢測波長為220腦，15%流動相4保持101^11，在101^11到501^11內 流動相A變為45 %，收集40-43min組分，為雜質B組分，在40°C下濃縮去除乙腈，然后裝瓶凍 干，得到雜質B。雜質B用液相色譜法測定其純度為99.9%。
[0116] 【實施例6】雜質B的制備
[0117] (1)稱取醋酸阿托西班成品2g，用80ml高純水超聲溶解，攪拌下加入30 %的雙氧水 l〇ml，氧化反應lh，得到雜質B的溶液；
[0118] (2)將氧化后的溶液經過0.45um濾膜過濾，半制備型高效液相色譜儀純化，所用的 色譜柱為C18填料，（1〇11111，21111111\25〇111111);每次上樣量為1〇1111(0.28)，以乙腈為流動相八， 0.05%了?六/!120為流動相8，檢測波長為220腦，15%流動相4保持101^11，在101^11到501^11內 流動相A變為45 %，收集40-43min組分，為雜質B組分，在35°C下濃縮去除乙腈，然后裝瓶凍 干，得到雜質B。雜質B用液相色譜法測定其純度為99.8%。
[0119] 【實施例7】雜質B的制備
[0120] (1)稱取醋酸阿托西班成品2g，用80ml高純水超聲溶解，攪拌下加入30%的雙氧水 30ml，氧化反應3h，得到雜質B的溶液；
[0121] (2)將氧化后的溶液經過0.45um濾膜過濾，半制備型高效液相色譜儀純化，所用的 色譜柱為C18填料，（1〇11111，21111111\25〇111111);每次上樣量為1〇1111(0.28)，以乙腈為流動相八， 0.05%了?六/!120為流動相8，檢測波長為220腦，15%流動相4保持101^11，在101^11到501^11內 流動相A變為45 %，收集40-43min組分，為雜質B組分，在45°C下濃縮去除乙腈，然后裝瓶凍 干，得到雜質B。雜質B用液相色譜法測定其純度為99.7%。
[0122] 【實施例8】雜質B的制備
[0123] (1)稱取醋酸阿托西班成品2g，用80ml高純水超聲溶解，攪拌下加入30%的雙氧水 22ml，氧化反應2.5h，得到雜質A的溶液；
[0124] (2)將氧化后的溶液經過0.45um濾膜過濾，半制備型高效液相色譜儀純化，所用的 色譜柱為C18填料，（1〇11111，21111111\25〇111111);每次上樣量為1〇1111(0.28)，以乙腈為流動相八， 0.05%了?六/!120為流動相8，檢測波長為220腦，15%流動相4保持101^11，在101^11到501^11內 流動相A變為45 %，收集40-43min組分，為雜質B組分，在38°C下濃縮去除乙腈，然后裝瓶凍 干，得到雜質B。雜質B用液相色譜法測定其純度為99.8%。
[0125] 【實施例9】雜質C的制備
[0126] (1)稱取Fmoc-Gly-Rink Amide AM樹脂2g(取代值為0.715mmol/g)，加入多肽合成 反應柱中，加 DMF 20ml溶脹30min，抽干。用DMF20ml洗滌樹脂l-2min，抽干。反復洗滌兩次， 用DCM 20ml洗滌樹脂l-2min，抽干。反復洗滌兩次。用20 %哌啶/DMF 20ml脫Fmoc兩次，每次 lOmin。用DMF 15ml洗滌樹脂l-2min，抽干。反復洗滌四次。用DCM 20ml洗滌樹脂l-2min，抽 干。反復洗滌兩次。取少量樹脂用茚三酮檢測法檢測，樹脂應顯陽性，即樹脂顯黃色或紅褐 色。
[0127] (2)稱取Fmoc-〇rn(Boc)-〇H( 1 · 3g，2·86mmol)、H0Bt(0.43g，3· 15mmol)于干燥反應 瓶中，加 DMF 20ml置于0°C ± 5 °C中冷卻，攪拌溶解。加 DIC(0.66ml，4.29mmo 1)活化5min以 上。將活化后的氨基酸加入上一步樹脂中30°C±5°C通氮氣攪拌反應約2h。取約30顆左右樹 月旨，用茚三酮檢測法檢測偶聯效果，如樹脂顆粒為無色透明。抽干反應液。用DMF20ml洗滌樹 月旨l-2min，反復洗滌三次。用20 %哌啶/DMF20ml脫Fmoc兩次，每次lOmin。用DMF20ml洗滌樹 脂1 _2min，抽干。反復洗滌四次。用DCM20ml洗滌樹脂1 _2min，抽干。反復洗滌兩次。
[0128] (3)按照上述方法依次偶聯Fmoc-Pro_0H(0 · 96g，2 · 86mmol)、Fmoc_Cys(Trt)-〇H (1·68g，2·86mmol)、Fmoc-D-Asn(Trt)-〇H(1·71g，2·86mmol)、Fmoc-Thr(tBu)-〇H(1·14g， 2·86mmol)、Fmoc_Ile-〇H(1·Olg，2·86mmol)、Fmoc-D-Tyr(Et)-〇H(1·23g，2·86mmol)、Mpa (Trt)-OH(1.00g,2.86mmol)；
[0129] (4)稱取碘（1 · 82g，7 · 15mmo 1)于干燥反應瓶中，加 DMF 20ml置于0°C ± 5°C中冷卻， 攪拌溶解30min。將上述溶液加入上一步樹脂中20°C±5°C反應l_1.5h。抽干反應液。用 DMF20ml洗滌樹脂2-5min，抽干，反復洗滌六次以上，至洗出液為淡黃色。用DCM20ml洗滌樹 脂2-5min，抽干，反復洗滌三次以上。將肽樹脂置室溫真空干燥10h以上，得3.21g。
[0130] (5)稱取上述干燥的阿托西班肽樹脂加入于反應瓶中。按照比例配制裂解試劑 261111〇?4 :1'13:!120 = 95:2.5:2.5，18樹脂用81111裂解試劑），置01€±5°(：環境冷卻，加入反應 瓶中。開啟攪拌，低速攪動樹脂，25°C±5°C裂解反應2h。反應結束后，過濾，濾液加入到 260ml的冰乙醚中，5°C±5°C沉降1~2h，析出沉淀粗肽。0°C_4°C環境下，低速離心5-10min， 分離出沉淀粗肽，用氮氣吹走沉淀粗肽中殘余乙醚，置于真空干燥箱中，室溫干燥l〇h以上， 得粗肽0.74g，粗肽收率為52 %。
[0131] (6)將粗肽0.74g，用純化水25ml溶解，經0.45μπι濾膜過濾，分三次進樣，進行高效 液相色譜純化。純化過程采用梯度洗脫，以乙腈為流動相A，0.05 % TFA/H20為流動相Β，檢測 波長為22〇11111，15%流動相4保持1〇111；[11，在10111；[11到50111；[11內流動相4變為45%，收集33-39111；[11 組分。
[0132] (7)將收集液40°C下濃縮去除乙腈，再轉入20ml西林瓶中凍干得雜質C。雜質C用液 相色譜法測定其純度為99.9 %。
[0133] 【實施例10】雜質C的制備
[0134] (1)稱取Fmoc-Gly-Rink Amide AM樹脂2g(取代值為0.3mmol/g)，加入多肽合成反 應柱中，加 DMF 20ml溶脹30min，抽干。依次用DMF、DCM反復洗滌樹脂，抽干。用哌啶/DMF脫 Fmoc兩次，每次lOmin。用DMF、DCM反復洗滌樹脂，抽干。取少量樹脂用茚三酮檢測法檢測，樹 脂應顯陽性，即樹脂顯黃色或紅褐色，得到Gly-Rink Amide AM樹脂。
[0135] (2)稱取卩111〇(3-01'11(13〇(3)-0!1(2.008,4.41]1〇1)和!10131:(0.658,4.841]1〇1)于干燥反應 瓶中，加 DMF20ml于0°C±5°C下冷卻，攪拌溶解，加0比(1.〇1111，6.6_〇1)活化51^11以上;將活 化后的氨基酸加入步驟1)所得的樹脂中30°C±5°C通氮氣攪拌反應至茚三酮檢測法檢測樹 脂顆粒為無色透明時，抽干反應液，用DMF反復洗滌樹脂，用哌啶/DMF脫Fmoc兩次，每次 10min。用DMF、DCM反復洗滌樹脂。
[0136] (3)再按照上述方法依次偶聯？111〇(3-?1'〇-0!1、？111〇(3-078(1'1'1:)-0!1、？111〇(3-0-八811 (Trt)-〇H、Fmoc-Thr(tBu)-〇H、Fmoc-Ile-〇H、Fmoc-D-Ty;r(Et)-〇H、Mpa(T;rt)-〇H;
[0137] (4)稱取碘（1 · 82g，7 · 15mmo 1)于干燥反應瓶中，加 DMF 20ml置于0°C ± 5°C中冷卻， 攪拌溶解30min。將上述溶液加入上一步樹脂中20°C±5°C反應l_1.5h。抽干反應液。用 DMF20ml洗滌樹脂2-5min，抽干，反復洗滌六次以上，至洗出液為淡黃色。用DCM20ml洗滌樹 脂2-5min，抽干，反復洗滌三次以上。將肽樹脂置室溫真空干燥10h以上，得3.21g。
[0138] (5)稱取上述干燥的樹脂加入于反應瓶中。按照比例配制裂解試劑26ml(TFA:TIS: H20 = 95: 2.5: 2.5，1 g樹脂用6m 1裂解試劑），置0 °C ± 5 °C環境冷卻，加入反應瓶中。開啟攪 拌，低速攪動樹脂，25°C ± 5°C裂解反應lh。乙醚沉淀得粗肽。
[0139] (6)用反相高效液相色譜法采用梯度洗脫，以乙腈為流動相A，0.05%TFA/H20為流 動相B，檢測波長為220nm，15%流動相A保持lOmin，在lOmin到50min內流動相A變為45%，收 集33~39min組分，再經濃縮、凍干后即得所述的醋酸阿托西班雜質C。雜質C用液相色譜法 測定其純度為99.8%。
[0140] 【實施例11】雜質C的制備
[0141] (1)稱取Fmoc-Gly-Rink Amide AM樹脂2g(取代值為1 .Ommol/g)，加入多肽合成反 應柱中，加 DMF 20ml溶脹30min，抽干。依次用DMF、DCM反復洗滌樹脂，抽干。用哌啶/DMF脫 Fmoc兩次，每次10min。用DMF、DCM反復洗滌樹脂，抽干。取少量樹脂用茚三酮檢測法檢測，樹 脂應顯陽性，即樹脂顯黃色或紅褐色，得到Gly-Rink Amide AM樹脂。
[0142] (2)稱取卩111〇(3-01'11(13〇(3)-0!1(2.008,4.41]1〇1)和!10131:(0.658,4.841]1〇1)于干燥反應 瓶中，加 DMF20ml于0°C±5°C下冷卻，攪拌溶解，加0比(1.〇1111，6.6_〇1)活化51^11以上;將活 化后的氨基酸加入步驟1)所得的樹脂中30°C±5°C通氮氣攪拌反應至茚三酮檢測法檢測樹 脂顆粒為無色透明時，抽干反應液，用DMF反復洗滌樹脂，用哌啶/DMF脫Fmoc兩次，每次 10min。用DMF、DCM反復洗滌樹脂。
[0143] (3)再按照上述方法依次偶聯卩111〇(3-?1'〇-0!1、卩111〇(3-〇5^(1'1'1:)-0!1、卩111〇(3-0-八811 (Trt)-〇H、Fmoc-Thr(tBu)-〇H、Fmoc-Ile-〇H、Fmoc-D-Ty;r(Et)-〇H、Mpa(T;rt)-〇H;
[0144] (4)稱取碘（1.82g，7.15mmol)于干燥反應瓶中，加 DMF20ml置于0°C±5°C中冷卻， 攪拌溶解30min。將上述溶液加入上一步樹脂中20°C±5°C反應l_1.5h。抽干反應液。用 DMF20ml洗滌樹脂2-5min，抽干，反復洗滌六次以上，至洗出液為淡黃色。用DCM20ml洗滌樹 脂2-5min，抽干，反復洗滌三次以上。將肽樹脂置室溫真空干燥10h以上，得3.21g。
[0145] (5)稱取上述干燥的樹脂加入于反應瓶中。按照比例配制裂解試劑26ml(TFA:TIS: H20 = 95:2.5: 2.5，lg樹脂用10ml裂解試劑），置0°C ± 5 °C環境冷卻，加入反應瓶中。開啟攪 拌，低速攪動樹脂，25 °C ± 5 °C裂解反應3h。乙醚沉淀得粗肽。
[0146] (6)用反相高效液相色譜法采用梯度洗脫，以乙腈為流動相A，0.05 % TFA/H20為流 動相B，檢測波長為220nm，15%流動相A保持10min，在10min到50min內流動相A變為45%，收 集33~39min組分，再經濃縮、凍干后即得所述的醋酸阿托西班雜質C。雜質C用液相色譜法 測定其純度為99.9%。
[0147] 【實施例12】醋酸阿托西班雜質D的制備
[0148] (1)稱取Fmoc-Gly-Rink Amide AM樹脂2g(取代值為0.715mmol/g)，加入多肽合成 反應柱中，加 DMF 20ml溶脹30min，抽干。用DMF20ml洗滌樹脂l-2min，抽干。反復洗滌兩次， 用DCM 20ml洗滌樹脂l-2min，抽干。反復洗滌兩次。用20%哌啶/DMF 20ml脫Fmoc兩次，每次 10min。用DMF 15ml洗滌樹脂l-2min，抽干。反復洗滌四次。用DCM 20ml洗滌樹脂l-2min，抽 干。反復洗滌兩次。取少量樹脂用茚三酮檢測法檢測，樹脂應顯陽性，即樹脂顯黃色或紅褐 色。
[0149] (2)稱取Fmoc-〇rn(Boc)-〇H( 1 · 3g，2·86mmol)、H0Bt(0.43g，3· 15mmol)于干燥反應 瓶中，加 DMF 20ml置于0°C ± 5 °C中冷卻，攪拌溶解。加 DIC(0.66ml，4.29mmo 1)活化5min以 上。將活化后的氨基酸加入上一步樹脂中30°C±5°C通氮氣攪拌反應約2h。取約30顆左右樹 月旨，用茚三酮檢測法檢測偶聯效果，如樹脂顆粒為無色透明。抽干反應液。用DMF20ml洗滌樹 月旨l-2min，反復洗滌三次。用20 %哌啶/DMF20ml脫Fmoc兩次，每次10min。用DMF20ml洗滌樹 脂1 -2min，抽干。反復洗滌四次。用DCM20ml洗滌樹脂1 _2min，抽干。反復洗滌兩次。
[0150] (3)按照上述方法依次偶聯Fmoc-Pro_0H(0 · 96g，2 · 86mmol)、Fmoc_Cys(Trt)-〇H (1·68g，2·86mmol)、Fmoc_Asp(Otbu)-〇H(1·18g，2·86mmol)、Fmoc-Thr(tBu)-〇H(1·14g， 2·86mmol)、Fmoc_Ile-〇H(1·Olg，2·86mmol)、Fmoc-D-Tyr(Et)-〇H(1·23g，2·86mmol)、Mpa (Trt)-OH(1.00g,2.86mmol)
[0151] (4)稱取碘（1.828,7.15臟〇1)于干燥反應瓶中，加01^201111置于0 1€±5°(：中冷卻， 攪拌溶解30min。將上述溶液加入上一步樹脂中20°C±5°C反應l_1.5h。抽干反應液。用 DMF20ml洗滌樹脂2-5min，抽干，反復洗滌六次以上，至洗出液為淡黃色。用DCM20ml洗滌樹 脂2-5min，抽干，反復洗滌三次以上。將肽樹脂置室溫真空干燥1 Oh以上，得3.09g。
[0152] (5)稱取上述干燥的肽樹脂3.09g加入于反應瓶中。按照比例配制裂解試劑24ml (丁卩厶:1'13:!120 = 95:2.5:2.5，18樹脂用81111裂解試劑），置01€±5°(：環境冷卻，加入反應瓶 中。開啟攪拌，低速攪動樹脂，25°C ± 5°C裂解反應2h。反應結束后，過濾，濾液加入到240ml 的冰乙醚中，5 °C ± 5 °C沉降1~2h，析出沉淀粗肽。0 °C-4°C環境下，低速離心5-1 Omin，分離 出沉淀粗肽，用氮氣吹走沉淀粗肽中殘余乙醚，置于真空干燥箱中，室溫干燥l〇h以上，得粗 肽0.68 8，粗肽收率為47.9%。
[0153] (6)將粗肽0.68g，用純化水22ml溶解，經0.45μπι濾膜過濾，分三次進樣，進行反相 高效液相色譜純化。純化過程采用梯度洗脫，以乙腈為流動相A，0.05 % TFA/H20為流動相Β， 檢測波長為220nm，15%流動相A保持lOmin，在lOmin到50min內流動相A變為45%，收集33-39min組分。
[0154] (7)將收集液40°C下濃縮去除乙腈，再轉入20ml西林瓶中凍干得雜質D。雜質D用液 相色譜法測定其純度為99.8 %。
[0155] 【實施例13】醋酸阿托西班雜質D的制備
[0156] (1)稱取Fmoc-Gly-Rink Amide AM樹脂2g(取代值為0.3mmol/g)，加入多肽合成反 應柱中，加 DMF20ml溶脹30min，抽干。依次用DMF、DCM反復洗滌樹脂，抽干。用哌啶/DMF脫 Fmoc兩次，每次10min。用DMF、DCM反復洗滌樹脂，抽干。取少量樹脂用茚三酮檢測法檢測，樹 脂應顯陽性，即樹脂顯黃色或紅褐色，得到Gly-Rink Amide AM樹脂。
[0157] (2)稱取 Fmoc-〇rn (Boc) -OH (1 · 3g，2 · 86mo 1)和HOBt (0 · 43g，3 · 15mo 1)于干燥反應 瓶中，加 DMF20ml于0°C±5°C下冷卻，攪拌溶解，加01以0.661111，4.29111111〇1)活化51^11以上;將 活化后的氨基酸加入步驟1)所得的樹脂中30°C±5°C通氮氣攪拌反應至茚三酮檢測法檢測 樹脂顆粒為無色透明時，抽干反應液，用DMF反復洗滌樹脂，用哌啶/ DMF脫Fmo c兩次，每次 10min。用DMF、DCM反復洗滌樹脂。
[0158] (3)再按照上述方法依次偶聯?111〇(3-?1'〇-0!1、？1]1〇(3-078(1'1'1:)-0!1、？1]1〇(3-48。(01:1311)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-〇H、Fmoc-Ile-〇H、Fmoc-D-Tyr(Et)-〇H、Mpa(T;rt)-〇H;
[0159] (4)稱取碘（1 · 82g，7 · 15mmo 1)于干燥反應瓶中，加 DMF 20ml置于0°C ± 5°C中冷卻， 攪拌溶解30min。將上述溶液加入上一步樹脂中20°C±5°C反應l_1.5h。抽干反應液。用 DMF20ml洗滌樹脂2-5min，抽干，反復洗滌六次以上，至洗出液為淡黃色。用DCM20ml洗滌樹 脂2-5min，抽干，反復洗滌三次以上。將肽樹脂置室溫真空干燥10h以上，得3.21g。
[0160] (5)稱取上述干燥的樹脂加入于反應瓶中。按照比例配制裂解試劑24ml(TFA:TIS: 出0 = 95:2.5:2.5,4樹脂用61111裂解試劑），置01€±5°(：環境冷卻，加入反應瓶中。開啟攪 拌，低速攪動樹脂，25°C ± 5°C裂解反應lh。乙醚沉淀得粗肽。
[0161] (6)用反相高效液相色譜法采用梯度洗脫，以乙腈為流動相A，0.05 % TFA/H20為流 動相B，檢測波長為220nm，15%流動相A保持lOmin，在lOmin到50min內流動相A變為45%，收 集33~39min組分，再經濃縮、凍干后即得所述的醋酸阿托西班雜質D。雜質D用液相色譜法 測定其純度為99.7%。
[0162] 【實施例14】醋酸阿托西班雜質D的制備
[0163] (1)稱取Fmoc-Gly-Rink Amide AM樹脂2g(取代值為1 · lmmol/g)，加入多肽合成反 應柱中，加 DMF 20ml溶脹30min，抽干。依次用DMF、DCM反復洗滌樹脂，抽干。用哌啶/DMF脫 Fmoc兩次，每次lOmin。用DMF、DCM反復洗滌樹脂，抽干。取少量樹脂用茚三酮檢測法檢測，樹 脂應顯陽性，即樹脂顯黃色或紅褐色，得到Gly-Rink Amide AM樹脂。
[0164] (2)稱取 Fmoc-〇rn (Boc) -OH (1 · 3g，2 · 86mo 1)和HOBt (0 · 43g，3 · 15mo 1)于干燥反應 瓶中，加 DMF20ml于0°C±5°C下冷卻，攪拌溶解，加01以0.661111，4.29111111〇1)活化51^11以上;將 活化后的氨基酸加入步驟1)所得的樹脂中30°C±5°C通氮氣攪拌反應至茚三酮檢測法檢測 樹脂顆粒為無色透明時，抽干反應液，用DMF反復洗滌樹脂，用哌啶/ DMF脫Fmo c兩次，每次 10min。用DMF、DCM反復洗滌樹脂。
[0165] (3)再按照上述方法依次偶聯?111〇(3-?1'〇-0!1、？1]1〇(3-05^(1'1'1:)-0!1、？1]1〇(3-48口(01:1311)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-〇H、Fmoc-Ile-〇H、Fmoc-D-Tyr(Et)-〇H、Mpa(T;rt)-〇H;
[0166] (4)稱取碘（1.82g，7.15mmol)于干燥反應瓶中，加 DMF20ml置于0°C±5°C中冷卻， 攪拌溶解30min。將上述溶液加入上一步樹脂中20°C±5°C反應l_1.5h。抽干反應液。用 DMF20ml洗滌樹脂2-5min，抽干，反復洗滌六次以上，至洗出液為淡黃色。用DCM20ml洗滌樹 脂2-5min，抽干，反復洗滌三次以上。將肽樹脂置室溫真空干燥10h以上，得3.21g。
[0167] (5)稱取上述干燥的樹脂加入于反應瓶中。按照比例配制裂解試劑24ml(TFA:TIS: H20 = 95:2.5: 2.5，lg樹脂用10ml裂解試劑），置0°C ± 5 °C環境冷卻，加入反應瓶中。開啟攪 拌，低速攪動樹脂，25 °C ± 5 °C裂解反應3h。乙醚沉淀得粗肽。
[0168] (6)用反相高效液相色譜法采用梯度洗脫，以乙腈為流動相A，0.05 % TFA/H20為流 動相B，檢測波長為220nm，15%流動相A保持10min，在10min到50min內流動相A變為45%，收 集33~39min組分，再經濃縮、凍干后即得所述的醋酸阿托西班雜質D。雜質D用液相色譜法 測定其純度為99.7%。
[0169] 【實施例15】醋酸阿托西班雜質E的制備
[0170] (1)稱取Wang樹脂2g(取代值為1 · lmmo 1 /g)加入多肽合成反應柱中，加 DMF 20ml溶 脹30min，抽干。用DMF20ml洗滌樹脂l-2min，抽干。反復洗滌兩次，用DCM 20ml洗滌樹脂1-2min，抽干。反復洗潘兩次。稱取Fmoc-Gly-〇H(0 · 65g，2 · 2mmol)、H0Bt(0 · 36g，2 · 64mmol)、 DMAP(0.05g，0.44mmol)于干燥反應瓶中，加 DMF 20ml置于0°C ± 5°C中冷卻，攪拌溶解，加 DIC(0.5ml，3.3mmol)活化5min以上。將活化后的氨基酸加入上述樹脂中30°C±5°C通氮氣 攪拌反應約2h。用DMF20ml洗滌4次。加入乙酸酐封閉反應2h。抽干反應液，用DMF20ml洗滌樹 月旨l-2min，反復洗滌三次。用20 %哌啶/DMF20ml脫Fmoc兩次，每次10min。用DMF20ml洗滌樹 脂1 -2mi，抽干，反復洗滌四次。用DCM20ml洗滌樹脂1 _2min，抽干，反復洗滌兩次。
[0171 ] (2)稱取卩111〇(3-〇1'11(13〇(3)-〇!1(2.0〇8,4· 4mmo1)、H0Bt(0 · 65g，4 · 84mmol)于干燥反應 瓶中，加 DMF 20ml置于0 °C ± 5 °C中冷卻，攪拌溶解。加 DIC(1.0ml，6.6mmo 1)活化5min以上。 將活化后的氨基酸加入上一步樹脂中30°C±5°C通氮氣攪拌反應約2h。取約30顆左右樹脂， 用茚三酮檢測法檢測偶聯效果，樹脂顆粒應為無色透明。抽干反應液，用DMF20ml洗滌樹脂 l-2min，反復洗滌三次。用20 %哌啶/DMF20ml脫Fmoc兩次，每次lOmin。用DMF20ml洗滌樹脂 1 _2min，抽干，反復洗滌四次。用DCM20ml洗滌樹脂1 _2min，抽干，反復洗滌兩次。
[0172] (3)按照上述方法依次偶聯Fmoc-Pro_0H( 1 · 48g，4 · 4mmol)、Fmoc_Cys(Trt)-〇H (2·58g，4·4mmo1)、Fmoc-Asn(Trt)-〇H(2·63g，4·4mmo1)、Fmoc-Thr(tBu)-〇H(1·75g， 4.4mmol)、Fmoc_Ile_0H(1·55g，4·4mmol)、Fmoc-D-Tyr(Et)-〇H(1·90g，4·4mmol)、Mpa (Trt)-OH(l.53g,4.4mmol)
[0173] (4)稱取碘(2.8(^，11臟〇1)于干燥反應瓶中，加01^301111置于01€±5°(：中冷卻，攪 拌溶解30min。將上述溶液加入上一步樹脂中20°C±5°C反應l_1.5h。抽干反應液。用 DMF20ml洗滌樹脂2-5min，抽干，反復洗滌六次以上，至洗出液為淡黃色。用DCM20ml洗滌樹 脂2-5min，抽干，反復洗滌三次以上。將肽樹脂置室溫真空干燥1 Oh以上，得3.36g。
[0174] (5)稱取上述干燥的阿托西班肽樹脂加入于反應瓶中。按照比例配制裂解試劑 271111〇?4:1'13:!120 = 95:2.5:2.5，18樹脂用81111裂解試劑），置01€±5°(：環境冷卻，加入反應 瓶中。開啟攪拌，低速攪動樹脂，25°C±5°C裂解反應2h。反應結束后，過濾，濾液加入到 200ml的冰乙醚中，5°C±5°C沉降1~2h，析出沉淀粗肽。0°C_4°C環境下，低速離心5-10min， 分離出沉淀粗肽，用氮氣吹走沉淀粗肽中殘余乙醚，置于真空干燥箱中，室溫干燥l〇h以上， 得1.26 8，粗肽收率為57.5%。
[0175] (6)將粗肽1.26g，用純化水40ml溶解，經0.45μπι濾膜過濾，分四次進樣，進行高效 液相色譜純化。純化過程采用梯度洗脫，以乙腈為流動相A，0.05 % TFA/H20為流動相Β，檢測 波長為22〇11111，15%流動相4保持1〇111；[11，在10111；[11到50111；[11內流動相4變為45%，收集33-39111；[11 組分。
[0176] (7)將收集液40°C下濃縮去除乙腈，再轉入20ml西林瓶中凍干得雜質E。雜質E用液 相色譜法測定其純度為99.7%。
[0177] 【實施例16】醋酸阿托西班雜質E的制備
[0178] (1)稱取Wang樹脂2g(取代值為0 · 3mmo 1 /g)，加入多肽合成反應柱中，加 DMF20ml溶 脹30min，抽干。依次用DMF、DCM反復洗滌樹脂，抽干。稱取Fmoc-Gly-〇H(0.65g，2.2mmo 1)、 HOBt (0 · 36g，2 · 64mmo 1)、DMAP(0 · 05g，0 · 44mmo 1)于干燥反應瓶中，加 DMF 20ml置于0°C ± 5 °C中冷卻，攪拌溶解，加 DIC(0.5ml，3.3mmol)活化5min以上。將活化后的氨基酸加入上述樹 脂中30 °C ± 5°C通氮氣攪拌反應約2h。用DMF20ml洗滌4次。加入乙酸酐封閉反應2h。抽干反 應液，用DMF20ml洗滌樹脂l-2min，反復洗滌三次。用20 %哌啶/DMF20ml脫Fmoc兩次，每次 10min。用DMF20ml洗滌樹脂l-2min，抽干，反復洗滌四次。用DCM20ml洗滌樹脂l-2min，抽干， 反復洗滌兩次。
[0179] (2)稱取 Fmoc-〇rn (Boc) -OH (1 · 3g，2 · 86mo 1)和HOBt (0 · 43g，3 · 15mo 1)于干燥反應 瓶中，加 DMF20ml于0°C±5°C下冷卻，攪拌溶解，加0比(1.〇1111，6.6_〇1)活化51^11以上;將活 化后的氨基酸加入步驟1)所得的樹脂中30°C±5°C通氮氣攪拌反應至茚三酮檢測法檢測樹 脂顆粒為無色透明時，抽干反應液，用DMF反復洗滌樹脂，用哌啶/DMF脫Fmoc兩次，每次 10min。用DMF、DCM反復洗滌樹脂。
[0180] (3)再按照上述方法依次偶聯?111〇(3-?1'〇-0!1、？1]1〇(3-05^(1'1'1:)-0!1、？1]1〇(3-48口（01:1311)- OH、Fmoc-Thr(tBu)-〇H、Fmoc-Ile-〇H、Fmoc-D-Tyr(Et)-〇H、Mpa(T;rt)-〇H;
[0181] (4)稱取碘(2.8(^，11臟〇1)于干燥反應瓶中，加01^301111置于01€±5°(：中冷卻，攪 拌溶解30min。將上述溶液加入上一步樹脂中20°C±5°C反應l_1.5h。抽干反應液。用 DMF20ml洗滌樹脂2-5min，抽干，反復洗滌六次以上，至洗出液為淡黃色。用DCM20ml洗滌樹 脂2-5min，抽干，反復洗滌三次以上。將肽樹脂置室溫真空干燥10h以上，得3.21g。
[0182] (5)稱取上述干燥的樹脂加入于反應瓶中。按照比例配制裂解試劑24ml(TFA:TIS: 出0 = 95:2.5:2.5,4樹脂用61111裂解試劑），置01€±5°(：環境冷卻，加入反應瓶中。開啟攪 拌，低速攪動樹脂，25°C ± 5°C裂解反應lh。乙醚沉淀得粗肽。
[0183] (6)用反相高效液相色譜法采用梯度洗脫，以乙腈為流動相A，0.05% TFA/H20為流 動相B，檢測波長為220nm，15%流動相A保持lOmin，在lOmin到50min內流動相A變為45%，收 集33~39min組分，再經濃縮、凍干后即得所述的醋酸阿托西班雜質E。雜質E用液相色譜法 測定其純度為99.6%。
[0184] 【實施例17】醋酸阿托西班雜質E的制備
[0185] (1)稱取Wang樹脂2g(取代值為1 · lmmol/g)，加入多肽合成反應柱中，加 DMF20ml溶 脹30min，抽干。依次用DMF、DCM反復洗滌樹脂，抽干。稱取Fmoc-Gly-〇H(0.65g，2.2mmo 1)、 HOBt (0 · 36g，2 · 64mmo 1)、DMAP(0 · 05g，0 · 44mmo 1)于干燥反應瓶中，加 DMF 20ml置于0°C ± 5 °C中冷卻，攪拌溶解，加 DIC(0.5ml，3.3mmol)活化5min以上。將活化后的氨基酸加入上述樹 脂中30 °C ± 5°C通氮氣攪拌反應約2h。用DMF20ml洗滌4次。加入乙酸酐封閉反應2h。抽干反 應液，用DMF20ml洗滌樹脂l-2min，反復洗滌三次。用20 %哌啶/DMF20ml脫Fmoc兩次，每次 10min。用DMF20ml洗滌樹脂l-2mi，抽干，反復洗滌四次。用DCM20ml洗滌樹脂l-2min，抽干， 反復洗滌兩次。
[0186] (2)稱取 Fmoc-〇rn (Boc) -OH (1 · 3g，2 · 86mo 1)和HOBt (0 · 43g，3 · 15mo 1)于干燥反應 瓶中，加 DMF20ml于0°C±5°C下冷卻，攪拌溶解，加0比(1.〇1111，6.6_〇1)活化51^11以上;將活 化后的氨基酸加入步驟1)所得的樹脂中30°C±5°C通氮氣攪拌反應至茚三酮檢測法檢測樹 脂顆粒為無色透明時，抽干反應液，用DMF反復洗滌樹脂，用哌啶/DMF脫Fmoc兩次，每次 10min。用DMF、DCM反復洗滌樹脂。
[0187] (3)再按照上述方法依次偶聯?111〇(3-?1'〇-0!1、？1]1〇(3-05^(1'1'1:)-0!1、？1]1〇(3-48口（01:1311)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-〇H、Fmoc-Ile-〇H、Fmoc-D-Tyr(Et)-〇H、Mpa(T;rt)-〇H;
[0188] (4)稱取碘(2.8(^，11臟〇1)于干燥反應瓶中，加01^301111置于01€±5°(：中冷卻，攪 拌溶解30min。將上述溶液加入上一步樹脂中20°C±5°C反應l_1.5h。抽干反應液。用 DMF20ml洗滌樹脂2-5min，抽干，反復洗滌六次以上，至洗出液為淡黃色。用DCM20ml洗滌樹 脂2-5min，抽干，反復洗滌三次以上。將肽樹脂置室溫真空干燥10h以上，得3.21g。
[0189] (5)稱取上述干燥的樹脂加入于反應瓶中。按照比例配制裂解試劑24ml(TFA:TIS: H 20 = 95:2.5: 2.5，lg樹脂用10ml裂解試劑），置0°C ± 5 °C環境冷卻，加入反應瓶中。開啟攪 拌，低速攪動樹脂，25 °C ± 5 °C裂解反應3h。乙醚沉淀得粗肽。
[0190] (6)用反相高效液相色譜法采用梯度洗脫，以乙腈為流動相A，0.05 % TFA/H20為流 動相B，檢測波長為220nm，15%流動相A保持10min，在10min到50min內流動相A變為45%，收 集33~39min組分，再經濃縮、凍干后即得所述的醋酸阿托西班雜質E。雜質E用液相色譜法 測定其純度為99.7%。
[0191]【實施例18】雜質的序列分析
[0192] (1)分別稱取凍干后的雜質A、雜質B、雜質C、雜質D和雜質E0. lmg，加高純水10ml， 振搖溶解，制成濃度為〇. 〇lmg/ml的溶液，經過0.22um濾頭過濾后進樣。
[0193] (2)采用傅里葉變換離子回旋共振質譜(Bruker Daltonic，Solarix，9.4T)，對雜 質A、雜質B、雜質C、雜質D和雜質E進行一級質譜掃描，掃描條件為:源類型:ESI;干氣體流 速:4L/min;干氣體溫度：180°C ;噴霧器壓力：1. Obar;極性:正極;毛細管電壓:4KV;錐孔電 壓:-500V，分別得到的雜質A、雜質B、雜質C、雜質D和雜質E的一級質譜準分子離子峰見表1。 [0194]表1
[0196] (3)分別對雜質 A，m/zl010.44275、雜質 B，m/zl010.43629、雜質 C，m/z994.43356、 雜質D，m/z995.42536、雜質E，m/z995.42429進行隔離，施加能量碎裂，得到各雜質的碎片信 息，通過分析軟件分析相應的雜質結構，見表2。
[0197] 表2
[0199] 【試驗例1】裂解試劑的選擇
[0200] 肽鏈組裝完畢后需要用強酸將肽鏈從樹脂上釋放出來，在切割肽的同時側鏈保護 基團也會被相應的脫除，這時需要捕獲劑來捕獲側鏈保護基團形成的正碳離子等活性離 子，以避免其再次與多肽氨基酸殘基的活性側鏈基團結合生成副產物。
[0201] 1、不同的裂解試劑對雜質C粗肽收率和純度的影響
[0202] 本試驗例以取代值為0.715mmol/g的Fmoc-Gly-Rink Amide AM樹脂為起始物料， 按照實施例9的方法逐步偶聯得到醋酸阿托西班雜質C肽樹脂，再選擇不同的裂解試劑裂解 得到醋酸阿托西班雜質C粗肽來對比試驗，以雜質C粗肽收率和純度為考察標準，評價不同 的裂解試劑對反應的影響(表3-1)。
[0203] 表3-1、不同裂解試劑選擇實驗的結果
[0205] 從上述試驗結果可以看出，在其它條件相同的情況下，選擇本發明的三氟乙酸:三 異丙基硅烷:水：=95:2.5:2.5裂解試劑獲得的醋酸阿托西班雜質C的收率和純度較高。
[0206] 2、不同的裂解試劑對雜質D粗肽收率和純度的影響
[0207] 本試驗例以取代值為0.715mmol/g的Fmoc-Gly-Rink Amide AM樹脂為起始物料， 按照實施例12的方法逐步偶聯得到醋酸阿托西班雜質D肽樹脂，再選擇不同的裂解試劑裂 解得到醋酸阿托西班雜質D粗肽來對比試驗，以雜質D粗肽收率和純度為考察標準，評價不 同的裂解試劑對反應的影響(表3-2)。
[0208] 表3-2、不同裂解試劑選擇實驗的結果
[0209]
[0210]從上述試驗結果可以看出，在其它條件相同的情況下，選擇本發明的三氟乙酸:三 異丙基硅烷:水：=95:2.5:2.5裂解試劑獲得的醋酸阿托西班雜質D的收率和純度較高。 [0211] 3、不同的裂解試劑對雜質E粗肽收率和純度的影響
[0212]本試驗例以取代值為1. lmmol/g的Wang樹脂為起始物料，按照實施例15的方法逐 步偶聯得到醋酸阿托西班雜質E肽樹脂，再選擇不同的裂解試劑裂解得到醋酸阿托西班雜 質E粗肽來對比試驗，以雜質E粗肽收率和純度為考察標準，評價不同的裂解試劑對反應的 影響(表3-3)。
[0213] 表3-3、不同裂解試劑選擇實驗的結果
[0214]
[0215]從上述試驗結果可以看出，在其它條件相同的情況下，選擇本發明的三氟乙酸:三 異丙基硅烷:水：=95:2.5:2.5裂解試劑獲得的醋酸阿托西班雜質E的收率和純度較高。
【主權項】
1. 醋酸阿托西班雜質，其特征在于，所述的醋酸阿托西班雜質為雜質A、雜質B、雜質C、 雜質D或雜質E，其結構序列分別為： 雜質A: c [Mpa (S = O) -D-Tyr(Et)-Il e-Thr-Asn-Cy s ] -Pro-Orn-Gl y_NH2; 雜質 B: c[Mpa-D-Tyr(Et)-Ile-Thr-Asn-Cys(S = 0) ]-Pr〇-〇rn-Gly-NN2; 雜質C: c [Mpa-D-Tyr (Et )-1 le-Thr-D-Asn-Cys ]-Pr〇-〇rn-Gly-NH2; 雜質D: c [Mpa-D-Tyr (Et )-1 le-Thr-Asp-Cys ]-Pr〇-〇rn-Gly-NH2; 雜質E: c [Mpa-D-Tyr(Et)-Ile-Thr-Asn-Cy s ]-Pr〇-〇rn-Gly-〇H 〇2. -種醋酸阿托西班雜質A或雜質B的制備方法，其特征在于，所述的制備方法包括如 下步驟： 1) 將醋酸阿托西班原料藥采用雙氧水氧化，得到氧化后的溶液； 2) 將氧化后的溶液過濾后采用反相C18柱進行分離純化，分離純化時，每次上樣量為 IOml，以乙腈為流動相A，0.05 %TFA/H20為流動相B，檢測波長為220nm，15 %流動相A保持 IOmin，在IOmin到50min內流動相A變為45 %，分別收集36_39min組分或40_43min組分，再分 別經濃縮、凍干后得到所述的醋酸阿托西班雜質A和雜質B。3. 根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟1)中所述的醋酸阿托西班原料藥 與雙氧水的質量體積比為lg:5~15ml，優選Ig: IOml;所述的氧化時間為1~3h，優選2h;所 述的雙氧水為質量百分比為30%的雙氧水;所述的醋酸阿托西班原料藥在采用雙氧水氧化 前先用高純水超聲溶解;步驟2)中所述的濃縮為在35~45°C、優選在40°C下濃縮。4. 一種醋酸阿托西班雜質C的制備方法，其特征在于，所述的制備方法包括如下步驟： 1) 以Fmoc-Gly-Rink Amide AM樹脂為起始物料，溶脹后脫除Fmoc保護，得到Gly-Rink Amide AM樹脂； 2) 以Gly-Rink Amide AM樹脂為載體，以DIC/H0BT為縮合試劑，按照Fmoc/tbu固相多肽 合成的方法在Gly-Rink Amide AM樹脂上偶聯Fmoc-Orn(Boc)-OH; 3) 再按照上述方法依次偶聯 Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cy s (Trt)-OH、Fmoc-D-Asn (Trt)-OH、 Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ile_0H、Fmoc-D-Tyr(Et)-〇H、Mpa(Trt)-OH; 4) 用碘進行固相環化； 5) 用裂解試劑進行切割得醋酸阿托西班雜質C粗肽，用乙醚沉淀粗肽； 6) 用反相高效液相色譜法純化分離，再經濃縮、凍干后即得所述的醋酸阿托西班雜質 Co5. -種醋酸阿托西班雜質D的制備方法，其特征在于，所述的制備方法包括如下步驟： 1) 以Fmoc-Gly-Rink Amide AM樹脂為起始物料，溶脹后脫除Fmoc保護，得到Gly-Rink Amide AM樹脂； 2) 以Gly-Rink Amide AM樹脂為載體，以DIC/H0BT為縮合試劑，按照Fmoc/tbu固相多肽 合成的方法在Gly-Rink Amide AM樹脂上偶聯Fmoc-Orn(Boc)-OH; 3) 再按照上述方法依次偶聯 Fmoc-Pro-OH、Fmo c_Cy s (Trt)-OH、Fmoc-Asp (Otbu)-OH、 Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ile_0H、Fmoc-D-Tyr(Et)-〇H、Mpa(Trt)-OH; 4) 用碘進行固相環化； 5) 用裂解試劑進行切割得醋酸阿托西班雜質D粗肽，用乙醚沉淀粗肽； 6) 用反相高效液相色譜法純化分離，再經濃縮、凍干后即得所述的醋酸阿托西班雜質 D06. -種醋酸阿托西班雜質E的制備方法，其特征在于，所述的制備方法包括如下步驟： 1) 以Wang樹脂為起始物料，溶脹洗滌后，以DIC/H0BT為縮合試劑，將Fmoc-Gly-OH的羧 基與樹脂的羥基以酯鍵相連，得到Fmoc-Gly-Wang樹脂； 2) 以Fmoc-Gly-Wang樹脂為載體，以DIC/H0BT為縮合試劑，按照Fmoc/tbu固相多肽合成 的方法在 Fmoc-Gly-Wang 樹脂上偶聯 Fmoc-Orn(Boc)-OH; 3) 再按照上述方法依次偶聯 Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cy s (Trt)-OH、Fmoc-Asn (Trt)-OH、 Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ile_0H、Fmoc-D-Tyr(Et)-〇H、Mpa(Trt)-OH; 4) 用碘進行固相環化； 5) 用裂解試劑進行切割得醋酸阿托西班雜質E粗肽，用乙醚沉淀粗肽； 6) 用反相高效液相色譜法純化分離，再經濃縮、凍干后即得所述的醋酸阿托西班雜質 E07. -種權利要求1所述的醋酸阿托西班雜質的序列檢測方法，其特征在于，所述的序列 分析方法為采用MS/MS測序。8. 根據權利要求7所述的序列檢測方法，其特征在于，所述的采用MS/MS測序為采用傅 里葉變換離子回旋共振質譜分別對雜質A、雜質B、雜質C、雜質D或雜質E進行一級質譜掃描， 得到分子離子峰，然后對準分子離子峰施加能量裂解，得到該分子離子峰的二級質譜碎片 信息，通過分析軟件分析確定雜質的序列結構。9. 根據權利要求7或8所述的序列分析方法，其特征在于，雜質A、雜質B、雜質C、雜質D和 雜質E的一級質譜分子離子峰分別為1010.44275、1010.43629、994.43356、995.42536和 995.42429。10. -種權利要求1所述的醋酸阿托西班雜質A、雜質B、雜質C、雜質D和/或雜質E在醋酸 阿托西班質量檢測中作為雜質對照品的應用。
【文檔編號】G01N33/68GK105949283SQ201610396692
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月7日
【發明人】鐘正明, 彭濤, 王玲
【申請人】海南合瑞制藥股份有限公司