用于在受試者的視網膜色素上皮中表達目的多核苷酸的方法和藥物組合物的制作方法【專利摘要】本發明涉及用于在受試者的視網膜色素上皮中表達目的多核苷酸的方法和藥物組合物。具體地說，本發明涉及用于在有此需要的受試者的眼中的視網膜色素上皮中選擇性表達目的多核苷酸的方法，其包括用一定量的含有所述目的多核苷酸的rAAV2/5載體轉導所述視網膜色素上皮的步驟。【專利說明】用于在受試者的視網膜色素上皮中表達目的多核苷酸的方法和藥物組合物
技術領域：
[0001]本發明涉及用于在受試者的視網膜色素上皮中表達目的多核苷酸的方法和藥物組合物。【
背景技術：
】[0002]遺傳性視網膜營養不良（inheritedretinaldystrophy，IRD)是一大群遺傳和臨床異質性疾病。它們以進行性視力喪失為特征，但是達到法定盲的年齡是可變的。雖然個體稀少，但是在總體上IRD影響全世界大約1/2000的個體(Berger等，2010)。IRD的最普遍形式是以視網膜感光細胞的變性和眼底上存在可見的色素沉積為特征的色素性視網膜病變群。一個良好的示例是無脈絡膜癥(CMHhCHM是占IRD2%的X連鎖色素性視網膜病變(Bocquet等，2013)。其特征為兒童期的夜盲癥，接著是導致到40至50歲年齡失明的進行性視野損失。CHM具有特征性表型，包括緊接視網膜之后的脈絡膜的色素沉積和脈絡膜毛細血管層的萎縮。存在單致病基因CHM，它編碼REP1，即Rab陪伴蛋白（escortprotein)1(Seabra等，1992)，一種普遍存在的伴侶蛋白（chaperonprotein)，其允許RabGTP酶的正確異戊二稀化和隨后遞送到它們的膜靶中。[0003]視網膜通常高度適于基因療法，因為i)它通過非侵入性途徑可及；ii)它小而封閉，從而允許使用低的載體劑量，以及iii)由視網膜色素上皮(RPE)和視網膜循環的無孔毛細血管的緊密連接構成的血視網膜屏障的存在防止滲漏到所述循環中并且使其被免疫豁免（：[1]11]11111〇11'；^;[]^6(1)(&316113等，2009)。這些積極屬性引發2008年對視網膜基因療法的首次臨床試驗（Bainbridge等，2008;Maguire等，2008)，之后很快進行了其它試驗(Bennett等，2012;Hauswirth等，2008;Jacobson等，2012;Maguire等，2009)。目標IRD，BP利伯氏先天性黑內障(Lebercongenitalamaurosis，LCA)由于編碼視覺周期的關鍵酶的RPE特異性基因RPE65的突變而引起(Marlhens等，1997)。使用重組腺相關病毒血清型2載體(AAV2/2)將RPE65成功運載到了RPE中。積極的結果提供了以下概念驗證（proof-in-principle):基因轉移可以改善視覺受損受試者的視力，并且促使研究人員鑒定最有效的載體，尤其是用于在PRE中表達目的多核苷酸的載體。【
發明內容】[0004]本發明涉及用于在受試者的視網膜色素上皮中表達目的多核苷酸的方法和藥物組合物。具體地說，本發明由權利要求限定。【具體實施方式】[0005]本發明人將來自cmr/y患者的REP1缺陷型成纖維細胞重編程為誘導性多能干細胞(iPSc)，使它們分化成視網膜色素上皮(RPE)。他們證明，這種iPSc衍生的RPE是具有典型形態的極化單層，表達特征標志物，具有流體運輸和吞噬作用的功能，并且模擬患者的生物化學表型。然后，本發明人測定了一組AAV載體血清型，并且首次證明AAV2/5對于人RPE細胞最有效(>60%轉導），并且CHM基因轉移可以使生物化學表型正常化。無可比擬的體外高轉導效率可能受助于吞噬作用，并且模擬了AAV載體在體內視網膜下間隙中所遇到的情形。本發明人由此證明了AAV2/5在人對照和CHMRPE中的優越性。[0006]因此，本發明的第一個方面涉及用于在有此需要的受試者的眼中的視網膜色素上皮中選擇性表達目的多核苷酸的方法，其包括用一定量的含有目的多核苷酸的rAAV2/5載體轉導視網膜色素上皮的步驟。[0007]本文使用的術語"受試者"或"有此需要的受試者"是指人。通常，受試者患有或可能患有影響視網膜色素上皮的視網膜疾病。因此，眾多種視網膜疾病可以由此通過考慮本文提供的教導而得以治療，并且通常包括遺傳性或非遺傳性視網膜變性、視網膜營養不良、色素性視網膜炎、黃斑變性、利伯氏先天性黑內障（LCA)、視錐-視桿營養不良（cone-roddystrophies)、眼的新生血管疾病、脈絡膜變性、脈絡膜硬化、糖尿病視網膜病變、增生性玻璃體視網膜病變、無脈絡膜癥、青光眼和代謝障礙如斯萊綜合征(Slysyndrome)(MPSVII，歸因于葡萄糖醛酸苷酶基因中的缺陷）和環狀萎縮(gyrateatrophy)(歸因于鳥氨酸-δ-轉氨酶基因中的缺陷，OAT)、視網膜脫離或損傷和視網膜病變(無論是遺傳性的，由手術、創傷、毒性化合物或毒性試劑誘導的，還是光誘導的）。[0008]因此，本發明的另一個目的是提供用于治療有此需要的受試者中的視網膜疾病的方法，其通過向所述受試者的眼中遞送包含目的多核苷酸的載體而實現，當所述多核苷酸在RPE細胞中表達時，對所述視網膜疾病具有有益效果。[0009]因此，本發明的另一個目的是提供用于治療有此需要的受試者中的視網膜疾病的方法，其通過向所述受試者的眼中遞送包含目的多核苷酸的載體而實現，當所述多核苷酸在RPE細胞中表達時，對所述視網膜疾病具有有益效果。[0010]本文使用的表達"目的多核苷酸"在本文中是指編碼任何多肽、結構蛋白、酶等的任何核苷酸序列，出任何種類的原因，所述核苷酸序列的表達是靶細胞中所需要的。它還可以是指非編碼序列，例如旨在降低基因表達的反義序列或者干擾RNA序列。本領域技術人員通過其領域中的科學文獻中的知識知道，哪些可能更適合于治療特定視網膜疾病的多核苷酸。[0011]利用本發明的rAAV2/5載體對眼的基因療法可以通過在RPE細胞中引入其中缺乏的目的多核苷酸(例如，基因）的功能性拷貝（基因替代療法），或者通過向RPE細胞中遞送將對待治療的眼病具有有益效果的目的多核苷酸(對癥療法)來進行。[0012]具體地說，多核苷酸產物是將提高視網膜色素上皮細胞的功能的多肽。可用于基因替代療法的目的多核苷酸的示例是特異性地或優先地在RPE細胞中表達的基因，如RGR(色素性視網膜炎，RP，染色體(chr.)10)、RDH5(白點狀眼底病，chr.l2)、RPE65(利伯氏先天性黑內障，LCA，chr.l)、RLBPl(RP，chr.l5)、MERTK(RP，chr.2)、LRAT(RP，chr.4)、REPl(無脈絡膜癥，Xp21)、RBP4(RPE變性，chr.10)，或者還在其它細胞類型中表達的基因，如MY07A(烏謝爾綜合征(Ushersyndrome)1型，chr·11)、EL0VL4(黃斑變性，chr.6)、EFEMP1(莫拉蒂致拉分提那斯病（MalattiaLeventinesedisease)，chr.15)、BEST1(貝斯特病（BestDisease)，chr.11)、TIMP3(索斯比眼底營養不良（Sorsby'sfundusdystrophy)，chr·22)、AIPL1(LCA，chr·7)和CRB1(RP，chr·1)。[0013]在一些實施方案中，多核苷酸是編碼REP1，即Rab陪伴蛋白-1的多核苷酸（即，CHM基因）。[0014]在一個特定實施方案中，目的多核苷酸可以編碼神經營養因子。本文使用的"神經營養因子"是具有諸如使神經細胞存活和維持、促進神經元分化的生理作用的蛋白質的通用術語。神經營養因子的示例包括但不限于bFGF、aFGF、BDNF、CNTF、IL-10、NT-3、IGF-II、⑶NF、NGF和RdCVF。[0015]在某些情況下，目的多核苷酸產物是提供基因功能的位點特異性敲低（knockdown)的位點特異性內切酶，例如，其中內切酶敲除與視網膜疾病有關的等位基因。例如，當顯性等位基因編碼在為野生型時是結構蛋白和/或提供正常視網膜功能的基因的缺陷拷貝時，位點特異性內切酶(如TAL核酸酶、大范圍核酸酶或鋅指核酸酶)可以靶向缺陷等位基因并且敲除缺陷等位基因。除了敲除缺陷等位基因以外，位點特異性核酸酶還可用于刺激與供體DNA的同源重組，所述供體DNA編碼缺陷等位基因所編碼的蛋白質的功能性拷貝。因此，例如，本發明方法可用于遞送敲除缺陷等位基因的位點特異性內切酶，并且可用于遞送缺陷基因的功能性拷貝，使缺陷等位基因修復，從而提供功能性視網膜蛋白的產生。在一些實施方案中，載體包含編碼位點特異性內切酶的多核苷酸；以及編碼缺陷等位基因的功能性拷貝的多核苷酸，其中所述功能性拷貝編碼功能性視網膜蛋白。適合使用的位點特異性內切酶包括例如鋅指核酸酶（ZFN)和轉錄激活子樣效應子核酸酶（transcriptiοηactivator-likeeffectornuclease，TALEN)，其中此類位點特異性內切酶是非天然存在的并且被修飾以靶向特定基因。可以改造此類位點特異性內切酶以切割基因組內的特定位置，然后非同源端連接可以插入或缺失幾個核苷酸的同時修復破裂。此類位點特異性內切酶(也稱為"INDEL"）然后將所述蛋白質扔出框架(outofframe)并且有效敲除所述基因。參見例如美國專利公開號2011/0301073。[0016]在一些實施方案中，多核苷酸產物是干擾RNA(RNAi)。[0017]本文使用的術語"AAV"具有其在本領域中的一般含義，且是腺相關病毒的縮寫，并且可用于指病毒本身或其衍生物。該術語涵蓋天然存在的和改造形式的所有血清型和變體。根據本發明，術語"AAV"是指AAV1型(AAV-1)、AAV2型(AAV-2)、AAV3型(AAV-3)、AAV4型(AAV-4)、AAV5型(AAV-5)、AAV6型(AAV6)、AAV7型(AAV-7)、AAV8型(AAV-8)和AAV9型(AAV-9)。各種AAV血清型的基因組序列以及天然末端重復(TR)、Rep蛋白和衣殼亞基的序列是本領域中已知的。此類序列可以在文獻和公眾數據庫如GenBank中找到。參見例如GenBank登錄號NC_001401(AAV-2)、AF043303(AAV-2)和NC_006152(AAV-5)。[0018]本文使用的"rAAV載體"是指包含用于RPE細胞的遺傳轉化的目的多核苷酸（即，異源多核苷酸）的AAV載體。rAAV載體含有5'和3'腺相關病毒反向末端重復（ITR)和目的多核苷酸，所述目的多核苷酸與調節其在靶細胞中的表達的序列可操作地連接。[0019]術語"AAV雜交載體"在本文中是指包含天然AAV衣殼的載體顆粒，其包含rAAV載體基因組和AAVRep蛋白，其中Cap、Rep和載體基因組的ITR來自至少2種不同的AAV血清型。本發明的雜交載體是rAAV2/5載體，其包含AAV-5衣殼和具有AAV-21TR的rAAV基因組。例如，可以通過用來自AAV-5的cap基因的序列替代AAV-2的cap基因而由AAV-2的cap基因得到cap基因，以這種方式使得所表達的蛋白質能夠形成AAV-5衣殼。[0020]本發明的rAAV2/5載體是使用本領域中已知的方法產生的。總之，所述方法一般涉及：（a)將rAAV載體引入到宿主細胞中，（b)將AAV輔助構建體引入到所述宿主細胞中，其中所述輔助構建體包含rAAV載體中缺失的病毒功能，以及(c)將輔助病毒引入到所述宿主細胞中。用于rAAV病毒粒子復制和包裝的所有功能都需要存在，以實現rAAV載體的復制和向rAAV病毒粒子的包裝。可以使用標準病毒學技術同時或依序實施向宿主細胞中的引入。首先，培養宿主細胞以產生rAAV病毒粒子，并且使用標準技術如CsCl梯度加以純化。可以使用已知方法如例如熱滅活使殘余輔助病毒活性滅活，然后將純化的rAAV病毒粒子準備用于所述方法。[0021]載體還可以包含允許表達和分泌編碼的蛋白質的調控序列，如例如啟動子、增強子、多腺苷酸信號、內部核糖體進入位點（IRES)、編碼蛋白質轉導結構域(PTD)的序列等。就此而言，載體包含與目的多核苷酸可操作地連接以引起或改善所述蛋白質在受感染細胞中的表達的啟動子區。此類啟動子可以是普遍存在的、組織特異性的、強的、弱的、受調節的、嵌合的、誘導型的等，以允許在受感染組織中有效和合適地產生所述蛋白質。啟動子可以與所編碼的蛋白質是同源的，或者異源的，包括細胞啟動子、病毒啟動子、真菌啟動子、植物啟動子或合成啟動子。用于本發明中的優選啟動子應當在RPE細胞中是功能性的。此類受調節啟動子的示例包括但不限于含Tet開/關元件的啟動子、雷帕霉素(rapamycin)誘導型啟動子和金屬硫蛋白啟動子。普遍存在的啟動子的示例包括病毒啟動子，特別是CMV啟動子、CAG啟動子(具有CMV增強子的雞β肌動蛋白啟動子）、RSV啟動子、SV40啟動子等，以及細胞啟動子，如PGK(磷酸甘油酸激酶)啟動子。啟動子還可以是神經特異性啟動子，如突觸蛋白或NSE(NeuronSpecificEnolase，神經元特異性稀醇化酶）啟動子(或位于普遍存在的PGK啟動子上游的NRSE(Neuronrestrictivesilencerelement，神經元限制性沉默元件）序列），或者對RPE細胞類型具有特異性的啟動子，如RPE65啟動子、BEST1啟動子、視紫紅質啟動子或視錐抑制蛋白啟動子。載體還可以包含miRNA的靶序列，以實現不期望細胞中轉基因表達的抑制。在特定實施方案中，載體包含前導序列，以允許分泌編碼的蛋白質。目的多核苷酸與編碼分泌信號肽(通常位于分泌的多肽的N末端）的序列的融合將允許產生可以從轉導細胞中分泌的形式的治療性蛋白質。此類信號肽的示例包括白蛋白、β-葡糖醛酸糖苷酶、堿性蛋白酶或纖連蛋白分泌信號肽。在最優選的實施方案中，啟動子在視網膜細胞中，特別是在視網膜的光感受器或神經節細胞中或在RPE中是特異性或功能性的，即，允許轉基因在所述細胞中（優先)表達。例如，合適的光感受器特異性調控元件包括例如視紫紅質啟動子、視紫紅質激酶啟動子(Young等(2003)Ophthalmol.Vis.Sci.44:4076);β磷酸二酯酶基因啟動子(Nicoud等（2007)J.GeneMecL9:1015);色素性視網膜炎基因啟動子(Nicoud等(2007)，同上）；光感受器間類維生素A結合蛋白（interphotoreceptorretinoid-bindingprotein，IRBP)基因增強子(Nicoud等（2007)，同上）；IRBP基因啟動子(Yokoyama等（1992)ExpEyeRes·55:225)〇[0022]載體的劑量可以根據疾病狀況、受試者（例如，根據其體重、代謝等）、治療方案等來調節。本發明上下文內的優選有效劑量是允許最佳轉導RPE細胞的劑量。通常，向小鼠中每劑量施用1〇8至1〇1()病毒基因組（vg)。通常，向人施用的AAV載體的劑量可以在101()至l〇12vg范圍。[0023]向受試者施用本發明載體可以通過直接視網膜、視網膜下或玻璃體內注射來進行。根據該方法，載體顆粒的施用優選地通過視網膜下遞送進行。[0024]在一些方面，本發明涉及含有編碼REP1的多核苷酸的rAAV2/5載體。在一些實施方案中，所述多核苷酸在CAG啟動子的控制下。所述載體特別適合于治療有此需要的受試者中的無脈絡膜癥。[0025]REP1的示例性氨基酸序列是SEQIDN0:6，并且REP1的示例性核酸序列是SEQIDN0:7〇[0026]SEQIDN0:6:NCBI參考序列：ΝΡ_001138886·1[0028]SEQIDN0:7:NCBI參考序列：ΝΜ_000390·2[0033]本發明的載體可以被配制成藥物組合物。除了載體外，這些組合物還可以包含藥學上可接受的賦形劑、運載體(carrier)、緩沖劑、穩定劑或本領域技術人員熟知的其它材料。此類材料應當是無毒的并且不應干擾活性成分(即，本發明載體)的效力。運載體或其它材料的精確性質可以由本領域技術人員根據施用途徑（即這里為直接視網膜、視網膜下或玻璃體內注射)來確定。藥物組合物通常是液體形式。液體藥物組合物通常包含液體運載體，如水、石油、動物油或植物油、礦物油或合成油。可以包含生理鹽水溶液、氯化鎂、右旋糖或其它糖溶液，或者二醇，如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。對于注射，活性成分可以是水溶液的形式，其為無熱源的并且具有合適的PH、等張性和穩定性。本領域相關技術人員完全能夠使用例如等張媒介物如氯化鈉注射液、林格氏注射液(Ringer'sInjection)、乳酸林格氏注射液(LactatedRinger'sInjection)制備合適的溶液。根據需要，可以包含防腐劑、穩定劑、緩沖劑、抗氧化劑和/或其它添加劑。對于延時釋放，載體可以包含在根據本領域已知的方法被配制成緩釋的藥物組合物中，例如在由生物相容性聚合物形成的微膠囊中或者脂質體運載體系統中。[0034]將通過以下附圖和實施例進一步說明本發明。然而，這些實施例和附圖無論如何不應被解釋為限制本發明的范圍。【附圖說明】[0035]圖1:AAV載體在iPSc衍生的RPE中的轉導效率。a)在CMV啟動子的控制下表達EGFP的AAV載體組(2/2、2/4、2/5、2/8、2/9)的轉導效率的比較。還將該轉導效率與在CAV啟動子的控制下表達EGFP的AAV2/5載體進行比較。利用25OOOvg/細胞進行轉導，并且通過FACS分析EGFP陽性細胞的數目。b)使用更高病毒顆粒數（100OOOvg/細胞）的在CAV啟動子的控制下表達EGFP的AAV載體2/2、2/5、2/8、2/9實現的轉導效率的比較。通過FACS分析EGFP陽性細胞的數目。c)來自相同AAV載體組的EGFP表達的時程。d)AA2/5-CAG-EGFP以相等效率轉導野生型和CHM1RPE。[0036]圖2:載體AAV2/5-CAG-CHM在CHM1成纖維細胞中的REP1表達。a)野生型成纖維細胞中REP1表達的IF研究。b)CHMl成纖維細胞中不存在REP1表達。c)用100OOOvg/細胞轉導CHM1成纖維細胞后48小時，來自AAV2/5-CAG-CHM的REP1表達。d)用100OOOvg/細胞的AAV2/5-CAG-CHM轉導后48小時對成纖維細胞的蛋白質印跡(Westernblot)分析顯示，REP1以野生型(WT)的大約17%的水平被表達。e)用100OOOvg/細胞的AAV2/5-CAG-CHM轉導后4周對RPE的蛋白質印跡分析顯示，REP1以野生型的大約53%的水平被表達。注意到在d)和e)中在未轉導(NT)的CHM1細胞中不存在REP1表達。[0037]圖3:用AAV2/5-CAG-CHM轉導后CHMRPE中正常細胞表型的恢復。A)野生型、未轉導的CHM1RPE和用AAV2/5-CAG-CHM轉導的CHM1RPE中的體外異戊二烯化，接著是并入的生物素化異戊二烯基供體的蛋白質印跡分析。B)野生型、未轉導的CHM1RPE和用AAV2/5-CAG-CHM或AAV2/5-CAG-EGFP轉導的CHM1RPE中細胞溶質級分和膜級分的差速離心和蛋白質印跡分析。C)歸一化至β肌動蛋白負載水平后的定量表明，在用AAV2/5-CAG-CHM轉導CHM1RPE后細胞溶質Rab庫降低至野生型水平。D)定量分析表明，在用AAV2/5-CAG-CHM轉導CHM1RTO之后Rab27A的亞細胞分布譜恢復到野生型水平。相比之下，在用AAV2/5-CAG-EGFP轉導后水平無變化。[0038]圖4:小鼠視網膜中的體內基因轉移。a)施用4.68X109vg的AAV5-CAG-CHM或AAV5-CAG-EGFP后兩周，可以通過q-PCR研究來檢測轉基因表達。b)蛋白質印跡分析確認了分別施用AAV5-CAG-CHM或AAV5-CAG-EGFP后REP1和EGFP的特異性表達。c)眼底鏡檢查研究顯示，施用AAV5-CAG-CHM后超出注射部位的健康視網膜，以及在AAV5-CAG-EGFP注射后在注射部位更強的廣泛的轉基因表達。d)沿著視神經一側的整個視網膜檢測EGFP表達，所述視神經覆蓋注射部位(比例尺）；插圖，顯示RPE和光感受器中的EGFP表達的放大圖。[0039]實施例[0040]材料和方法[0041]皮膚成纖維細胞的分離和擴增[0042]在CentreofReferenceforGeneticSensoryDisorders(遺傳性感覺障礙參考中心）（CHRUMontpellier)，在無菌條件下于16歲男孩(稱為CHM1)的上臂內側進行皮膚活檢，所述男孩具有經確認的無脈絡膜癥的分子診斷(通過RT-PCR鑒定CHM的外顯子8的缺失，KlinkumderUniversiliil^Regensburg，Germany)。將皮膚活檢物在PBS中沖洗，切成小塊，并且在5%C02下于37°C培養在35mm培養皿（每個皿2塊）中具有L-谷氨酰胺(Invitrogen,LifeTechnologies,SaintAubin,France)的AmnioMAXC100基礎培養基中，所述培養基含有10%的去補體FCS(Lonza，Verviers，Belgium)、1%青霉素-鏈霉素-兩性霉素B(Lonza)和2%AmnioMax-C100補充劑（Invitrogen，LifeTechnologies)。一旦出現的成纖維細胞達到80%匯合，即將活檢物移到新培養皿中。活檢物總共轉移4次，并且將來自每個單獨培養物的P1至P5范圍的細胞在含有10%DMS0(SigmaAldrich,SaintQuentinFallavier，France)的FCS中冷凍。[0043]突變表征[0044]使用DNeasyBlood&TissueKit(Qiagen，LesUlis,France)根據制造商說明書從原代成纖維細胞中分離基因組DNA。為了限定CHM患者攜帶的CHM中外顯子8缺失的邊界，使用標準條件針對對照和患者DNA的PCR擴增來測試分布在基因組DNA的5'至外顯子8的1.6kb上的3個引物對，以及分布在3'至外顯子8的38kb上的8個引物對。一旦建立了減小的間隔，即使用位于外顯子8上游78bp的內含子7F引物（5'-TTC-ATCTCC-TTT-TTG-TGG-GG-3'）（SEQIDNO:1)和位于外顯子8下游362bp的內含子8R引物（5'-(^6-6厶厶-厶〇厶-1'(：(：-丁61'-61'1'-〇八1'-C-3'）（SEQIDN0:2)來擴增666bp的基因組片段，所述基因組片段使用ExoSAP-ITPCRClean-upKit(GEHealthcare，VelizyVillacoublay,France)純化，之后使用BigDyeTerminatorCycleSequencingReadyReactionkitV3.1在AppliedBiosystems3130xLGeneticAnalyser(AppliedBiosystems，FosterCity,CA，USA)上測序。[0045]突變檢測[0046]將3個引物用于外顯子7、8和9的PCR擴增，以測試來自不同細胞類型的基因組DNA中CHM缺失的存在。外顯子7的引物對擴增493bp片段，外顯子8擴增177bp片段，并且外顯子9擴增975bp片段。使用QiaShredder和RNeasy小型試劑盒(Qiagen)根據制造商說明書從自不同的細胞類型中分離RNA。將分離的RNA用不含RNA酶的DNA酶(RNase-FreeDNase)(Qiagen)處理，并且使用SuperscriptIII逆轉錄酶試劑盒(LifeTechnologies)進行逆轉錄。通過外顯子7至11的PCR擴增進行CHM缺失的存在或不存在研究，所述外顯子代表了來自對照cDNA的559bp片段和來自患者cDNA的333bp片段。[0047]蛋白質印跡分析[0048]將細胞刮到含有完全蛋白酶抑制劑混合物片（Completeproteaseinhibitorcocktailtablets)(Roche，Meylan，France)的冷PBS中并且在4°C以200g離心5分鐘。使沉淀物重懸在含Benzonase(SigmaAldrich)的2XLaemmli樣品緩沖液（Biorad，MarneLaCoquette，France)中。使用PierceBCA蛋白質測定試劑盒（ThermoFisherScientific，Graffenstaden，France)測量裂解物的蛋白質濃度并且加載到AnyKD預饒注MiniProteanTGXStainFree凝膠（Biorad)上。分離的蛋白質使用Tr姐S-B.l〇.t?TurboTMMiniPVDFTransferPackandSystem(Biorad)進行電轉移。在5%脫脂乳中的0.5%Tween_PBS(封閉溶液）中封閉1小時后，將膜與單克隆小鼠抗REP1抗體(克隆2Fl;Millip〇re，SaintQuentinenYvelines，France)于封閉溶液中的1/1000稀釋物于室溫孵育1小時。在0·5%Tween_PBS中洗滌3次后，將過濾器與辣根過氧化物酶(HRP)綴合的綿羊抗小鼠完整免疫球蛋白抗體(LifeTechnologies)的1/10000稀釋物孵育。使用AmershamECL主要蛋白質印跡檢測試劑(GEHealthcare)進行檢測步驟。[0049]慢病毒載體產生[0050]含有多西環素（doxycycline)誘導型轉錄因子c-MYC(FUW_tet〇-hMYC;質粒ID20723)、S0X2(FUW-tet0-S0X2;20724)、KLF4(FUW-tet〇-KLF4;20725)、0CT4(FUW-tet0-0CT4;20726)、反向多西環素反式激活子M2rtTA(FUW-M2rtTA;20342)和GFP(FUGW;14883)的基于慢病毒的質粒購自Addgene(Cambridge，MA,USA)。通過慢病毒產生平臺(Montpellier，France)產生慢病毒載體。FUGW的感染滴度計算為1010TU/ml。其余病毒的感染滴度通過實現其？24濃度與？1^1的比例來估計4冊吋6切-11]^〇2\1091'1]/1111;?冊46切-5(^2-7\109TU/ml;FUW-tet〇-KLF4-8X109TU/ml;FUW-tet〇-〇CT4-3X109TU/ml以及FUW-M2rtTA-9.8X109TU/ml〇[0051]飼養細胞[0052]新生人包皮成纖維細胞購自ATCC(hFF-l;LTCstandards,France)。將細胞培養在補充有10%FCS的含Glutamax的DMEM(Gibco，Lifetechnologies)中并且使用CegelecBloodXrad福照器（EtablissementFl.anijaisduSang,Montpellier，France)以35戈瑞的劑量輻照。將飼養細胞以2.5X105個細胞/35mm板的密度接種。[0053]重編程和iPSc培養[0054]在開始重編程之前，使用編碼GFP的FUGW載體計算用于轉導實驗的適當的Μ0Ι。然后在第0天，將CHM患者成纖維細胞以6孔板的每個孔105個細胞的密度接種到6孔板中在補充有10%FCS和1%青霉素-鏈霉素-兩性霉素B的含Glutamax的DMEM中。在第1天，在8μg/ml聚凝胺的存在下用5種病毒（對照載體FUGW未用于重編程實驗）以每種載體10M0I(總計50M0I)轉導細胞。在第2天，將細胞用PBS沖洗并且加入新鮮培養基。在第5天，更新培養基并且補充2μ8/πι1多西環素。在第6天，將經轉導細胞用0,25%胰蛋白酶(Gibco)離解，并且將來自1個孔的細胞分到含有飼養細胞層的4個孔中（1/4稀釋）。將細胞培養在含有2μg/ml多西環素(SigmaAldrich)的ES培養基(K0DMEM(Gibco)中，所述培養基補充有20%K0血清替代物（Gibco)、200mML-谷氨酰胺（Gibco)、l%非必需氨基酸（Gibco)、0.1%B-巰基乙醇(Gibco)、l%青霉素-鏈霉素（Gibco)和10ng/mlb[Al]FGF(Peprotech，Neui1lySurSeine,France))，并且每天更換培養基。使用手術刀在Lynx立體顯微鏡（VisionEngineeringSA，LePlessisPat6,France)下將所得iPSc機械傳代到含有ES培養基中的飼養細胞的35mm板上。[0055]畸胎瘤形成和分析[0056]將iPSc用10μΜR0CK(Rho相關卷曲螺旋形成蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶)抑制劑(Y-27632;SigmaAldrich)在37°C預處理1小時，然后利用lXTrypLESelect(Gibco)在37°C酶促離解10分鐘。將離解的細胞以5000個細胞/cm2的密度接種到含有飼養細胞層的10cm板中，并且于傳代后在含有ROCK抑制劑的ES培養基中培養24小時。在注射之前將細胞酶促傳代5次。將離解的細胞以注射每200μ12X106個細胞的濃度重懸在含有30%BDMatrigel基底膜基質(BDBiosciences，LePontdeClaix，France)的ES培養基中。動物育種和實驗根據歐洲和國家實驗動物護理和使用指南(EuropeanandNationalguidelinesforthecareanduseoflaboratoryanimals)(CouncilDirective2010/63/EU)進行，并且經機構和地區倫理委員會（institutionalandregionalethicscommittees)批準（許可號CEAA-LR-12157)。將NOD.Cg-Prkdcscid112rgtmlWjl/SzJ小鼠（CharlesRiver，L'Arbresle，France)用35mg/kg氯胺酮（Merial，Lyon,France)和14mg/kg賽拉嗪（xylazine)(BayerHealthcare,Loos,France)麻醉，在左后脅和右后脅剃毛，并且使用連接到27號針的lml注射器皮下注射200μ1細胞混合物。作為對照，向小鼠注射不含細胞或者含有來自之前表征的野生型iPSc(M4C7;(Ramirez等，2013))的細胞的30%Matrigel/ES培養基。將小鼠單獨圈養在通風籠中，并且當腫瘤達到lcm2的最大尺寸(注射后約2個月）時使其安樂死。將腫瘤切下，在PBS中沖洗并在3.7%甲醛中固定，并且在石蠟中包埋。將4μπι切片用蘇木精-伊紅染色并且分析三個胚層的存在。[0057]RPE產生[0058]為了使iPSc分化成RPE，我們使用之前描述的自發分化方案(Liao等，2010)并且進行了小的修改。簡單地說，使iPSc集落生長至在飼養細胞上匯合，然后從ERS培養基中除去bFGF。在分化過程中持續每天更換培養基。在bFGF耗盡后的一月過程中出現色素灶(foci)，將其手動切下。將來自一個板的灶合并，用〇.25%胰蛋白酶離解，接種到用Matrigel(1:30稀釋)涂覆的24孔或6孔培養皿中，并且培養在耗盡FGF的ES培養基中。一旦達到匯合單層，細胞即呈現色素多邊形形態并且可以保持長期培養。將細胞通過胰蛋白酶離解傳代并且根據需要擴增。對處于第三次傳代(P3)的RPE進行所有分析。通過SteREODiscoveryV2.0顯微鏡(CarlZeissS.A.S，LePecq,France)觀察充滿流體的圓頂(dome)。[0059]電子顯微術[0060]將EPE傳代到具有高密度0.4μΜ孔的半透明BDFalcon細胞培養插件（BDBiosciences)上。當達到特征形態時，將過濾器從室上拆下，在3.3%戊二醛中固定，在2%四氧化鋨中后固定并且在環氧樹脂中包埋。將半薄（700nm)切片用甲苯胺藍染色并且在光學顯微術下觀察。用乙酸鈾酰和檸檬酸鉛對70nm切片染色并且使用HitachiH7100透射電子顯微鏡（CentreRegionald'lmagerieCellulaire(CRIC),Montpellier,France)使之顯現。[0061]免疫熒光顯微術[0062]對于免疫熒光研究，將iPSc和RPE接種到96孔塑料皿中，而將成纖維細胞接種到蓋玻片上。將所有細胞類型用3.7%甲醛固定并且在5%驢血清/1%BSA中封閉。將細胞用0.2%Tritonx-100或0.05%皂素透化。一級抗體在4°C于切片上孵育過夜，二級抗體在室溫下與〇·2μg/ml雙苯甲亞胺Hoechst(Sigma-Aldrich)和lng/ml鬼筆環肽-TRITC(Sigma_Aldrich)孵育45分鐘，然后適當時在Dako熒光封固劑(DakoFranceS.A.S.，LesUlis,France)中固定。對于iPSc，使用的一級抗體為1:5稀釋的大鼠IgM抗人SSEA3(DevelopmentalStudiesHybridomaBank,UniversityofIowa,IowaCity,IA,U.S.A.)和1:10的山羊抗人NAN0G(R&DSystemsEurope,Lilie,France)。對于RPE，使用的一級抗體為1:100稀釋的兔抗人Z01(Invitrogen,Lifetechnologies)、1:250的兔抗人MERTK(AbCam,Cambridge,GreatBritain)、1/150稀釋的小鼠抗人RPE65(AbCam)和1:1000的小鼠抗人CRALB(針對重組蛋白質;Agrobio,LaFert6StAubin,France)。對于成纖維細胞，使用的一級抗體是1/500稀釋的小鼠抗人REPl(Millipore)。對于所有，二級抗體是1:800稀釋的驢抗小鼠IgM-Alexa594或IgM-Alexa488或者1:1000稀釋的驢抗小鼠、抗兔或抗山羊IgG-AlexaFluor594或IgG-Alexa488(Molecularprobes，Invitrogen)。對于吞·作用研究，將細胞與160個珠/細胞的量的直徑Ιμπι的黃綠色（505/515nm)羧酸酯改性微球體(FluoSpheres;MolecularProbes，Lifetechnologies)孵育。使用Zeiss5活的雙重高速/光譜共聚焦顯微鏡觀察細胞并且使用相應采集軟件(CarlZeissS.A.S.;M〇ntpellierRIO成像平臺）進行圖像采集。[0063]逆轉錄和定量PCR研究[0064]使用定量RT-PCR(qPCR)分析轉導的成纖維細胞中外源轉基因的表達以及iPSc中外源轉基因的沉默和內源多能性基因的激活。在RNA分離和cDNA合成后，使用基因特異性引物（補充材料，表）和LigMCycler?48〇SYBRGreenIMaster混合物在LightCycler?48011熱循環儀（Roche)上進行qPCR擴增。將基因表達歸一化至GAPDH表達。使用LightCycler?480軟件和MicrosoftExcel分析結果。使用經典RT-PCR擴增利用基因特異性引物分析RPE特異性標志物的表達，并且在2%瓊脂糖凝膠上分析擴增產物。[0065]體外異戊二稀化測定[0066]將培養在24孔板的孔中的RPE在冷roS中洗滌，刮到含有抗蛋白酶的roS中，沉淀并且重懸在如之前所述(Wu等，2007)新鮮準備的冷的脫氣異戊二烯化/裂解緩沖液中。將細胞在冰上孵育15分鐘，然后在40赫茲下超聲處理45秒，持續3次。然后在OptimaMAX-TL超速離心機(1^〇1〇]^11，￥;[116。;[1^61?0丨887，？瓜1106)上，在4°0下將細胞以150(^離心5分鐘，收集上清液并且在4°C以450000g進一步離心30分鐘。使用異戊二烯化/裂解緩沖液中的作為異戊二烯基供體的5μΜ經生物素標記的焦磷酸香葉酯(B-GPP)(Euromedex，Souffelweyersheim,France)、0·5μΜ重組REP1(Euromedex)、0·5μΜRab香葉基香葉基轉移酶（RGGT;Euromedex)和20μΜGDP在37°C下持續1小時來對新鮮制備的裂解物進行體外異戊二烯化測定(Nguyen等，2010;Wu等，2007)。利用6XSDS淬滅異戊二烯化反應，在90°C煮沸5分鐘，并且通過蛋白質印跡進行分析。將膜與1:5000HRP綴合的鏈霉親和素（streptavidin)(JacksonImmunoResearch，Cambridge，GreatBritain)或1:50000的小鼠抗β-肌動蛋白（SigmaAldrich)孵育。使用ChemiDocMP成像系統（Biorad)進行檢測，并且使用適當的軟件包(ImageLab,Biorad)通過掃描密度測定法對生物素-香葉基并入程度進行定量，并且將其表示為β-肌動蛋白信號的函數。為了能夠相對比較，將CHMRPE中的生物素并入量設定為100%0[0067]差速離心[0068]將來自24孔板的孔的沉淀RPE細胞在3體積的亞細胞級分裂解緩沖液（SFLB)中充分均質化，所述緩沖液含有50mMTris-HCl(pH7.5)、150mMNaCl、2mMMgCl2，、0.5mMEGTA、0.5mMEDTA、5mMDTT、0.1mMGDP和蛋白質抑制劑，如所述（Seabra等，1995)。將均質物在4°C以800Xg離心，丟棄沉淀物，并且將上清液在4°C以450000Xg超速離心1小時，以獲得細胞溶質級分和膜級分。在超速離心后，將沉淀物重懸在調節至l%NonidetP-40(SigmaAldrich)的1體積SFLB中。通過蛋白質印跡分析來分析細胞溶質上清液和1%NonidetP-40溶解的膜級分的蛋白質含量。將膜與1:250小鼠抗Rab27A(AbCam)或1:50000小鼠抗β-肌動蛋白孵育。相對于β-肌動蛋白負載對照對Rab27A的細胞溶質水平和膜水平進行定量，并且將其表示為每個孔的總Rab27A含量的百分比。[0069]AAV載體產生[0070]病毒載體產生平臺（ViralVectorProductionPlatform,Nantes,France)產生用于該工作的所有AAV載體。簡單地說，通過瞬時轉染293細胞來產生病毒載體，并且使用PEG使病毒顆粒從上清液中沉淀出來，或者在AAV2/4和AAV2/5載體的情況下，使用硫酸銨使病毒顆粒從細胞沉淀物中沉淀出來。通過CsCl雙重離心將載體純化，進行透析并且通過斑點印跡測定加以滴定。對于轉導效率實驗，在CMV啟動子的控制下表達EGFP的AAV載體的滴度如下：AAV2/2-CMV-EGFP-3·5X1012載體基因組（vg)/ml;AAV2/4-CMV-EGFP(由Dr.F.Rolling，InsermUMR1089，Nantes的中間人提供）-3\101\8/1111;厶厶￥2/5-〇1^46卩？-3·3X1012vg/ml;AAV2/8-CMV-EGFP-9X1012vg/ml，以及AAV2/9-CMV-EGFP-2·55X1012vg/ml。對于概念驗證試驗，使用攜帶在CAG(具有CMV增強子的雞β肌動蛋白啟動子)啟動子的控制下的CHM基因（由Pr.J.Bennett,UniversityofPennsylvania,PA,USA提供）或EGFP基因(由NantesViralVectorProductionPlatform提供）的AAV質粒產生以下載體：AAV2/5-CAG-CHM-4·4X1012vg/ml和AAV2/5-CAG-EGFP-2·34X1012vg/ml。[0071]體外AAV轉導[0072]對于轉導效率實驗，將iPSc衍生的RPE接種到96孔板中，并且在匯合時估計每孔2Χ?ο5個細胞。用最小體積(50μ1)的耗盡bFGF的ES培養基中的25OOOvg(由具有最低滴度的血清型決定)將細胞轉導6小時以促進載體-細胞相互作用。然后向孔中補充額外的培養基并且每3至4天更換培養基。在期望的時間點，將細胞用0.25%胰蛋白酶離解，在3.7%甲醛中固定并且在轉導后48小時、1周、2周、4周或6周使用BDFACSCalibur流式細胞儀（BDBiosciences)分析表達EGFP的細胞的數目。實驗以一式二份進行。對于轉基因表達實驗，將2X104個成纖維細胞接種到含有蓋玻片的24孔板中。接種后24小時，利用100OOOvgAAV2/5-CAG-CHM將細胞轉導48小時。平行地，用AAV2/5-CHM-EGFP以等同Μ0Ι轉導不具有蓋玻片的孔用于流式細胞術分析。對于概念驗證實驗，將iPSc衍生的RPE接種到24孔板中，并且在匯合時估計1.2X106個細胞。以100000Μ0Ι轉導細胞，并且在轉導后4周時進行異戊二烯化測定。實驗以一式三份進行。[0073]視網膜下注射[0074]用70mg/kg氯胺酮和28mg/kg賽拉嗪將8周齡C57BL/6J雄性小鼠（HarlanFranceSARL，Gannat，France)麻醉，并且在各眼中用一滴0.5%托吡卡胺（tropicamide)(Mydriaticum，Th6a，France)使隱孑乙擴大。用1滴Lacryvisc(Alcon，Ruei1-Malmaison，France)和蓋玻片覆蓋角膜。在手術顯微鏡下，首先在角膜-虹膜結合部刺穿眼。隨后，使用5μLHamilton注射器和34G斜面針進行視網膜下注射。向眼中注射2μ1PBS或2μ1含4.68X109vgAAV2/5-CAG-CHM或AAV2/5-CAG-EGFP。在注射后2周、4周、6周和8周以規則間隔通過眼底鏡檢查對眼進行觀測）。在每個時間點，將小鼠麻醉，使瞳孔放大，并且使用MicronIII視網膜成像顯微鏡（PhoenixResearchLaboratories，Peasanton，CA,USA)拍攝眼底照片。如之前所描述的（Chekroud等，2011)，在處死小鼠之前進行視網膜電圖研究。使用KruskallWallisAN0VA進行統計學比較，并且使用Siegel-Castellan2X2比較進行事后（post-hoc)比較（Siegel和Castellan,1998)。[0075]轉基因表達的分析[0076]在注射后2周處死小鼠，將眼摘出，并且去除眼球的前段。對于蛋白質印跡分析，分別將視神經視網膜切下并且置于裂解緩沖液(50mMTrispH6.8、10%甘油和2%SDS)中。隨后，使用鑷子將RPE和脈絡膜刮到裂解緩沖液中并且與視神經視網膜合并。如上所述使一定百分比（7.5%)的總蛋白質樣品迀移、轉移并且與抗REP1或1/2000稀釋的兔抗EGFP血清(Molecularprobes，Invitrogen)雜交。對于q-PCR分析，在RNA分離和cDNA合成之前將視神經視網膜和RPE/脈絡膜樣品驟凍（snapfrozen)。使用歸一化至L27基因表達的基因特異性引物進行Q-PCR分析。[0077]組織學分析[0078]為了測定EGFP表達，將眼摘出并且在4°C在3.7%甲醛中固定6小時，在10%、20%、30%和40%蔗糖的連續浴中孵育，之后在00'基質中包埋并且以14以1切片（路86&11(1'HistologieExpgrimentaledeMontpellier(RHEM))。為了測定組織結構，將眼摘出并且在4°C在3.7%甲醛中固定24小時，在連續乙醇浴中脫水，在石蠟中包埋并且以4μπι切片(RHEM)。對于光感受器計數，將切片用蘇木精和伊紅染色。在幻燈片掃描器（HamamatsuPhotonicsK.K.，Japan;MontpellierRI0成像平臺）上獲得顯微圖像。對每個視網膜的至少4個矢狀切面計數(掩蔽注射狀態），并且計算光感受器核的數目的平均值。[0079]題[0080]患者突變的表征[0081]來自患者CHM1的成纖維細胞的基因組DNA的表征揭示了位于外顯子8的起點上游40bp處的內含子7內7bp(TAGTTCT)(SEQIDN0:3)序列的重復。在重復序列之間是4bp插入序列（GATT)。該第一重復之后是位于起點后68bp處的外顯子8內的15bp序列的第二重復(GTCATGCATTCAATT)。位于兩個重復之間的包含內含子7的末端和外顯子8的起點的97bpDNA序列缺失。內含子7受體剪接位點的喪失和隨后顯外子8的缺失導致氨基酸位置314處的預期移碼和位置332(野生型REP1為653aa)處的提前終止密碼子，從而截短了REP1的第二GDP離解抑制劑(GDI)結構域。利用針對存在于野生型REP1和截短的REP1(73.49kDa)以及REP2(74.08kDa)中N末端表位的抗體進行的蛋白質印跡分析對于對照細胞檢測到了2個帶，并且對于CHM細胞檢測到了1個帶(對應于REP2)，表明截短的蛋白質是不穩定的。與對照細胞相反，使用第二REP1特異性抗體進行的蛋白質印跡分析沒有在CHM1細胞中檢測到蛋白質。[0082]因此，患者CHM1所攜帶的突變破壞了REP1蛋白質的產生。另外，在DNA、RNA和蛋白質水平下進行的檢測測試將用于驗證患者之后產生的任何細胞類型中突變的存在。[0083]患者特異性iPS細胞的產生和確認[0084]我們使用帶有Yamanaka轉錄因子混合物(〇-]\^(：、10^4、0(^4、3(^2)的多西環素誘導型慢病毒載體進行CHM1成纖維細胞的重編程。我們通過qPCR研究驗證了在多西霉素誘導后24小時每個轉基因的表達。多西環素誘導后1周，成纖維細胞開始改變形態，部分重編程的集落(前iPSc集落)隨時間而出現和消失。相比之下，多西環素誘導后5周，檢測到形態特征性集落，將存活的那些機械傳代到不具有多西環素的ES培養基中。CHMliPScDNA的PCR擴增表明存在原始CHM缺失，并且它導致mRNA中完全缺失外顯子8，如通過野生型和CHM1iPScRNA產生的cDNA片段之間226bp的差異所證明。此外，CHMliPSc沒有呈現出可能在重編程期間發生的任何大的染色體異常，如通過核型分析所顯示。[0085]通過多種技術并且使用野生型克隆M4C7(Ramirez等，2013)作為陽性對照驗證了CHM1iPSc的多能性。首先，在mRNA水平下，qPCR研究證明CHM1iPSc中外源c-MYC、KLF4、0CT4和S0X2的沉默以及內源0CT4、S0X2、LIN28和NAN0G表達的激活。其次，堿性磷酸酶染色是陽性的，并且免疫熒光（IF)研究確認了NAN0G的表達并且指示了SSEA3的表達。最后，當在免疫缺陷小鼠中皮下注射時，CHMliPSc誘導形成畸形瘤，并且通過組織學分析確認了三個胚層的標志物的表達:外胚、中胚層和內胚層。[0086]總之，我們產生了CHM患者的真正iPSc。[0087]患者特異性RPE的產生和確認[0088]我們使用自發分化方案由野生型M4C7和CHMliPSc產生了視網膜色素上皮(RPE)。在將iPSc培養至匯合并且從培養基中除去bFGF后大約30天，板中出現色素灶。將這些灶機械傳代，并且在匯合時產生RPE特征性的多邊形色素細胞單層。將細胞接種到半透明的多孔過濾器上允許進行切片和組織學分析。對半薄切片的觀察結果證明細胞層是規則單層。透射電子顯微術顯示所述單層是極化上皮，其具有頂側上的微絨毛、基側上的細胞核、細胞溶質黑色素體和指示緊密連接的橋粒。上皮似乎分泌在RPE和matrigel涂層之間可檢測到的基膜。RT-PCR研究證明，所述iPSc衍生的上皮表達用于視覺周期（如RLBP1、RPE65、LRAT、RDH5)、視網膜發育(PAX6)、吞噬作用(MERTK)、色素沉著(TYR)、離子轉運(BEST1)和細胞粘附（Z0-1)的典型基因。另外，IF研究顯示，根據各自的作用，MERTK局限于頂部微絨毛中（圖4卩），〇^1^和1^65局限于細胞質中，20-1局限于頂部結合處。此外，橋粒的存在與陽性20-1標記一致。除了這種典型RPE形態之外，iPSc衍生的RPE中還保存了兩種體內功能。首先，板中隨時間而出現了不同大小的充滿流體的圓頂。這些可能是由于頂部-基部流體運輸將RPE從培養板中提起而形成的。其次，RPE能夠吞IffiFluoSpheres，這可以通過表面焚光顯微術檢測。FACS分析顯示，內化的球體數量隨時間而增加。最后，存在DNA和RNA水平的原始CHM突變，并且在CHM1RPE中不存在REP1。[0089]總之，這些結果確認，來自野生型和CHMliPSc的該iPSc衍生的上皮是真正的和功能性的RPE。[0090]檢測生化缺陷[0091]為了確定來自個體CHM1的iPSc衍生的RPE是否重現患者的生物化學缺陷，我們建立了兩種不同的技術來測定反映REP1活性的細胞內Rab的異戊二烯化狀態。首先，我們使用體外異戊二烯化測定來測定細胞中未異戊二烯化Rab庫的大小。為此，我們向野生型和CHM1細胞的裂解物中加入重組的RGGT、REP1和生物素化異戊二烯基供體。因此，如果未異戊二烯化Rab庫可用于異戊二烯，則可以使用HRP綴合的鏈霉親和素通過蛋白質印跡分析來檢測整合的生物素。根據β肌動蛋白負載對照將對應于生物素化Rab的檢測帶歸一化，并且將CHM1RPE中檢測到的異戊二烯化Rab庫設定為100%，以允許相對比較。平均來看，在野生型RPE中檢測到為約1/4的水平的生物素化Rab，這與以下事實一致:在REP1和REP2的存在下，大部分Rab是異戊二烯化的和膜結合的。其次，我們特別測定了Rab27A的亞細胞分布，Rab27A是在視網膜中高表達的Rab蛋白質（Seabra等，1995)。通過差速離心，我們分離了野生型和CHM1細胞裂解物的細胞溶質級分和膜級分，并且通過蛋白質印跡分析利用特異性抗體分析了各自的Rab27A含量。對于異戊二烯化測定，根據β-肌動蛋白負載對照將各級分中Rab27A的量歸一化。隨后，將各細胞裂解物中Rab27A的總量（細胞溶質+細胞膜）設定為100%，并且將各級分中的量表示為總Rab27A含量的百分比。在野生型細胞中，細胞溶質Rab27A的量平均為膜結合量的約1/4.7。相比之下，在(》11^中，細胞溶質1^274的量平均為野生型細胞中觀察到的約2倍，并且為膜結合量的1/1.8。[0092]因此，總之，CHM1RPE細胞模擬了CHM患者中見到的生物化學差異，即，由于REP1不存在而導致的Rab蛋白質的異戊二稀化不足(underprenylation)。[0093]轉導RPE[0094]為了確定我們是否可以用AAV載體轉導iPSc衍生的RPE并且確定最有效的血清型，我們測試了在CMV啟動子的控制下表達EGFP的一組載體:AAV2/2、AAV2/4、AAV2/5、AAV2/8和AAV2/9。首先，通過EGFP表達確定了所有血清型均能夠轉導iPSc衍生的RPE并且轉導效率是劑量依賴性的。其次，對于等量的病毒基因組，每種血清型的效率為2/5>2/2>2/4>2/8/>2/9(圖la)。值得注意地，平均來看，AAV2/5載體表達為AAV2/2的1.5倍（1.45±0.26，η=5)，并且它為AAV2/8和AAV2/9二者的大約6倍。為了探究這四種血清型的劑量依賴效應，我們將每個細胞中病毒基因組的數目增加到100〇〇〇。雖然AAV2/5的轉導效率從EGFP陽性細胞的55%增加到了80%，但44￥2/2和44￥2/8或44￥2/9的轉導效率保持分別為大約1/1.5和1/6(圖Id)。另外，我們使用了最有效的血清型(AAV2/5)來比較兩種不同啟動子的效力:CMV相對于CAG(具有CMV增強子的雞β-肌動蛋白）。平均來看，CAG指導為CMV2倍的表達水平(2·04±0.21，η=5;圖la)。第三，時程實驗表明表達在轉導后4周達到峰值（圖lc)。最后，iPSc衍生的RPE(即，野生型相對于CHM)的基因型并不影響轉導效率(圖Id)。[0095]總之，這些結果證明，與其它血清型、尤其是AAV2/2和AAV2/8相比，AAV2/5載體更好地轉導人iPSc衍生的RPE。[0096]AAV2/5-CAG-CHM指導的REP1表達[0097]因此我們產生了在CAG啟動子的控制下表達CHM的AAV2/5載體。對利用AAV2/5-CAG-CHM轉導的CHM1成纖維細胞的IF研究確認，所編碼的REP1被表達并且正確定位，如細胞質中大部分為囊泡的染色（圖2a-c)所示。對轉導的成纖維細胞的蛋白質印跡分析（圖2d)，接著對歸一化至肌動蛋白水平的REP1表達的半定量表明，REP1表達等于野生型的約17%。平行地并且根據蛋白質印跡數據，我們利用AAV2/5-CAG-EGFP轉導了成纖維細胞，并且通過流式細胞術檢測到14%的EGFP陽性細胞。一致地，利用AAV2/5-CAG-CHM對RPE進行的初始轉導實驗，接著的蛋白質印跡（圖2e)和半定量分析表明，對于40%的EGFP陽性細胞(如通過AAV2/5-CAG-EGFP轉導的RTO細胞的流式細胞計數確定的），REP1表達等于野生型的53%〇[0098]因此，總之，這些數據顯示，利用AAV2/5-CAG-CHM轉導的CHM1細胞中的REP1表達至少等于野生型的REP1表達。[0099]CHM基因轉移[0100]然后利用AAV2/5-CAG-CHM載體轉導CHM1RPE，并且基于時程實驗的結果，在轉導后4周分析REP1活性。圖3a中顯示了代表性實驗。如上所述，在異戊二烯化實驗中，將檢測到的生物素化的Rabs庫設定為100%。在用44￥2/5446-〇11載體轉導(：圓11?^后，生物素化的1^*蛋白質的數量減少到1/4.5，這等于野生型RPE中的水平（圖3c)。類似地，對AAV2/5-CAGCHM轉導后的Rab27A的亞細胞分布的分析（圖3B)顯示，與非轉導RPE相比，Rab27A的細胞溶質級分降低到1/2.4,并且膜結合級分增加到1.3倍，所述非轉導RPE中的水平等于野生型RPE中的水平（圖3d)。此外，利用對照AAV2/5-CAG-EGFP載體轉導CHM1RPE并不顯著改變各級分中Rab27A的比例。[0101]總之，我們提供了以下概念驗證:AAV2/5介導的CHM基因轉移恢復了CHM患者的RPE中的正常細胞表型。[0102]體內基因轉移[0103]為了補充這些體外研究，我們向小鼠眼部注射PBS、AAV2/5-CAG-EGFP或AAV2/5-CAG-CHM并且測定表達。早在注射后3天，在用AAV-CAG-EGFP注射的小鼠的眼底中可以略微感知到EGFP表達。對注射后2周的視網膜提取物進行的Q-PCR研究顯示注射AAV2/5CAG-CHM的小鼠的視網膜提取物中的人CHM的特異性表達以及注射CAV2/5-CAG-EGFP的眼中的EGFP的特異性表達(圖4a)。相同時間點的蛋白質印跡分析確認了蛋白質水平下的這種特異性表達（圖4b)。我們在注射后1周、2周（圖4c)和1個月通過眼底鏡檢查觀測了EGFP表達的演變，并且檢測到表現穩定的廣泛轉導。熒光顯微術確認了直到視神經的一半視網膜的轉導，并且在RPE和光感受器二者中均檢測到了EGFP表達（圖4d)。[0104]總之，小鼠視網膜中的體內AAV2/5介導的基因轉移導致RPE和光感受器二者中的基因表達。[0105][0106]干細胞已經徹底改變了人細胞培養領域，因為它們代表了理論上可以產生為身體中的任何細胞類型的多能性細胞的永久繁殖(Yu和Thomson，2008)。具體地說，誘導性多能干細胞（iPSc)代表了一種優異的工具，因為它們可以由成人體細胞產生（Takahashi等，2007;Yu等，2007)，因此避開了使用人胚胎干(ES)細胞所涉及的倫理考慮因素。另外，因為理論上干細胞可以分化成身體的任何細胞類型，所以它們允許得到還不能通過常規技術分離的原代細胞類型(Grimm，2004)。此外，如果原材料來自患有特定遺傳病的個體，則祀細胞類型可以代表疾病特異性細胞模型(Park等，2008)。[0107]我們使用iPSc技術產生了疾病特異性視網膜色素上皮(RPE)模型，利用所述模型，我們能夠為基因療法方式提供概念驗證。這是此類策略的第一個示例。通常，使用iPSc衍生的細胞模型來進一步理解疾病的病理生理學（singh等，2003)，用于篩選藥理學藥物的效率(Egawa等，2012)，或鑒于細胞移植用于產生細胞前體(Tucker等，2011)。我們在這里證明，iPSc衍生模型用于測試基因替代策略在相應治療試驗中將被靶向的細胞類型中的效率的進一步潛力。[0108]目前廣泛認為AAV載體對于視網膜基因療法是安全和有效的。在所鑒定的各種AAV血清型中，六4￥2/2^4￥2/4^4￥2/5^4￥2/8和44￥2/9均被證明取決于物種以可變的效率轉導視網膜細胞類型（Vandenberghe和Auricchio，2012)。所有這5種血清型均轉導RPE，而除AAV2/4之外的所有血清型轉導光感受器(Weber等，2003)。另外，就光感受器轉導來說，在小鼠眼和豬眼中證明AAV2/5、AAV2/8和AAV2/9顯示出比AAV2/2更高的效率(Allocca等，2007;]\11188〇1;[110等，2011)。迄今為止在人中，已經測試了44￥2/2(1^;[11131^(^6等，2008;]^118￥；[1'1:11等，2008;Maguire等，2008)和AAV2/4(未公開)這兩種血清型，并且積累的毒理學數據表明這些載體對于人眼是安全的，然而最有效的載體仍有待確定。[0109]我們在iPSc衍生的人RTO中測定了前述AAV血清型的轉導效率。與文獻一致，與AAV2/2相比，AAV2/5導致相同啟動子的2倍高的表達水平。然而，我們證明，出乎意料地，AAV2/8比利用AAV2/2觀察到的低。我們最初認為這是由于我們所使用的第一AAV2/8儲液是由與其它血清型不同的載體產生平臺產生的。因此，我們從相同的產生平臺獲得第二儲液，但是結果相同。此外，我們探究了劑量依賴性效應，但是在人RPE中AAV2/5始終比AAV2/8更有效。另外，AAV2/9的結果類似。可能這是由于細胞表面受體的差異所致，因為AAV24結合α-2-3N連接的唾液酸，而AAV2/2、AAV2/8和AAV2/9不使用該受體(綜述參見Agbandje-McKenna和1(16丨118(^1^扣，2011)。因為我們已經證明人丨？3(3衍生的1?^細胞的特征在于具有功能性體內RPE的典型特性，所以在體外觀察到的在所有劑量下AAV2/5相對于AAV2/8和AAV2/9的優勢必定也適用于體內。因此，可能在人RPE中，較低劑量的AAV2/5病毒載體將提供優于其它血清型的轉導，這具有重要的安全意義。[0110]我們證明RPE的AAV2/5轉導是劑量依賴性的，并且證明通過使用CAG啟動子而不是CMV啟動子，可以進一步提高轉導效率。我們達到了最高85%的轉導效率，如果我們考慮使用AAV載體進行體外轉導的眾所周知的困難，那么這是令人驚訝的。轉導可能受助于RPE的吞噬特性，這代表了其在眼中的關鍵作用之一(Sparrow等，2010)。在體內，光感受器每天持續更新它們的外段盤并且脫落它們在R0E側的舊段。RPE負責脫落盤的吞噬，所述脫落盤如果積累的話將是毒性的。因此，iPSc衍生的RPE的吞噬能力模擬了向視網膜下空間施用的AAV載體所遇到的情形，并且進一步突出了這一模型的優異潛力。在體內，光感受器持續更新它們在頂側的外段盤，因此每天脫落它們在它們的底部的舊段。RPE負責脫落盤的吞噬，所述脫落盤如果積累的話將是毒性的。這一特性也可以解釋所有物種中與利用AAV載體的光感受器相比RPE更高的轉導效率(Vandenberghe等，2011)。最后，一旦RPE在培養中匯合，細胞分裂即停止，因此使得可以長時間觀測轉基因表達，因為AAV載體不隨時間而損失。[0111]為了確定我們是否可以使用人RPE的細胞模型測試AAV2/5介導的基因轉移方法的效率，我們由患有無脈絡膜癥的個體的成纖維細胞產生iPSc衍生的RPE。無脈絡膜癥是一種視網膜營養不良，其中RPE的變性似乎在其病理生理學中起關鍵作用（Krock等，2007;Tolmachova等，2010)。此外，它是iPSc衍生方法的一個完美候選，因為不存在為基因拯救(generescue)研究提供信息的疾病特異性動物模型(Tolmachova等，2013,Tolmachova等，2012)。我們在這里證明了無脈絡膜癥特異性RPE表達特征性蛋白質，是功能性的，并且模擬了在患者中見到的生物化學缺陷：所編碼的蛋白質REP1的缺失導致Rab蛋白質、尤其是Rab27A的異戊二烯化不足，從而導致膜締合Rab的數目的減少以及細胞溶質庫的增加。這提供了用于評估功能恢復的定量讀出。使用兩個獨立測定，我們證明，CHM基因轉移通常能夠減少細胞溶質Rab庫，尤其是Rab27A庫。這提供了人RPE中的概念驗證:AAV2/5介導的CHM基因轉移可以恢復正常的細胞表型。[0112]本文描述的工作證明在不存在適當的動物模型的情況下，使用人疾病特異性細胞模型進行概念驗證的可能性。這受助于以下事實：已經通過靶向視網膜的臨床試驗驗證了載體本身（即使是不同血清型），因此體外研究主要評估了轉基因的功能。如果AAV介導的視網膜基因療法領域繼續積極進展，則這一相同的策略可以被應用于其中影響RPE的多種IRD，因此促進臨床轉化。[0113]我們在患病視網膜的相關人細胞模型中提供概念驗證的方法是其種類中的第一個示例，并且徹底改變了"臨床前"思維。已經發表了另外兩篇文章，其確認了使用條件性小鼠模型進行無脈絡膜癥的表型恢復研究以及基本上基于細胞模型(CHM成纖維細胞和iPSc)提供概念驗證的困難(Tolmachova等，2013;Vasireddy等，2013)。在這里，我們更進了一步并且在RPE細胞(受影響的主要細胞類型）中提供了概念驗證，因此避免了由疾病發病機理中不涉及的細胞類型進行外推。另外，前述這些論文評價了AAV2/2介導的CHM基因療法的效率，我們證明其在人RPE中的效率低于AAV2/5。[0114]總之，這些數據首次提供了以下證明：與AAV2/2、AAV2/4、AAV2/8和AAV2/9載體相比，我們用于在CAG啟動子的控制下載送(VehiCle)CHM基因的AAV2/5載體是用于患有無脈絡膜癥的患者的人RPE細胞的基因療法的更好載體。[0115]參考文獻[0116]在本申請通篇中，各個參考文獻描述了本發明所屬領域的現狀。這些參考文獻的公開內容在此通過引用并入本公開中。[0117]Agbandje-McKennaM?KleinschmidtJ(2011)AAVcapsidstructureandcellinteractions.MethodsMolBiol807:47-92[0118]AlloccaM，MussolinoC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