一種先導化合物及其在制備抗去勢抵抗性前列腺癌藥物中的用圖
【專利摘要】本發明提供了一種先導化合物及其在制備抗去勢抵抗性前列腺癌藥物中的用途，屬于生化制藥技術領域。本發明對FKBP51和FKBP52蛋白進行高通量虛擬篩選，并對所得的化合物在分子、細胞及動物個體水平上驗證其有效性，對最終遴選出的有開發前景的先導化合物作用于CRPC的分子機制進行探討，為CRPC的治療提供一種新的更為有效的途徑。
【專利說明】
一種先導化合物及其在制備抗去勢抵抗性前列腺癌藥物中的 用途
技術領域
[0001] 本發明屬于生化制藥技術領域，具體地涉及一種具有抗前列腺癌活性的先導化合 物及其在制備抗去勢抵抗性前列腺癌藥物中的用途。
【背景技術】
[0002] 前列腺癌在歐美等發達國家是男性癌癥死亡的第二大原因，而在中國前列腺癌的 發生以及死亡率也不斷攀升。雄激素受體(androgen receptor，AR)被認為在前列腺癌的發 生、發展和轉移中起到關鍵作用。因此，雄激素撤除療法(androgen deprivation therapy) 成為治療晚期前列腺癌的最常用和有效的方法。但是在治療的兩到三年內，大部分晚期前 列腺癌就會發展成去勢抵抗性前列腺癌(CRPC)。對于CRPC目前缺乏有效治療手段，成為前 列腺癌治療中最為棘手的問題。
[0003] 多項研究表明，AR信號通路在去勢環境中的再激活是CRPC的發生的主要原因，而 局部雄激素的合成以及AR的基因突變、倍增及可變剪切都是導致AR的再激活因素。目前針 對CRPC的藥物研發的思路主要是更進一步的降低雄激素的濃度或設計出更強效的抗雄激 素，但是這些方法都對AR的基因突變和可變剪切產物無效。而免疫親和蛋白FKBP51和 卩1(1^52作為協同分子伴侶(〇〇〇1^口61'〇116)，與!18口90-起幫助41?的正確折疊，為41?發揮功能 所必需，通過抑制FKBP51/FKBP52可以達到降低AR、AR突變體及可變剪切產物的轉錄活性的 效果。
[0004] FKBP51與FKBP52蛋白屬于免疫親和蛋白家族，兩者有70%的序列相似性，且都具 有順脯氨酸異構酶活性(PPIase)。二者結構非常類似，都包括N端的FK506結合結構域，這 個結構域具有PPIase活性，通常被稱為FK1結構域。鄰接FK1結構域的是FK2結構域，它與FK1 結構域約有19%的序列相似度，不能結合?1(506。(]端是11^(丨61^31：1'；[00卩6卩1:丨(16代卩631:)結 構域，它介導FKBP5UFKBP52與Hsp90C端相互作用。FKBP51在大多數細胞中是抑制類固醇受 體的信號轉導，而FKBP52能夠促進類固醇受體的信號轉導。FKBP51、FKBP52都對AR的激活起 到正調控作用。FKBP52對AR的激活至關重要，但是不會改變AR對雄激素的結合，因此，對 FKBP5 2功能的抑制能夠減少AR、AR突變體及其可變剪切產物的激活，這對CRPC的靶向治療 有重大意義。
[0005] 對FKBP5UFKBP52基因敲除小鼠的研究進一步表明，特異性的阻斷或抑制FKBP51、 FKBP52的功能不會產生潛在的副作用。此外，對已經進入臨床一期試驗FKBP家族的廣譜抑 制劑FK1706(所抑制的靶點包括FKBP51和FKBP52)的毒理學研究結果表明，即使長時間的抑 制FKBP51與FKBP52的活性不會對人體造成非常嚴重的后果。由此可見，FKBP51、FKBP52是 CRPC治療的非常有前景的藥物靶點。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是提供一種先導化合物及其篩選方法和在制備抗去勢抵抗性前列 腺癌藥物中的應用。為了實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：
[0007] 一種先導化合物，具有式(I)的化學結構：
[0010]本發明還提供了所述先導化合物的篩選方法，包括以下步驟：
[0011] (1)高通量虛擬篩選
[0012]利用薛定諤程序包進行高通量虛擬篩選，從蛋白質結構數據庫PDB分別下載 FKBP51和FKBP52的FK1結構域的晶體結構（PDB code: 305R和1N4A)，對結構進行優化、加電 荷與氫原子，選取其FK506結合口袋，利用分子對接程序Glide，從Chemdiv公司所提供的的 150多萬個化合物中進行高通量虛擬篩選，利用QikProp計算所篩選的小分子先導化合物的 物化性質，如脂水分配系數QPl〇gP〇/w，按照利賓斯基規則(Lipinski' srule)篩選出對接得 分最好的前150個小分子先導化合物，并從Chemdiv公司購買小分子先導化合物；
[0013] (2)熒光淬滅實驗
[0014] FKBP51/FKBP52的FK1結構域只含有一個色氨酸且恰好位于FK506結合口袋，由于 Trp在蛋白質中有很強的自發熒光，而且其發射光譜的強度與波長受到周圍化學微環境的 影響，因此可以通過監測Trp發射光譜的淬滅程度來測量FK1與小分子先導化合物的結合強 弱，將純化好的FK1蛋白濃度設定在ΙΟμΜ，小分子先導化合物終濃度100μΜ，反應體系100yL， 利用Thermo公司的Varioskan Flash多功能酶標儀以96孔板格式測量小分子先導化合物對 FK1的Trp熒光的淬滅程度，激發波長設為295nm，發射波長設為335nm，每種小分子先導化合 物平行做三次，以雷帕霉素作為對照，對于熒光淬滅程度高于雷帕霉素或與其相當的小分 子先導化合物，利用PerkinElmer公司LS55熒光分光光度計進一步測量其解離常數Kd，FKl 的濃度設為1〇μΜ，小分子先導化合物的濃度在0-100μΜ之間設置梯度，每個小分子先導化合 物平行做三次，對所得數據利用Prism程序進行非線性擬合，求得解離常數Kd;
[0015] (3)蛋白的表達與純化
[0016] 全基因合成FKBP51/FKBP52的FK1結構域(19-126)并分別克隆到pET28b載體中，用大 腸桿菌菌株BL21(DE3)或R〇SSeta(DE3)進行表達，用鎳柱純化進行粗純化，然后用陰離子或陽 離子交換柱純化，最后用分子篩superdex75柱純化，同時構建不帶Histag的FKBP51-FK1和 FKBP52-FK1，利用它們等電點大于8的性質，使用陽離子交換柱SPFF進行粗純化，再用分子篩 superdex75柱純化，純化好的蛋白濃縮到40mg/mL后分裝，用液氮速凍后置于-80 °C冰箱保存； [0017] (4)表面等離子共振(SPR)實驗
[0018]利用SPR技術定量測定FK1與小分子化合物之間相互作用的強弱，用氨基偶聯法將 FK1偶聯到CM5芯片或利用FK1上的Histag將其偶聯到NTA芯片上，選取響應較好的芯片進行 測定，以NaOH或HC1或EDTA為芯片再生條件，選取最優的再生條件進行循環測定；
[0019] (5)細胞及生化實驗
[0020] 利用MTT/MTS實驗（Promega)測定小分子化合物對前列腺癌細胞LNCaP、PC3及 DU145的生長抑制作用；對于能夠較強抑制LNCaP，但對PC3和DU145基本不抑制的小分子先 導化合物，繼續以下幾種方法驗證其對AR信號通路的抑制:①抽提細胞的總mRNA，用熒光定 量RT-PCR技術檢測篩選的小分子化合物對?0?51、？0?52、41?及41?下游調控基因如？3八、 hK2、TMPRSS2的轉錄水平的影響；②用AR及PSA的特異性抗體，通過Western blot技術檢測 篩選的小分子化合物對AR及下游基因 PSA在翻譯水平的影響；③用慢病毒轉染構建穩轉 ARELuc和ARE-EGFP的LNCaP細胞系，分別用Luciferase酶活報告系統以及熒光顯微鏡定量 研究篩選的小分子化合物對AR轉錄活性的抑制作用;④共慢病毒轉染構建穩轉CRPC剪切 子AR-V7及AR-NTD的DU145細胞系，即DU145-V7和DU145-NTD，用熒光定量RT-PCR技術及 Western blot技術檢測篩選的小分子化合物對AR活性的抑制；
[0021] (6)蛋白的結晶與結構解析
[0022]對FKBP51/FKBP52的FK1蛋白與篩得的小分子先導化合物共結晶，篩選各種結晶條 件，獲得高衍射質量的晶體，利用同步輻射光源收集X射線晶體衍射數據，使用分子置換法 解析FK1與小分子先導化合物復合物的晶體結構；
[0023] (7)結構分析與分子動力學模擬
[0024] 軟件分析FK1與小分子先導化合物復合物的晶體結構，比較FKBP51與FKBP52在結 合不同小分子先導化合物時結構的變化，使用Amber 14的GPU版本進行FK1-小分子先導化合 物復合物的分子動力學模擬，用mmpbsa方法計算小分子先導化合物與FK1結合的自由能，利 用Ambertools軟件包中的程序分析構象變化及蛋白與小分子先導化合物的相互作用模式， Amber 14的GPU版本使用Nvidia公司的GTX970顯卡進行計算，通過以上的結構分析，總結FK1 與小分子先導化合物的作用規律，為先導化合物的進一步改造提供指導；
[0025] (8)CRPC 動物實驗
[0026] 具體CRPC動物模型建立:將5-9周的雄性免疫缺陷小鼠分成兩組，其中一組為實驗 組進行去雄，恢復5天后將LNCaP細胞（IX 106個)皮下注射于完整或去雄的免疫缺陷小鼠 (BALB/C-nunu)，實時觀察腫瘤大小生長，并且每周2-3次用數字卡尺稱量小鼠體重和腫瘤 體積(寬 2X長/2)，以平均腫瘤體積作為參考，腫瘤生長8周并且腫瘤大小達到lcm3即為成功 建立的移植瘤模型;在CRPC動物模型的基礎上，再分為不同的給藥組，化療藥物組:多西他 賽，卡巴多賽;抑制雄激素合成藥物組:阿比特龍組;與雄激素競爭性抑制AR活性藥物恩雜 魯胺；以及小分子先導化合物組，每組7只小鼠，連續28天給藥1，10,或者50mg/kg的藥物， 并設空白對照，通過測量腫瘤大小的變化，稱取瘤重，計算抑瘤率，比較動物存活天數，及小 動物活體熒光成像系統，評估小分子先導化合物對CRPC小鼠的腫瘤的影響，觀察結束后，處 死動物，取移植瘤組織，CRPC模型小鼠加藥后與未加藥以及PCa小鼠進行AR靶向基因 PSA和 下游相關基因如TMPRSS2表達做對比；藥物作用后仍發生轉移性的CRPC小鼠與未用藥發生 癌轉移CRPC小鼠以及PCa小鼠成活率進行比較。
[0027] 本發明還提供了式I化合物在制備治療去勢抵抗性前列腺癌的藥物中的用途。 [0028] 本發明的有益技術效果：（1)已知的對于FKBP5UFKBP52的藥物發現的主要思路是 基于FK506與雷帕霉素的分子改造，但是，基于FK506和雷帕霉素設計出的FKBP51/FKBP52的 抑制劑往往與FKBP12的結合能力更強，因此所得到的化合物可能會有很強的脫靶效應，本 發明首次以FKBP51和FKBP52蛋白為靶點，高通量虛擬篩選抗前列腺癌的新型先導化合物， 并在分子水平、細胞水平與動物個體水平驗證這些先導化合物的有效性；（2)雖然CRPC顯現 出對雄激素撤除的抵抗性，但它的進展通常仍依賴于AR，FKBP51、FKBP52作為協同分子伴 侶，為AR激活所必需，通過建立CRPC的細胞模型與小鼠模型，本發明首次研究了篩選得到的 先導化合物對CRPC的作用效果和機制；（3)通過解析靶蛋白與先導化合物結合的晶體結構， 分析靶蛋白與先導化合物的結合模式，總結結合規律，并通過分子動力學模擬方法，研究先 導化合物對FKBP51、FKBP52的構象的影響，為今后的藥物結構改造提供了基礎。
【附圖說明】
[0029] 圖1為FKBP51和FKBP52的結構。（A)FKBP51與FKBP52蛋白的結構域組成；（B) FKBP51的FK1結構域與FK506的相互作用方式。
[0030] 圖2為FK1結構域與小分子化合物的分子對接。(A)(B)分別是對接構象分別與晶體 結構4DRK、4JFK的疊合情況。
[0031]圖3為FKBP51與小分子化合物的相互作用。(A)用陽離子交換純化獲得的FKBP51的 FK1結構域，FK1的分子量約為14KDa;(B)購買的150種小分子化合物對FK1的熒光淬滅實驗， 紅色為正對照雷帕霉素(a)，綠色為不含小分子化合物的buffer(b)。
[0032] 圖4為FKBP51蛋白分子篩(FPLC)純化結果。（A)用HiLoad 16/60Superdex75柱子凝 膠過濾純化獲得的FKBP51蛋白；（B) 15 % SDS-PAGE的FKBP51電泳圖。
[0033]圖5為小分子先導化合物與FKBP51濃度依賴的熒光淬滅實驗。分別用10,20,50， 80，100μπι小分子先導化合物濃度與20ymFKBP51發生熒光淬滅反應得到結合曲線圖，其中， compound5為本發明的小分子化合物。
[0034]圖6為小分子先導化合物篩選的技術路線圖。
[0035]圖7為小分子先導化合物對CRPC的作用及機理的技術路線圖。
【具體實施方式】
[0036]下面結合具體實施例與【附圖說明】對本發明作進一步闡述，但本發明并不限于以下 實施例。
[0037] 實施例1
[0038]先導化合物的化學結構：
[0041] 1、具有式(I)化學結構的先導化合物的高通量虛擬篩選方法
[0042] 利用薛定諤程序包進行，從蛋白質結構數據庫roB分別下載FKBP51和FKBP52的FK1 結構域的晶體結構（PDB code:305R和 1N4A)，使用Prime，QSite，Liasion and MacroModel 等程序對結構進行優化、加電荷與氫原子，選取其FK506結合口袋，利用分子對接程序 G1 ide，從Chemdiv公司所提供的的150多萬個化合物中進行高通量虛擬篩選，篩選在4核CPU 的服務器上進行，每天大約可以篩選10萬個化合物，利用QikProp計算所篩選的小分子先導 化合物的物化性質如脂水分配系數QPl〇gP〇/w等，按照利賓斯基規則(Lipinski' s rule)篩 選出docking-score最好的前150個小分子先導化合物。利賓斯基規則包括:①化合物的分 子量小于500Da;②化合物結構中的氫鍵給體(包括羥基、氨基等）的數量不超過5個;③化合 物中氫鍵受體的數量不超過10個;④化合物的脂水分配系數的對數值(logP)在-2到5之間。 符合利賓斯基規則的化合物有更好的藥代動力學特性，在代謝過程中有更好的生物利用 度，易于成為口服藥。小分子先導化合物在Chemdiv公司購買。
[0043] 2、熒光淬滅實驗
[0044] FKBP51/FKBP52的FK1結構域只含有一個色氨酸且恰好位于FK506結合口袋，由于 Trp在蛋白質中有很強的自發熒光，而且其發射光譜的強度與波長受到周圍化學微環境的 影響，因此可以通過監測Trp發射光譜的淬滅程度來測量FK1與小分子先導化合物的結合強 弱，將純化好的FK1蛋白濃度設定在10μΜ，小分子先導化合物終濃度100μΜ，反應體系100yL， 利用Thermo公司的Varioskan Flash多功能酶標儀以96孔板格式測量小分子先導化合物對 FK1的Trp熒光的淬滅程度，激發波長設為295nm，發射波長設為335nm，每種小分子先導化 合物平行做三次，以雷帕霉素作為對照，對于熒光淬滅程度高于雷帕霉素或與其相當的小 分子先導化合物，利用PerkinElmer公司LS55熒光分光光度計進一步測量其解離常數Kd， FK1的濃度設為10μΜ，小分子先導化合物的濃度在0-100μΜ之間設置梯度，每個小分子先導 化合物平行做三次，對所得數據利用Prism程序進行非線性擬合，求得解離常數Kd。
[0046] 3、蛋白的表達與純化
[0047] 全基因合成FKBP51/FKBP52的FK1結構域（19-126)并分別克隆到pET28b載體中，用 大腸桿菌菌株BL21(DE3)或R〇SSeta(DE3)進行表達，用鎳柱純化進行粗純化，然后用陰離子 或陽離子交換柱純化，最后用分子篩superdeX75柱純化。同時構建不帶Histag的FKBP51-FK1和FKBP52-FK1，利用它們等電點較高（大于8)的性質，使用陽離子交換柱SPFF進行粗純 化，再用分子篩superdex75柱純化。純化好的蛋白濃縮到40mg/mL后分裝，用液氮速凍后置 于-80°C冰箱保存。
[0048] 4、表面等離子共振(SPR)實驗
[0049]我們利用SPR技術更精確的定量FK1與小分子化合物之間相互作用的強弱。用氨基 偶聯法將FK1偶聯到CM5芯片或利用FK1上的Histag將其偶聯到NTA芯片上，最后選取響應較 好的芯片進行測定，選擇各種不同的芯片再生條件，如Na0H、HCl、EDTA等，最后選取最優的 再生條件。
[0050] 5、細胞及生化實驗
[0051 ] 利用MTT/MTS實驗（Promega)測定小分子化合物對前列腺癌細胞LNCaP、PC3及 DU145的生長抑制作用。對于能夠較強抑制LNCaP，但對PC3和DU145基本不抑制的小分子先 導化合物，繼續以下幾種方法驗證其對AR信號通路的抑制:①抽提細胞的總mRNA，用熒光 定量RT-PCR技術檢測篩選的小分子化合物對?0?51、？0?52)1?及41?下游調控基因如？3八、 hK2、TMPRSS2等的轉錄水平的影響；②用AR及PSA的特異性抗體，通過Western blot技術檢 測篩選的小分子化合物對AR及下游基因 PSA在翻譯水平的影響；③用慢病毒轉染構建穩轉 ARELuc和ARE-EGFP的LNCaP細胞系，分別用Luciferase酶活報告系統以及熒光顯微鏡定量 研究篩選的小分子化合物對AR轉錄活性的抑制作用;④共慢病毒轉染構建穩轉CRPC剪切子 AR-V7及AR-NTD的DU145細胞系，即DU145-V7和DU145-NTD，用熒光定量RT-PCR技術及 Western blot技術檢測篩選的小分子化合物對AR活性的抑制。
[0052] 6、蛋白的結晶與結構解析
[0053]我們對FKBP51/FKBP52的FK1蛋白嘗試與篩得的小分子先導化合物共結晶，篩選各 種結晶條件（如Hampton公司的ScreenI&ScreenII，SaltRX，Index，PEGion和MiTeGen公司的 JBScreen Classic等條件），嘗試并改進各種沉淀劑、緩沖劑和添加劑，以獲得高衍射質量 的晶體。利用同步輻射光源收集X射線晶體衍射數據，利用HKL2000，CCP4及Phenix等軟件， 使用分子置換法解析FK1與小分子先導化合物復合物的晶體結構。
[0054] 7、結構分析與分子動力學模擬
[0055 ]使用Pymo 1、L i gp 1 〇 t等軟件分析FK1與小分子先導化合物復合物的晶體結構，比較 FKBP51與FKBP52在結合不同小分子先導化合物時結構的變化，使用Amberl4的GPU版本進行 FK1-小分子先導化合物復合物的分子動力學模擬，用mmpbsa方法計算小分子先導化合物與 FK1結合的自由能，利用Ambertools軟件包中的程序分析構象變化，蛋白與小分子先導化合 物的相互作用模式等，Amberl4的GPU版本（即CUDA版本)使用Nvidia公司的GTX970顯卡進 行計算，經過我們的前期測試，發現其計算能力相當于64核的計算機集群。通過以上的結構 分析，總結FK1與小分子先導化合物的作用規律，為先導化合物的進一步改造提供指導。
[0056] 8、CRPC動物實驗
[0057] 具體CRPC動物模型建立:將5-9周的雄性免疫缺陷小鼠分成兩組，其中一組為實驗 組進行去雄，恢復5天后將LNCaP細胞（IX 106個)皮下注射于完整或去雄的免疫缺陷小鼠 (BALB/C-nunu)，實時觀察腫瘤大小生長，并且每周2-3次用數字卡尺稱量小鼠體重和腫瘤 體積（寬2X長/2)，以平均腫瘤體積作為參考。腫瘤生長8周左右并且腫瘤大小達到lcm3即 為成功建立的移植瘤模型。在CRPC動物模型的基礎上，再分為不同的給藥組。化療藥物組： 多西他賽，卡巴多賽;抑制雄激素合成藥物組:阿比特龍組;與雄激素競爭性抑制AR活性藥 物恩雜魯胺；以及小分子先導化合物組，每組7只小鼠，連續28天給藥1，10,或者50mg/kg的 藥物，并設空白對照，通過測量腫瘤大小的變化，稱取瘤重，計算抑瘤率，比較動物存活天 數，及小動物活體熒光成像系統，評估小分子先導化合物對CRPC小鼠的腫瘤的影響，觀察結 束后，處死動物，取移植瘤組織，CRPC模型小鼠加藥后與未加藥以及PCa小鼠進行AR靶向基 因 PSA和下游相關基因如TMPRSS2表達做對比;藥物作用后仍發生轉移性的CRPC小鼠與未用 藥發生癌轉移CRPC小鼠以及PCa小鼠成活率進行比較。
【主權項】
1. 一種具有式α)化學結構的先導化合物在制備前列腺癌腫瘤藥物中的用途，2. 權利要求1中所述先導化合物在制備治療去勢抵抗性前列腺癌藥物中的用途。3. 權利要求1中所述先導化合物的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 高通量虛擬篩選 利用薛定諤程序包進行高通量虛擬篩選，從蛋白質結構數據庫PDB分別下載FKBP51和 FKBP52的FK1結構域的晶體結構（PDB code:305R和1Ν4Α)，對結構進行優化、加電荷與氫原 子，選取其FK506結合口袋，利用分子對接程序G1 ide，從Chemdi v公司所提供的的150多萬個 化合物中進行高通量虛擬篩選，利用QikProp計算所篩選的小分子先導化合物的物化性質， 如脂水分配系數QPl〇gP〇/w，按照利賓斯基規則(Lipinski'srule)篩選出對接得分最好的 前150個小分子先導化合物，并從Chemdiv公司購買小分子先導化合物； (2) 熒光淬滅實驗 FKBP51/FKBP52的FK1結構域只含有一個色氨酸且恰好位于FK506結合口袋，由于Trp在 蛋白質中有很強的自發熒光，而且其發射光譜的強度與波長受到周圍化學微環境的影響， 因此可以通過監測Trp發射光譜的淬滅程度來測量FK1與小分子先導化合物的結合強弱，將 純化好的FK1蛋白濃度設定在ΙΟμΜ，小分子先導化合物終濃度100μΜ，反應體系100yL，利用 Thermo公司的Varioskan Flash多功能酶標儀以96孔板格式測量小分子先導化合物對FK1 的Trp熒光的淬滅程度，激發波長設為295nm，發射波長設為335nm，每種小分子先導化合物 平行做三次，以雷帕霉素作為對照，對于熒光淬滅程度高于雷帕霉素或與其相當的小分子 先導化合物，利用PerkinElmer公司LS55熒光分光光度計進一步測量其解離常數Kd，FKl的 濃度設為1〇μΜ，小分子先導化合物的濃度在0-100μΜ之間設置梯度，每個小分子先導化合物 平行做三次，對所得數據利用Prism程序進行非線性擬合，求得解離常數Kd; (3) 蛋白的表達與純化 全基因合成FKBP51/FKBP52的FK1結構域（19-126)并分別克隆到pET28b載體中，用大腸 桿菌菌株BL21(DE3)或R〇SSeta(DE3)進行表達，用鎳柱純化進行粗純化，然后用陰離子或陽 離子交換柱純化，最后用分子篩superdex75柱純化，同時構建不帶Histag的FKBP51-FK1和 FKBP52-FK1，利用它們等電點大于8的性質，使用陽離子交換柱SPFF進行粗純化，再用分子 篩superdex75柱純化，純化好的蛋白濃縮到40mg/mL后分裝，用液氮速凍后置于-80°C冰箱 保存； (4) 表面等離子共振(SPR)實驗 利用SPR技術定量測定FK1與小分子化合物之間相互作用的強弱，用氨基偶聯法將FK1 偶聯到CM5芯片或利用FK1上的Histag將其偶聯到NTA芯片上，選取響應較好的芯片進行測 定，以NaOH或HC1或EDTA為芯片再生條件，選取最優的再生條件進行循環測定； (5) 細胞及生化實驗 利用MTT/MTS實驗(Promega)測定小分子化合物對前列腺癌細胞LNCaP、PC3及DU145的 生長抑制作用；對于能夠較強抑制LNCaP，但對PC3和DU145基本不抑制的小分子先導化合 物，繼續以下幾種方法驗證其對AR信號通路的抑制:①抽提細胞的總mRNA，用熒光定量RT-PCR技術檢測篩選的小分子化合物對?0?51、？0?52、六1?及41?下游調控基因如？34、111(2、 TMPRSS2的轉錄水平的影響；②用AR及PSA的特異性抗體，通過Western blot技術檢測篩選 的小分子化合物對AR及下游基因 PSA在翻譯水平的影響;③用慢病毒轉染構建穩轉ARELuc 和ARE-EGFP的LNCaP細胞系，分別用Luciferase酶活報告系統以及熒光顯微鏡定量研究篩 選的小分子化合物對AR轉錄活性的抑制作用;④共慢病毒轉染構建穩轉CRPC剪切子AR-V7 及AR-NTD的DU145細胞系，即DU145-V7和DU145-NTD，用熒光定量RT-PCR技術及Western b 1 ot技術檢測篩選的小分子化合物對AR活性的抑制； (6) 蛋白的結晶與結構解析 對FKBP51/FKBP52的FK1蛋白與篩得的小分子先導化合物共結晶，篩選各種結晶條件， 獲得高衍射質量的晶體，利用同步輻射光源收集X射線晶體衍射數據，使用分子置換法解析 FK1與小分子先導化合物復合物的晶體結構； (7) 結構分析與分子動力學模擬 軟件分析FK1與小分子先導化合物復合物的晶體結構，比較FKBP51與FKBP52在結合不 同小分子先導化合物時結構的變化，使用Amberl4的GPU版本進行FK1-小分子先導化合物復 合物的分子動力學模擬，用mmpbsa方法計算小分子先導化合物與FK1結合的自由能，利用 Ambertools軟件包中的程序分析構象變化及蛋白與小分子先導化合物的相互作用模式， Amber 14的GPU版本使用Nvidia公司的GTX970顯卡進行計算，通過以上的結構分析，總結FK1 與小分子先導化合物的作用規律，為先導化合物的進一步改造提供指導； (8) CRRC動物實驗 具體CRPC動物模型建立:將5-9周的雄性免疫缺陷小鼠分成兩組，其中一組為實驗組進 行去雄，恢復5天后將LNCaP細胞（IX 106個)皮下注射于完整或去雄的免疫缺陷小鼠（BALB/ C-nunu)，實時觀察腫瘤大小生長，并且每周2-3次用數字卡尺稱量小鼠體重和腫瘤體積 (寬2X長/2)，以平均腫瘤體積作為參考，腫瘤生長8周并且腫瘤大小達到lcm 3即為成功建立 的移植瘤模型;在CRPC動物模型的基礎上，再分為不同的給藥組，化療藥物組:多西他賽，卡 巴多賽;抑制雄激素合成藥物組:阿比特龍組;與雄激素競爭性抑制AR活性藥物恩雜魯胺； 以及小分子先導化合物組，每組7只小鼠，連續28天給藥1，10,或者50mg/kg的藥物，并設空 白對照，通過測量腫瘤大小的變化，稱取瘤重，計算抑瘤率，比較動物存活天數，及小動物活 體熒光成像系統，評估小分子先導化合物對CRPC小鼠的腫瘤的影響，觀察結束后，處死動 物，取移植瘤組織，CRPC模型小鼠加藥后與未加藥以及RCa小鼠進行AR靶向基因 PSA和下游 相關基因如TMPRSS2表達做對比；藥物作用后仍發生轉移性的CRPC小鼠與未用藥發生癌轉 移CRPC小鼠以及PCa小鼠成活率進行比較。
【文檔編號】A61P13/08GK105949195SQ201610300718
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年4月26日
【發明人】王志平, 何永興, 武丹
【申請人】蘭州大學