一種雙核環金屬銥配合物及其制備方法和應用
【專利摘要】本發明涉及一種雙核環金屬銥配合物及其制備方法和應用，它的化學結構通式為：；式中，和分別為以C、N原子為配位原子的雙齒配體，其相互獨立地具有以下結構：、、、、、或，式中R為氫原子、烷基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、芳基、芳氧基、芳硫基、芳基氨基、芳基烷基、芳基烷氧基、芳基烷硫基、芳基烷基氨基、酰基、酰氧基、酰胺基、亞氨基或羧基；X為Cl、Br、I、PF6、BF4或(CF3SO2)2N，n和m相互獨立地為1~6的整數。它是單激發雙發射的磷光探針，很好地保留了兩個磷光團的吸收和發光性質；有望用于磷光比率型O2傳感和成像；而且具有較強的親脂性，可用于線粒體定位。
【專利說明】
一種雙核環金屬銥配合物及其制備方法和應用
技術領域
[0001 ]本發明屬于生物成像領域，涉及一種雙核環金屬銥配合物，具體涉及一種雙核環 金屬銥配合物及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 隨著顯微鏡技術的發展，細胞和活體成像日益成為生命科學、化學生物學和生物 醫學的常規研究手段。尋找新型的生物成像探針和材料一直以來都是細胞和活體成像最重 要的課題之一。迄今已報道的細胞和活體成像所用的發光成像劑或探針種類繁多、紛繁復 雜，從尺度上大體可分為納米探針、大分子探針和小分子探針三類。
[0003] 小分子探針是研究最早、種類最多、使用最廣的一類生物探針，按激發方式可分為 光致發光探針、化學發光探針、電化學發光探針和生物發光探針等。在生物成像中所用的主 要是光致發光探針和生物發光探針。其中過渡金屬配合物磷光探針具有量子效率較高、 Stokes位移大、發光壽命較長、發光顏色可調、抗光漂白能力強等優良的光物理性質，在生 物標記和成像領域越來越受到關注和重視，已報道的可用于生物成像的有Ru(II)、〇 S(II)、 Re(I)、Rh(III)、Ir(III)、Pt(II)、Au(I)、Ag(I)、Zn(II)、Cu(I)等過渡金屬的配合物，直接 或偶聯不同生物活性分子(生物素、雌激素、多肽、肽核酸等)和識別基團后用于細胞成像。 在這些過渡金屬配合物中，Ir(III)配合物由于良好的光熱和化學穩定性、較低的細胞毒 性、配體選擇和修飾的多樣性以及發射光譜可調性，在生物標記和成像方面受到的關注最 多、研究最廣。Ir(III)配合物較高的量子效率可以減少染料用量，降低對細胞和動物體的 毒性，提高成像的清晰度;大的Stokes位移和較長發光壽命有利于消除來自生物體的自發 光和背景焚光干擾，增加成像的靈敏度;通過對環金屬Ir (III)配合物配體的修飾可以調節 發光性質、引入靶向或功能性基團，可以實現對細胞亞結構和活體靶向性和功能性成像。
[0004] 絕大多數發光化合物和材料在激發波長下發射單峰，然而某些情況下需要化合物 或材料發射兩色或多色的光，如白光0LED、多重標記和熒光比率型檢測中。目前已報道的雙 發射探針根據其結構可以分為納米粒子、過渡金屬配合物和有機小分子三類。其中研究最 多的是雙發射納米粒子，如量子點、染料摻雜的納米娃球和聚合物納米粒子、上轉換納米粒 子等，已廣泛用于對pH、金屬離子和溫度等的檢測和成像中。相較于納米材料，雙發射過渡 金屬配合物研究主要集中在釕(II)、Pt(II)和銥(III)配合物上。具有雙發射性質的環金屬 銥(III)配合物主要是通過和其他發光分子偶聯構成的，而直接由純銥（III)配合物構成的 雙發射探針尚無報道。
【發明內容】
[0005] 本發明目的是為了克服現有技術的不足而提供一種雙核環金屬銥配合物。
[0006] 為達到上述目的，本發明采用的技術方案是:一種雙核環金屬銥配合物，它的化學 結構通式為：
[0008]
分別為以C、N原子為配位原子的雙齒配體，其相互獨立 地具有以下結構：
[0009]
式中R為氣原子、烷基、烷氧基、焼硫基、烷基氣基、芳基、芳氧基、 芳硫基、芳基氣基、芳基烷基、芳基烷氧基、芳基焼硫基、芳基烷基氣基、醜基、醜氧基、醜胺 基、亞氨基或羧基;X為(：1、8廠1、？?6、8?4或(0?33〇2)爪11和111相互獨立地為1~6的整數。
[0010] 優化地
相互獨立地
[0012] 優化地，所述X為Cl或PF6，n和m相互獨立地為1~3的整數。
[0013]優化地，它的化學結構通式為：
[0015] 本發明的又一目的在于提供一種上述雙核環金屬銥配合物的制備方法，它包括以 下步驟：
[0016]
分別與IrCl3溶于第一混合溶劑中，進行加熱回流反 應，冷卻后過濾收集沉淀得
[0017]
于第二混合溶劑中，進行回流 反應，過濾旋干后過柱子
[0018]
溶于第二混合溶劑中， 進行加熱回流反至溶液透明：
[0019]
進行酯化反應 即可，或者向產物中滴入NH4X溶液析出產品后過柱子即可。
[0020] 優化地，步驟(a)中，所述第一混合溶劑為乙二醇乙醚與水組成的混合溶劑；回流 溫度為100~150°c，回流時間為10~15小時
與IrCl3反應冷卻后減壓抽濾收集沉 淀，依次用水、乙醇、丙酮分別洗滌多次：
與IrCl3反應冷卻后加入過量稀鹽酸，過濾 收集沉淀，依次用水、乙醇分別洗滌多次。
[0021] 優化地，所述步驟（d)中，在惰性氣體條件下將
碳酸二月桂酯和4-二甲氨基吡啶溶于二甲基甲酰胺中，在室溫 、 下攪拌反應10~15小時。
[0022] 優化地，所述第二混合溶劑為二氯甲烷和甲醇的混合溶液。
[0023] 本發明的再一目的在于提供一種上述雙核環金屬銥配合物作為單激發雙發射的 磷光探針在熒光細胞成像中的應用
[0024] 由于上述技術方案運用，本發明與現有技術相比具有下列優點：本發明雙核環金 屬銥配合物由于具有特定的化學結構式，是單激發雙發射的磷光探針，很好地保留了兩個 磷光團的吸收和發光性質;有望用于磷光比率型〇 2傳感和成像;而且具有較強的親脂性，可 用于線粒體定位。
【附圖說明】
[0025] 附圖1為6-(2-苯并[b]噻吩基）菲啶(BTPhen)的合成路線：i)POCl3/PCl5SSOCl 2/ DMF ； i i) Pd (PPh3) 4/Na2C03 ； To 1 /C2H5OH/H2O ；
[0026]附圖2為實施例6中的合成路線；
[0027]附圖3為實施例7中的合成路線；
[0028]附圖4為實施例8中的合成路線；
[0029]附圖5為實施例6至實施例8中的產品在乙腈中的光譜圖；
[0030]附圖6為實施例8中的產品不同含量空氣/氮氣飽和的乙腈中的發射光譜圖，激發 波長411nm(內插圖顯不525和705nm處的發光比率與空氣含量的關系）；
[0031]附圖7為雙發射探針IrbtphenCOOIrpbt的細胞成像圖；
[0032] 附圖 8 為IrbtphenCOOIrpbt 和 MitoTrackCRed 共染細胞成像圖。
【具體實施方式】
[0033] 本發明雙核環金屬銥配合物，它的化學結構通式為：
[0035]
分別為以C、N原子為配位原子的雙齒配體，其相互獨立 地具有以下結構： 「00361
式中R為氣原子、烷基、烷氧基、焼硫基、烷基氣基、芳基、芳氧基、 ) 芳硫基、芳基氣基、芳基烷基、芳基烷氧基、芳基燒硫基、芳基烷基氣基、醜基、醜氧基、醜胺 基、亞氨基或羧基;X為(：1、8廣1、？?6、8?4或(0?33〇2)必，11和111相互獨立地為1~6的整數。
[0037]
相互獨立地優選為
更優選相互獨立地 所述X優 t X 選為Cl或PF6。!!和m相互獨立地優選為1~3的整數。
[0039] 本發明的又一目的在于提供一種上述雙核環金屬銥配合物的制備方法，它包括以下步 驟:(a)在將
分別與IrCl3溶于第一混合溶劑中，進行加熱回流反應，冷卻后過 濾收集沉淀
溶于第二混合溶劑中（第二混合溶劑優選為二氯甲烷和甲醇的混合溶 液），進行回流反應，過濾旋干后過柱子
[0040]
溶于第二混合溶劑中，進行加熱回 流反至溶液透明，
進行酯化反應即可，或者向產物中滴入ΝΗ4χ溶液析出產品后過柱子即可。不同結構的產品可 參考下面實施例中的方法進行合成，下面實施例中不一一贅述不同產品的合成步驟。
[0041] 步驟(a)中，所述第一混合溶劑為乙二醇乙醚與水組成的混合溶劑；回流溫度為 100~150°C，回流時間為10~15小時：
與IrCl3反應冷卻后減壓抽濾收集沉淀，依次 用水、乙醇、丙酮分別洗滌多次；
與IrCl3反應冷卻后加入過量稀鹽酸，過濾收集沉
淀，依次用水、乙醇分別洗滌多次；制得純度較高的產品，不需要經進一步純化和表征直接 投下一步。
[0042]所述步驟(d)中，在惰性氣體條件 碳酸二月桂酯和4-二甲氨基吡啶溶于二甲基甲酰胺中，在室溫下攪拌反應10~15小時，以 獲得產率和純度較高的產品。
[0043]下面將結合附圖實施例對本發明進行進一步說明。
[0044] 實施例1
[0045] 本實施例提供6-氯菲啶（結構式為 的合成路線，如圖1所示，具體 為：
[0046] 將6 (5H)-菲啶酮（5 · 1 lg，26 · 2mmol)和五氯化磷（6 · 12g，29 · 4mmol)置于 250ml 單口 燒瓶中，加入50ml三氯氧磷，氮氣保護下100°C回流2小時;冷卻至室溫，加入50ml甲苯稀釋 反應液，然后將過量的三氯氧磷旋去大部分，殘余液體緩慢倒入2mol/L的氨水中，析出的固 體用100ml乙酸乙酯提取3次;水洗、無水硫酸鎂干燥后旋干得到5. lg淺黃色產品。所得粗品 經硅膠柱層析(EA:PE = 2:3，v/v，下同）分離得4.93g黃色片狀固體，產率88.1 %，如圖1所 不。
[0047] 實施例2
[0048] 本實施例也提供6-氯菲啶(結構式為 > 的合成路線，具體為：
[0049] 氮氣保護下，6(5H)_菲啶酮(7.68g，39.3mmol)在20ml SOCh中（0.5ml DMF作催化 劑)85°C回流3小時；反應結束后，真空旋干過量的S0C12。加入二氯甲烷溶解殘留固體，用飽 和的碳酸氫鈉溶液洗滌三次后干燥旋干上硅膠柱；以DCM:PE = 2:1為洗脫劑淋洗柱子分離 出第二個組分得淺黃色片狀固體5 · 49g，產率65 · 3% AC-MS:m/z (M+)calcd 213 · 0，found 213·0</Η NMR(400MHz，CDC3)S8.60((1,J = 8.3Hz，lH)，8.55-8.45(m，2H)，8.09(dd，J = 8.1， 1.0Hz,lH),7.90(ddd ,J = 8.3,7.1,1.3Hz,lH),7.79-7.65(m,3H)〇
[0050] 實施例3
[0051] 本實施例提供6-(2-苯并[b]噻吩基）菲啶(BTPhen，結構式為： 的合
成路線，具體為：
[0052] 在氮氣保護的250ml三口燒瓶中加入6-氯菲啶（5.16g，24. lmmol)、2-苯并噻吩硼 酸(6· 56g，36· 9mmol)、Pd(PPh3)4( 1 ·47g，1 · 27mmol)和無水碳酸鈉（5· 17g，48· 78mol)，依次 加入24ml水、40ml無水乙醇和80ml甲苯，攪拌均勻后氮氣置換三次;然后在90 °C下攪拌回流 12小時；反應結束后冷卻至室溫，分出甲苯層，水相用100ml二氯甲烷萃取三次合并至甲苯 相;旋干后經硅膠柱層析(DCM: PE = 1:1)分離得到6.84g白色細針狀晶體，產率91.0%。6(：-MS:m/z([M-H] + )calcd 310.1，found 310·1</Η 匪R(400MHz，CDCl3)S8.70(d，J = 8.3Hz， 1H) ,8.65(d,J = 8.3Hz,lH) ,8.59(d,J = 7.8Hz,lH) ,8.24(dd,J = 8.2,1.0Hz,lH) ,7.97-7.84(111，4!1)，7.80-7.64(111，3!1)，7.47-7.37(111，2!1)。13(：匪1?(101]\〇^，〇0(：13)3154.19， 143.79,142.76,140.88,140.16,133.78,130.90,130.54,129.13,128.15,127.72,127.52， 126.17,125.31,124.95,124.66,124.42,123.82,122.58,122.41,122.08,77.48,77.16， 76.84,如圖1所示。
[0053] 實施例4
[0054] 本實施例提供四（6-(2-苯并噻吩基）菲啶）（μ-二氯)合二銥（III)([Ir(btphen) 2C12]2)氯橋二聚體的合成路線，具體為：
[0055] BTPhen(2.02g，6.49mmol)和IrCl3 · 3H2〇(l .09g，3.09mmol)溶于30ml乙二醇乙釀 和20ml水的混合溶劑中，加熱到120°C回流12小時;冷卻后減壓抽濾收集沉淀，依次用水、乙 醇、丙酮各洗滌三次;真空烘干得到暗紅色粉末2.47g，產率94.3% ;產品未經進一步純化和 表征直接投下一步。
[0056] 實施例5
[0057] 本實施例提供四（2-苯基苯并[d]噻唑）(μ_二氯)合二銥(IlD^aMpbthMy-Cl )2)氯橋二聚體的合成路線 ，具體為：
[0058] 在 N2 保護下，將 29.28g PBT 160mmol)和 25g IrCl3 · 3H2〇 (70mmo 1)置于三口燒瓶中，用630ml乙二醇乙醚和水(3:2)的混合溶劑溶解，油浴加熱120°C 反應過夜；溶液變成紅色后終止反應，冷至室溫;將溶液倒入到足量lmol/L的鹽酸中，過濾 出沉淀;依次用去離子水、乙醇清洗固體三次得深紅色粉末28g，產率58.5% ;產品未經進一 步純化和表征直接用于后續反應。
[0059] 實施例6
[0060] 氯化雙(6-(2-苯并[b]噻吩基）菲啶）（4-(3-羧丙基)-2,2'_聯吡啶)合銥（III) (Ir (btphen)2(BpyC00H))的合成路線，具體為：
[0061 ]將473 · 2mg BpyCOOH · NH4C1 · HC1 (1 · 42mmol，BpyC00H為
和 988 · 7mg實施例4中的[Ir (btphen)2]2(y-Cl )2(0 · 584mmol)、758 · 4mg NaC〇3(7 · 16mmol)混 合，溶于40ml二氯甲烷和甲醇的等體積混合溶劑中，氮氣保護下回流過夜溶液變為澄清的 紅色。過濾旋干后將所得固體進行硅膠柱(洗脫劑:DCM-DCM :CH30H = 2:1梯度洗脫）分離， 得0 · 803g深紅色粉末，產率63 · 0% iSI-TOF-MS:m/z([Μ-Cl ] + )calcd 1055 · 2065，found 1055.2036.1H NMR(400MHz，CDC13)S9.38(td，J = 5.3,2.4Hz，2H)，8.6h8.48(m，3H)，8.45 (d，J = 4.7Hz，1H)，8· 31(d，J = 5.9Hz，2H)，8.25(d，J = 8.3Hz，2H)，7.99-7.90(m，4H) ,7.85 (dd，J = 8.0,3.6Hz，2H)，7.32-7.21(m，4H)，7.14(ddt，J=11.2，10.0,5.3Hz，5H)，6.79-6.68(m,3H), 6.64( td,J = 8.2,1.0Hz,3H) ,2.66 (dd,J= 16.7,9.3Hz,2H) ,2.24( t,J = 7.2Hz，2H),1.82-1.68(m，2H).13C NMR(101MHz，CDC13)Sl75.96,175.61,167.78,167.75, 159.19,158.73,156.39,155.93,155.59,155.27,154.87,152.13,148.91,148.86,146.50, 146.30,145.49,145.44,143.54,143.48,143.43,140.40,138.47,138.45,137.00,133.54, 133.45,133.38,128.87,128.75,128.26,128.08,127.83,127.32,126.96,126.83,126.74, 126.64,125.31,125.18,124.73,124.54,124.40,124.09,123.94,123.89,123.61,122.69, 122.59,122.52,122.02,121.35,121.31,34.58,33.84,25.49,如圖 2所示。
[0062] 實施例7
[0063] 氯化雙（2-苯基苯并[d]噻唑）（4-甲基-4'-羥甲基-2,2'-聯吡啶）合銥（III) (Ir (pbt)2(hmbpy))的合成路線，具體為：
[0064] 500mg 4-甲基-4'-羥甲基-2,2'-聯吡啶（2.50mmol)和 1.62g[Ir(pbt)2]2(y-Cl)2 (1.25mmo 1)溶于50ml二氯甲烷和甲醇的等體積混合溶液中，60°C下回流至溶液透明。所得 產品經硅膠柱（洗脫劑：CH3CN:DCM = 2:1)分離后得1.49g橙紅色晶體，產率70.2%<^31_ TOF-MS:m/z([M-Cl]+)calcd 813.1334found 813.1345.1H 匪R(400MHz，CDC13)S9.13(s, 1H),8.69(s,lH),7.91-7.82(m,4H),7.82-7.75(m,2H),7.40-7.31(m,3H),7.26(d,J= 5.6Hz,lH),7.17-7.11(m,lH),7.06(tdd ,J = 7.7,4.5,3.1Hz,3H),6.84(tt ,J = 7.5,1.2Hz, 2H) ,6.38(dd, J=12.3,7.7Hz,2H) ,6.20(dd,J=13.4,8.4Hz,2H) ,4.94(dd,J = 32.5, 16.4Hz，2H),2.61(s，3H).13C 匪R(101MHz，CDC13)δ180·97,156.51,152.83,150.79, 149.37,149.15,140.14,133.36,132.04,131.23,128.79,128.24,126.88,126.54,125.94， 123.45,122.98,117.68,21.52,如圖 3所示。
[0065] 實施例8
[0066] 雙核環金屬銥配合物（IrbtphenCOOIrpbt，雙發射探針)的合成路線，具體為：
[0067]惰性氣體保護下，將 Ir (pbt) 2 (hmbpy )(565.8mg，66.7ymo l)、Ir(btphen)2 (bpyCOOH) (742 · 5mg，68 · Ιμπιο 1)與DCC(碳酸二月桂酯，154 · 2mg，747μπιο 1)、DMAP (4-二甲氨 基吡啶，29.5mg，241μπιο1)混合，溶于10ml無水DMF中，室溫下攪拌反應12小時。反應結束后 滴入10ml飽和NH4PF 6溶液，析出產品。將濾出的固體經硅膠柱(洗脫劑:DCM(5 % TEA) -DCM: CH30H = 5 :1 (5 % TEA)梯度洗脫）分離得紅色粉末681 · 6mg，產率47 · 7 % iSI-TOF-MS: m/z ([M-2PF6-C56H37IrN402S2] + )calcd 797.1385, found 797.1364；m/z([M-2PF6-C37H24IrN4S2] + )calcd 1069.2222，found 1069.2178,如圖 4所示。
[0068] 實驗例1
[0069] 將實施例6、7和8中的產品分別進行發射光譜和吸收光譜：Ir(btphen)2(bpyC00H) (1)、Ir(pbt)2(hmbpy) (2)和雙發射探針IrbtphenC00Irpbt(3)的吸收光譜和發射光譜分別 在乙腈（UPLC級，ACR0S)中測量。熒光量子效率以Ru(bpy)32+的空氣飽和乙腈溶液（Φ = 0.062[23])為參比測定。量子效率計算公式如下：
[0071] 其中，sam和ref分別表示待測Ir(III)配合物樣品和參比化合物Ru(bpy)32+，φ、1、 A和η分別表示量子效率、積分發射強度、激發波長下對應的吸光度和溶劑的折射率。測定時 應使兩種溶液的濃度相等。測量發射光譜時，所有溶液都事先鼓氮氣半小時以到達氮氣飽 和除去溶解的氧，并在測試過程中保持密閉。
[0072] Ir(btphen)2(bpyC00H) ( 1 )、Ir(pbt)2(hmbpy) (2)和雙發射探針 IrbtphenC00Irpbt(3)在乙腈中的吸收和發光譜如圖5和圖6所示，數據見表1。3個配合物在 波長小于400nm范圍內都具有很強的吸收帶，這應該歸屬于配體分子內的電荷轉移（ILCT) 和配體間的電荷轉移(LLCT)。由于BTPhen配體比PBT配體的π共輒結構要大，所以在該區域 內 Ir(btphen)2(bpyC00H)的吸收也要強于Ir(pbt)2(hmbpy)。11"(1^卩11611)2(^卩5^00!1)在450 ~600nm和11'(口131:)2(1111^口5〇在400~50〇111]1波長范圍內的弱吸收帶是銥（111)配合物典型的 金屬到配體的電荷轉移(MLCT)吸收帶。顯然，1+2(即Ir(btphen)2(bpy⑶0H)與Ir(pbt)2 (hmbpy)的混合物）的吸收基本上是兩個配合物的疊加，而兩者偶聯成的探針 IrbtphenCOOIrpbt吸收卻與之有些不同，吸收強度整體要弱于1+2的混合物。由于Ir(pbt)2 (hmbpy)的MLCT吸收帶非常弱，對應區域Ir(btphen)2(bpyC00H)卻具有很強的π-!!*吸收，所 以IrbtphenCOOIrpbt可以看到明顯的Ir(btphen)2(bpyC00H)特征性MLCT吸收帶，但不應忽 略11'(口131：)2(1111^口5〇對應的此0'吸收帶并未消失。
[0073] Ir(btphen)2(bpyC00H)和Ir(pbt)2(hmbpy)分別發射近紅外光和黃光，其中 Ir (pbt)2(hmbpy)具有527和563nm兩個發射峰，與文獻中報道的同主配體Ir(III)配合物相 似，對應金屬到C~N和N~N配體的3MLCT躍迀；而Ir(btphen)2(bpyC00H)只觀察到一個發射 峰，為金屬到低能量的C~N配體的躍迀。41 lnm激發下，IrbtphenCOOIrpbt在黃光區的發射要 低于11'化131：)2(1111^口7)，而在近紅外區域的發射略高于11'(1^口11611)2(^口7〇)0!〇，說明兩個磷 光團間存在一定的能量轉移。兩個磷光團的發光強度和量子效率具有很大差別，Ir(pbt) 2 (hmbpy)磷光效率很高，C>em為37.8% ;而近紅外發光的Ir(btphen)2(bpyC00H)發光量子效 率只有4.0%。這對單激發雙發射探針的應用帶來了某些不利。但Ir(pbt) 2(hmbpy)激發態 能量較高且配體屏蔽作用較小，發光強度對〇2敏感性要遠大于11*(1^?11611)2(^?7〇)0!〇。基于 此，雙發射探針Irbtphen⑶OIrpbt有望用作發光比率型的0 2傳感探針。為此，我們測量了 IrbtphenCOOIrpbt在不同空氣含量的乙腈溶液中的發光。結果顯示隨著乙腈中空氣含量的 增加，IrbtphenCOOIrpbt在黃光區的發射強度急劇降低，下降93% ;在近紅外區發光降低了 88%。空氣含量低于60%時，1525/1705(525和705nm處的發光強度比）隨空氣含量滿足 Stern-Volmer 關系。
[0074] 實驗例2
[0075] 親脂性測定：Ir(btphen)2(bpy⑶OH) (1)、Ir(pbt)2(hmbpy) (2)和雙發射探針 IrbtphenC00Irpbt(3)的親脂性用正辛醇-水分配系數即LogPo/w表征，采用傳統的搖瓶法在 正辛醇-PBS(pH 7.4)體系中測定。PBS和正辛醇在振蕩器上劇烈振蕩24小時使兩相充分混 合，靜置24小時得到正辛醇飽和的PBS相(w相)和PBS飽和的正辛醇相(〇相）。將過量的待測 化合物溶于正辛醇相，劇烈搖晃24小時得到飽和溶液，濃度定義為Co。取適量的此飽和溶液 和等體積的PBS相混合，劇烈振蕩24小時是待測物在兩相中分配平衡。此時正辛醇相中化合 物濃度為Co'。正辛醇-水分配系數LogPo/w可根據公式:1^^。/?=1<^[(：。'/((^。-(：。'）]計算。 化合物濃度采用焚光分光光度計測量，11'(口131:)2(1111^。5〇和11'1^。1161^001印131: :6141111111， em 526;Ir(btphen)2(bpyC00H):ex 504nm，em 708nm。此實驗平行進行三次獲得均值Mean 和標準偏差SD，結果表示為Mean 土 SD。
[0076] 細胞毒性MTT實驗：Ir(btphen)2(bpy⑶0H)、Ir(pbt)2(hmbpy)和雙發射探針 IrbtphenCOOIrpbt對HeLa細胞的毒性通過MTT實驗測定。指數生長期HeLa細胞接種在 Corning 96孔板上，密度約1 X 104細胞/孔，37°C、5%⑶2條件下在含10%FBS和1 %雙抗的 DMEM培養基中培養24小時。小心棄去培養基，滅過菌的roS漂洗三遍，每孔中加入lml含100 ~3.13μΜ的上述3種配合物的DMEM/FBS培養基，繼續培養24小時。對照孔加入lml不含化合 物的DMEM/FBS培養基。而后每孔中加入200μ1 MTT的roS溶液（5mg/ml)并孵育4小時。吸棄 MTT溶液后，每孔加入150μ1 DMS0,在37°C水浴鍋中孵育15分鐘。在PerkinEmler Victor X4 酶標儀上測量每孔的0D490。以對照孔為100%細胞存活率用SPSS18軟件計算IC50。每個化 合物測定三次確定平均值Mean和標準偏差SD。
[0077]我們用搖瓶法測定了三個配合物在正辛醇-PBS體系中親脂性，結果見表1 dr (btphen)2(bpyC00H)和Ir(pbt)2(hmbpy)偶聯成酯后親脂性明顯加強，盡管偶聯后所帶電荷 增多。MTT法測定的IC 5Q顯示隨著配合物親脂性的增加，其細胞毒性也在增強。結果顯示 IrbtphenCOOIrpbt 具有較強的毒性，IC5q 為 30 · 2 ± 2 · 9μΜ。
[0078] 表1各配合物的光物理性質及親脂性和細胞毒性數據匯總
[0079]
[0080] 實驗例3
[0081 ] 細胞染色成像實驗:HeLa細胞以1~2 Χ104細胞/皿的密度接種在35mm Corning細 胞培養皿中，37 °C、5%C02條件下培養24小時后，用含IrbtphenCOOIrpbt (20μΜ)或 IrbtphenC00Irpbt(10yM)/Mit〇Tmcker?Red RM(200nM)的DMEM/FBS培養基染色30分鐘。吸 棄染色培養基，PBS洗滌三次后于新鮮培養基中在Nikon A1R激光共聚焦顯微鏡下用40倍鏡 頭分別用FITC通道和Cy5通道觀察拍照。
[0082] 鑒于Irbtphen⑶OIrpbt具有較強的細胞毒性，用ΙΟμΜ的濃度染色HeLa細胞半小 時，然后拿到激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察。結果顯示，和單電荷陽離子型Ir(III)配合物 類似，雙電荷的IrbtphenCOOIrpbt也能很容易的進入細胞并分布于細胞漿中，主要集中在 核周圍區域但沒有進入細胞核。
[0083] IrbtphenCOOIrpbt具有多電荷和較強親脂性等線粒體定位探針的屬性，細胞成像 結果也顯示其在細胞漿內具有線粒體特征性的點狀分布。我們將其和線粒體靶向染料Mi to Tr:acker?_Red共染細胞以確定IrbtphenCOOIrpbt是否定位于線粒體。用488nm激發收集FITC 通道和Cy5通道圖像，兩通道顯示的都是IrbtphenCOOIrpbt的成像；用561nm激發收集Cy5通 道圖像，此圖像包含了 Irbtphen⑶OIrpbt近紅外部分的發光和MitoTracker^ Red的發光。 488nm激發的FITC通道和561nm激發的Cy5通道發光區域能較好地重疊在一起，說明 IrbtphenCOOIrpbt主要布局于線粒體中（如圖7和圖8所示）。
[0084] 通過將黃光Ir(III)配合物Ir(pbt)2(hmbpy)和近紅外發光Ir(III)配合物Ir (btphen)2(bpyC00H)偶聯獲得了單激發雙發射的磷光探針IrbtphenCOOIrpbt。光譜表征發 現該探針很好地保留了兩個磷光團的吸收和發光性質。〇2敏感性發射光譜表明在低氧含量 下，1525/1705發光強度比與〇2分壓成線性相關，符合Stern-Volmer關系，有望用于磷光比 率型0 2傳感和成像。利用搖瓶法測定了其在正辛醇-水體系中的分配系數，表明 IrbtphenCOOIrpbt具有較強的親脂性。MTT分析顯示出該探針對HeLa細胞具有較強的毒性， IC50為30.2 ± 2.9μΜ。細胞染色實驗證實了該探針能夠進入細胞并分布于胞漿核周圍區域。 與線粒體革G向性染料Mi toTrackgr? Red共染成像顯示IrbtphenCOOIrpbt在胞衆中主要定位 于線粒體。綜上，我們初步獲得了具有〇2傳感性和線粒體定位的單激發雙發射磷光探針。 [0085]上述實施例只為說明本發明的技術構思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術的人 士能夠了解本發明的內容并據以實施，并不能以此限制本發明的保護范圍，凡根據本發明 精神實質所作的等效變化或修飾，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種雙核環金屬銥配合物，其特征在于，它的化學結構通式為：,-? 式中：分別為以C、N原子為配位原子的雙齒配體，其相互獨立地具 有以下結構：R R4中R為氣原子、烷基、烷氧基、焼硫基、烷基氣基、芳基、芳氧 基、芳硫基、芳基氣基、芳基烷基、芳基烷氧基、芳基焼硫基、芳基烷基氣基、醜基、醜氧基、醜 胺基、亞氨基或羧基;X為(：1、8廠1、？?6、8?4或(0?33〇2)爪11和111相互獨立地為1~6的整數。2. 根據權利要求1所述的雙核環金屬銥配合物，其特征在于:所述和:^^: 相互獨立地y3. 根據權利要求2所述的雙核環金屬銥配合物，其特征在于:所述 相互獨立地爻4. 根據權利要求1所述的雙核環金屬銥配合物，其特征在于:所述X為Cl或PF6，n和m相互 獨立地為1~3的整數。5. 根據權利要求1所述的雙核環金屬銥配合物，其特征在于，它的化學結構通式為：6. -種權利要求1至5中任一所述雙核環金屬銥配合物的制備方法，其特征在于，它包 括以下步驟： (a)在將：分別與IrCl3溶于第一混合溶劑中，進行加熱回流反應，冷卻 后過濾收集沉淀令(b對溶于第二混合溶劑中，進行回流反應， 過濾旋干后過柱子：(c) )于第二混合溶劑中，進行 加熱回流反至溶液透明，過柱子猬 .·、，· ?.... (d) 彳進行酯化反應即可， 或者向產物中滴入ΝΗ4Χ溶液析出產品后過柱子即可。7. 根據權利要求6所述雙核環金屬銥配合物的制備方法，其特征在于:步驟(a)中，所述 第一混合溶劑為乙二醇乙醚與水組成的混合溶劑；回流溫度為100~150°C，回流時間為10~ 15小時;|^1|:1與&(：13反應冷卻后減壓抽濾收集沉淀，依次用水、乙醇、丙酮分別洗滌多 次;:€^1^與IrCl3 S應冷卻后加 Λ?量:稀&酸，?濾收集沉淀，依次用水、1醇分別洗滌 多次。8. 根據權利要求6所述雙核環金屬銥配合物的制備方法，其特征在于:所述步驟(d)中， 在惰性氣體條件下、碳酸二月 桂酯和4-二甲氨基吡啶溶于二甲基甲酰胺中，在室溫下攪拌反應10~15小時。9. 根據權利要求6所述雙核環金屬銥配合物的制備方法，其特征在于:所述第二混合溶 劑為二氯甲烷和甲醇的混合溶液。10. 權利要求1至5中任一所述雙核環金屬銥配合物作為單激發雙發射的磷光探針在熒 光細胞成像中的應用。
【文檔編號】G01N21/64GK105949246SQ201610531906
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年7月8日
【發明人】劉揚, 張慶慶, 周明
【申請人】蘇州納凱科技有限公司