用于治療中央核性肌病的發動蛋白2抑制劑的制作方法

用于治療中央核性肌病的發動蛋白2抑制劑的制作方法
【專利摘要】本公開涉及用于治療中央核性肌病的發動蛋白2抑制劑。本公開涉及含有發動蛋白2抑制劑的藥物組合物，并涉及所述藥物組合物在治療中央核性肌病中的用途。本公開還涉及對有益于治療中央核性肌病的分子進行識別或篩選的方法。
【專利說明】
用于治療中央核性肌病的發動蛋白2抑制劑
技術領域
[0001 ] 本公開涉及用于治療中央核性肌病(centronuclear myopathies)的發動蛋白2抑 制劑。本公開還涉及包含發動蛋白2抑制劑的藥物組合物及其在治療中央核性肌病中的用 途。
【背景技術】
[0002] 中央核性肌病(CNM)是一類先天性肌病，其表征為肌肉力弱，并在組織學上由纖維 萎縮、I型纖維占優勢以及核中央化的增加而確認，并非是繼發于肌肉再生。已表征了 CNM的 三種主要形式：由于磷酸肌醇磷酸酶肌管素(MTM1)突變造成的X連鎖CNM(XLCNM，也稱為肌 管肌病，0ΜΙΜ 310400)(LaporteJ.等，Nature Genetics，1996,13(2) :175-82頁）；由于膜 重塑蛋白雙載蛋白（3!^1^?1^8111)2(8頂1)突變造成的常染色體隱性0麗(厶1^匪，01頂 255200) (Nicot，A.S.等，Nature Genetics，2007,39(9) :1134-9頁）；以及由于發動蛋白 2 (DNM2)突變(Bitoun，M.等，Nature Genetics，2005，37( 11 ):1207-9頁）或由于其它基因（如 BIN1)突變(Bohm等，Brain，2014年9月25日，pii:awu272,[印刷版之前的電子出版])造成的 常染色體顯性CNM(ADCNM，0M頂160150)。已將CNM樣肌病與其它基因相關聯:編碼蘭諾定受 體(ryanodine receptor)的RYR1;編碼肌聯蛋白的TTN;CCDC78(0MIM 614807);以及磷酸肌 醇磷酸酶MTMR14(稱為hJUMPY;0MM 160150)。所牽涉的這些基因之間的遺傳關系尚不明 確，并且缺乏有效的治療方法。
[0003] X連鎖中央核性肌病也稱為肌管肌病，是最常見且最嚴重的C匪形式，新生兒發病 和死亡通常發生在生命的第一年(Jungbluth，H.等，Orphanet J Rare Dis，2008,3:第26 頁）。這種疾病目前既無法治愈，也無有效治療。目前為止已經報道了約450個家族中的超過 200種不同的MTM1突變，其中大部分導致蛋白大量減少。之前已對Mtml敲除或敲入的小鼠進 行了表征，其重現了CNM表型，具有典型的組織學特征，包括細胞器定位異常、細胞核定位錯 誤和肌肉萎縮，并伴有肌肉力量相應下降。已在具有不同形式CNM的數種動物模型和患者中 檢測到與異常興奮-收縮偶聯相關的三聯體(triads)結構缺陷，在全部CNM形式中識別出共 同缺陷（Defects in amphiphysin 2 (BIN1 )and triads in several forms of centronuclear myopathies，Tous saint，A ·等，Acta Neuropathol，2011年2 月；121(2): 253-66)。這與所提出的MTM1在三聯體肌質網部分的磷酸肌醇水平調節中的作用相一致。 [000 4]發動蛋白是在膜運輸(trafficking )、胞吞作用以及肌動蛋白細胞骨架組裝中起 重要作用的大GTPase蛋白。發動蛋白包含用于蛋白-蛋白相互作用的PRD(富含脯氨酸的結 構域）、N-末端GTPase結構域、中間結構域、PH結構域(磷酸肌醇結合)和GED(GTPase效應結 構域）。已經鑒別了三種人發動蛋白：發動蛋白1，僅在神經元中表達;發動蛋白3,主要在腦 和睪丸中表達；以及發動蛋白2(DNM2)，普遍表達。已經在組織特異性疾病中鑒別了不同的 雜合·Μ2突變：影響骨骼肌的常染色體顯性中央核性肌病；以及常染色體顯性Charcot-Marie-Tooth(CMTDIB，0MIM 606482)周圍神經病變。
[0005]最近的生化研究表明，一些導致CM1的DNM2突變使得發動蛋白寡聚物穩定性以及 GTPase活性升高。在小鼠中，借助最常見的CNM-M#2患者突變(p. R465W)的敲入或過表達進 行體內補償，這在成年小鼠中誘導CNM樣特征，表明該疾病不歸因于單倍體不足 (1^口1〇;[1181^;1^(^611050。野生型(￥1')0匪2的過表達也對肌肉造成干擾，不過程度較小。
[0006] 專利申請W0 2013/0065558描述了miR-133a對DNM2表達起到調制作用。由于CNM中 DNM2是突變的，指出m i R-13 3家族成員的激動劑可能有利于中央核性肌病的治療。然而， miR-133具有多個祀標（參見miRNA祀標預測和功能注釋的在線數據庫，例如http : // mirdb. org/miRDB/，給出了miRDB中的hsa-miR-133a的226個預測靶標，其中沒有DNM2，利用 其它在線數據庫也得到相同類型的結果）。由于miR-133具有多個靶標而沒有選擇性，這可 能具有有害影響。此外，至今沒有利用miRl 33遞送來改善CNM的報道。
[0007] 因此，對于中央核性肌病的合適治療方法，特別是新的、更有效的治療劑具有顯著 需求。

【發明內容】

[0008] 對具有前景的中央核性肌病療法的探索使得發明人發現，·Μ2的下調可以預防、 阻止并潛在地逆轉(overturn)XLC匪表型的進展。此外，經確認，ΜΤΜ1在肌肉組織化和肌肉 力量中起著DNM2的負調節因子的作用。盡管DNM2是重要細胞過程的關鍵動力酶 (mechanoenzyme)，其減少對于XLC匪和其它中央核性肌病是非常有利的，并因此代表了新 的潛在治療手段。本文展示的工作表明，DNM2的下調對中央核性肌病具有強效治療作用。
[0009] 在第一方面，本發明涉及用于治療中央核性肌病的發動蛋白2抑制劑。在具體的實 施方式中，所述中央核性肌病選自于由如下疾病所組成的組:X連鎖C匪(XLCNM)、常染色體 隱性C匪(ARCW)和常染色體顯性C匪(ADCW)。在優選的實施方式中，所述中央核性肌病是 XLCNM 或 ARCNM。
[0010] 本發明還涉及用于治療中央核性肌病的藥物組合物，所述藥物組合物包含發動蛋 白2抑制劑和藥學上可接受的載體/賦形劑。
[0011] 本發明進一步涉及用于治療中央核性肌病的方法，其中，該方法包括將治療有效 量的發動蛋白2抑制劑給予需要此類治療的受試者的步驟。
[0012] 最后，本發明涉及發動蛋白2抑制劑在制備用于治療中央核性肌病的藥物組合物 中的用途。
[0013] 所述發動蛋白2抑制劑優選選自于由如下抑制劑所組成的組:針對發動蛋白2的抗 體;特異性干擾發動蛋白2表達的核酸分子；以及抑制發動蛋白2的活性、表達或功能的小分 子。在優選的實施方式中，所述發動蛋白2抑制劑選自于由特異性干擾發動蛋白2表達的核 酸分子所組成的組。在具體的實施方式中，所述發動蛋白2抑制劑是特異性干擾發動蛋白2 表達的核酶、RNAi或反義核酸。
[0014] 在更具體的實施方式中，所述發動蛋白2抑制劑是siRNA、shRNA或反義snRNA。
[0015] 本發明進一步的目標涉及對有益于治療中央核性肌病的化合物進行篩選或識別 的方法，所述方法包括如下步驟：
[0016] a)提供或獲得候選化合物；以及
[0017] b)確定所述候選化合物是否抑制發動蛋白2的活性/表達；
[0018] c)如果所述候選化合物抑制發動蛋白2的活性/表達，選擇所述候選化合物。
[0019] 對適于治療中央核性肌病的分子進行篩選或識別的方法可任選地進一步包括如 下步驟:在體內或體外將所選擇的分子給予中央核性肌病非人動物模型或其部分(組織或 細胞），并分析對肌病發病或進展的作用。
[0020] 在對本發明進行詳細描述之后，本發明的這些及其它目的和實施方式將變得更加 顯而易見。
【附圖說明】
[0021] 圖1 JLCNM中的·Μ2水平。（A)XLC匪患者肌肉裂解液中·Μ2、ΜΤΜ1和GAPDH上樣對 照的代表性WB，m =月齡。（B)DNM2蛋白表達的相對水平，所述相對水平由密度測定法確定， 并使用GATOH上樣對照標準化，總n = 3-5名患者。（C)對來自5周齡WT和小鼠的脛骨 前肌(TA)和膈膜(E)骨骼肌裂解液的·Μ2和GATOH(上樣對照)進行免疫印跡。對于TA(D)和 膈膜(F)，借助·Μ2免疫反應性多肽的密度測定法并使用GAPDH上樣對照標準化而確定的 M2蛋白的相對水平。以與WT對照裂解液的倍數差異表示·Μ2表達，η = 4只小鼠。（G)對膈 肌切片進行HE染色。比例尺100mm。全部的圖描繪平均值土s.e.m. (*ρ〈0.05，**ρ〈0.01，***ρ 〈0.001)。
[0022] 圖2。1)匪2表達的減少大幅挽救了小鼠的壽命。（Α)全部小鼠的壽命，以小 鼠的存活百分比（％ )表示。WT、Dnm2+/_和Mtml-/yDnm2+/_組的全部小鼠存活至12月齡。最 老的小鼠活到2歲。（B)描繪了全部小鼠的全身重量。只有Mtml-/y小鼠表現出體重的顯著降 低。（C)借助DW2免疫反應性多肽的密度法并使用GAPDH上樣標準化而確定的DW2蛋白的相 對水平。以與WT對照裂解液的倍數差異表示·Μ2水平。對8周齡、16周齡和6月齡小鼠的來自 膈膜(DIA) (C)、腓腸肌(GAS) (D)、脛骨前肌(ΤΑ) (Ε)和比目魚肌(SOL) (F)的肌肉的表達進行 確定，η = 2-8只小鼠。通過qRT-PCR分析對mRNA水平進行定量，相對于GAPDH上樣對照來表示 M2水平(G)。圖表示3個獨立的實驗。GAS(H)、TA(I)和SOL(J)肌肉重量(n = 5-13只小鼠）。 全部的圖描繪平均值土s · e.m. (*ρ〈0·05，**ρ〈0·01，林*p〈0.001) (w =周齡，m=月齡）。
[0023] 圖3。CNM組織學特征在具有降低的·Μ2表達的Mtml _/y小鼠中被大幅挽救。使用蘇 木精和伊紅(HE)(上側子圖）或琥珀酸脫氫酶(SDH)(下側子圖）對來自于8周齡(A)或16周齡 (C)小鼠的TA橫切片進行染色，并借助光學顯微鏡進行觀察。比例尺300mm;高放大倍數比例 尺25mm JB)通過透射電子顯微鏡觀察肌肉橫切片。箭頭指示細胞核周圍的膜積聚。比例尺 0.5mm。對來自于8周齡(D)和16周齡(E)TA肌肉的肌肉橫切片的纖維面積進行分析。將纖維 大小以500mm 2的間隔分組，并以各組(n = 5-7只小鼠）的總纖維百分比表示。（F)對具有內部 核或中央核的纖維的頻率進行打分(η = 5只小鼠）。內部核定義為非肌膜下也非中央的核。 由于Mtml-/y小鼠通常在16周齡前死亡，未測量16周齡Mtml-/y小鼠的圖像以及統計(將不 能獲得標記為NA)。全部的圖描繪平均值土 s. e.m. (*p〈0.05，#p〈0.01，*#p〈0.001)。
[0024] 圖4。具有降低的·Μ2表達的小鼠肌肉力量和耐力得到改善。（A)每周對3 周齡至8周齡的小鼠進行線繩測試(string test)。對于掉落，認為等于20秒。（B)在8周齡和 16周齡小鼠中測量TA肌肉的絕對最大力量。（C)TA肌肉的比最大力量(specific maximal force)表示相對于肌肉重量的絕對最大力量。(D)將ΤΑ肌肉易疲勞性測量為到達(B)中所產 生的最大肌肉力量的50 %所花費的時間。由于極端的肌肉力弱，無法測定8周齡小 鼠的肌肉疲勞。Mtml-/y小鼠通常在16周齡以前死亡，因此未在該年齡進行測定(NA)。全部 的圖描繪平均值土s · e.m. (*ρ〈0·05，**ρ〈0·01，***ρ〈0·001) (n =每組至少5只小鼠）。
[0025]圖5。具有降低的DW2表達的Mtm 1 _/y小鼠具有改善的肌肉超微結構。利用透射電 子顯微鏡對來自于8周齡(A)和16周齡(B)小鼠的TA肌肉進行成像。比例尺0· 5mm(A)或1mm
[0026]圖6。來自于8周齡小鼠的TA肌肉中的三聯體定位。(A)使用RyRl對肌肉橫切片和肌 肉縱切片進行染色，或使用RyRl(綠)和α-輔肌動蛋白（紅)抗體對肌肉橫切片和肌肉縱切片 進行共染，并借助共聚焦顯微鏡進行成像。比例尺20mm(橫切圖像)或5mm(縱切圖像）。0)使 用透射電子顯微鏡(TEM)對來自于8周齡小鼠的TA肌肉進行成像。箭頭指向正常定位的三聯 體，顯示在高放大倍數插圖中。比例尺200nm，高放大倍數比例尺lOOnmJC)來自（B)中的8周 齡TA肌肉每個肌小節可見的三聯體百分比。圖描繪了平均值±^!11.(邙<0.05)。（0)用小 窩蛋白3對肌肉橫切片進行染色，并使用共聚焦顯微鏡成像。比例尺50mm。
[0027]圖7。具有降低的DNM2表達的小鼠的長期表型。(A) 12月齡的WT小鼠（左)和 Mtml-/y Dnm2+/_小鼠（右）。0)足跡測試表明后足之間分開的角度。原始數據圖像位于圖 S7中。（C)4爪抓握測試。（D)在加速模式（5分鐘內4-40rpm)下進行旋轉棒測試。記錄小鼠掉 落的時間。對每只小鼠每天的三次測試進行記錄。（E)懸吊測試要求將小鼠懸吊于籠蓋多達 60秒。每只小鼠進行三次測試。（F)對6月齡的小鼠進行靜息呼吸測定的體積描記測試。顯示 吸氣時間、呼氣時間、弛豫(re 1 axation)時間和呼吸頻率;全部其它測定在圖S8中示出。(G) 在來自6月齡小鼠的膈膜條中進行膈膜最大肌肉力量測試。描繪了在抽搐和強直（100Hz)下 的力一頻率關系和比最大力量。(H)利用HE對膈肌縱切片進行染色，并借助光學顯微鏡進行 成像。比例尺l〇〇mm。全部的圖描繪平均值土s.e.m. (*ρ〈0·05，**ρ〈0·01，***ρ〈0·001)。11 = 至少5只小鼠。
[0028]圖8。僅在骨骼肌中減少·Μ2改善了 小鼠的壽命和病理。(Α)以存活的百分 比示出全部小鼠的壽命。以Mtm 1 _/y Dnm2skm+/_描繪在肌肉中具有降低的DW2的Mtml_/y 小鼠。（B)小鼠的體重。（C)解剖后立即對腓腸肌(GAS)、脛骨前肌(ΤΑ)和比目魚肌(SOL)肌肉 進行稱重。圖表示肌肉重量占全身重量的百分比（ n = 5-12只小鼠）。〇)使用HE(上側子圖） 或SDH(下側子圖）對來自于16周齡小鼠的TA橫切片進行染色。比例尺100mm。（E)對來自于16 周齡TA肌肉的橫切片的纖維面積進行分析。將纖維大小以500mm 2的間隔分組，并以每組(η = 4-7只小鼠）的總纖維百分比表示。（F)對ΤΑ肌肉中具有內部核或中央核的纖維的頻率進 行計數(η = 4-7只小鼠）。(G)借助·Μ2免疫反應性多肽的密度測定法并使用GATOH上樣對照 標準化而確定的DW2蛋白的相對水平。以與WT對照裂解液的倍數差異表示DW2水平(η = 4-7 只小鼠）。全部的圖描繪平均值土s.e.m.(*p〈0.05，#p〈0.01，*#p〈0.001)。
[0029]圖9。癥狀發作后骨骼肌中·Μ2的降低改善了小鼠的壽命和病理。（A)以存 活的百分比示出全部小鼠的壽命。以Mtml-/y Dnm2(1)skm+A描繪在肌肉中具有降低的·Μ2的 Mtml-/y小鼠。（Β)小鼠的體重。（C)解剖后立即對腓腸肌(GAS)、脛骨前肌(ΤΑ)和比目魚肌 (S0L)肌肉進行稱重。圖表示肌肉重量占全身重量的百分比（n = 5-12只小鼠）。〇)使用HE (上側子圖）或SDH(下側子圖）對來自于16周齡小鼠的ΤΑ橫切片進行染色。比例尺lOOmmjE) 對來自于16周齡ΤΑ肌肉的橫切片的纖維面積進行分析。將纖維大小以500mm 2的間隔分組， 并以每組(n = 4-7只小鼠）的總纖維百分比表示。（F)對具有內部核或中央核的纖維的頻率 進行計數(η = 4-7只小鼠）。（G)借助·Μ2免疫反應性多肽的密度測定法并使用GATOH上樣標 準化而確定的·Μ2蛋白的相對水平。以與WT對照裂解液的倍數差異表示·Μ2水平(η = 5-7 只小鼠）。全部的圖描繪平均值土s.e.m.(*p〈0.05，#p〈0.01，*#p〈0.001)。
[0030] 圖10。革E1向破壞小鼠的Dnm2，制造 Dnm2雜合小鼠。所革E1向的小鼠 Dnm2外顯子8周圍 的基因組區域。預測外顯子8缺失導致框外轉錄。
[0031] 圖11』ηπι2雜合小鼠的生化和表型表征。（A)Dnm2雜合（Dnm2+/_)小鼠和野生型 (WT)小鼠中尿素、鈣和總膽固醇水平的血液分析。（B)WT和Dnm2+/_小鼠的心電圖（ECG)測 定。X軸的值代表如下每個測試下顯示的測定值:RR(兩個R波之間的間隔，以ms測定）；HR = 心率(ms);PR(P-R 波的間隔，ms);QT(Q-T 波的間隔，bpm);QTcBZ(校正的 QLmsCorOJC)全 身重量。（D)全身體組成的Dexascan。以總身體組成的百分比示出瘦質組織（lean tissue) 和脂肪的量。（E)來自于對WT和Dnm2+/_小鼠實施肌肉肌電圖而獲得的單神經傳導速度 (SNCV)的結果。（F)TA肌肉的總質量。TA肌肉的絕對最大力量(G)和比最大力量(mdDTA肌 肉的疲勞測定，以到達產生50 %的最大力量所需要的時間表示疲勞，以秒(s)為單位。分析 的全部小鼠為10-15周齡雄性小鼠 （n =每組8-12只）。全部的圖描繪平均值土s.e.m.，所評 估的參數在WT和Dnm2+/_小鼠之間均無顯著差異。
[0032]圖12JA肌肉中發動蛋白2、肌管素 (myotubularin)和α-輔肌動蛋白的定位。利用 M2-R2680抗體(綠)和α-輔肌動蛋白抗體(紅）（A)對來自于8周齡小鼠的肌肉縱切片進行 共染，或利用MTM1-R2827抗體(B)對來自于8周齡小鼠的肌肉縱切片進行染色，并通過共聚 焦顯微鏡進行成像。比例尺5μηι。
[0033] 圖13。在具有降低的發動蛋白2表達的Mtml_/y小鼠的骨骼肌中肌肉萎縮得到挽 救。EDL(A)、跖肌(8)、645(〇、了4(0)、501^化）、心$)和肝(6)的重量以全身重量的百分比表 示(n = 5-15只小鼠）。全部的圖描繪平均值土s.e.m. (*ρ〈0·05，**ρ〈0·01，***p〈0.001)(w = 周齡，m=月齡）。（!〇利用HE(上側子圖）或SDH(下側子圖）對來自于8周齡小鼠的GAS橫切片 (H)或S0L橫切片（I)進行染色。比例尺100μπι。
[0034] 圖14。不同年齡的各種肌肉中的蛋白表達水平。將來自于8周齡(A、D、G、J)、16周齡 (B、E、H)和6月齡(C、F、I、K)的腓腸肌(GAS)(A_C)、脛骨前肌(TA)(D_F)、比目魚肌(G-I) 和膈肌(J、K)肌肉的裂解液進行·Μ2和GATOH(上樣對照）的免疫印跡。在列出的情況下，也 對裂解液進行ΜΤΜ1的印跡。當出現雙帶時，較低的帶代表ΜΤΜ1。將與本研究無關的干擾帶用 叉標記(G、I、J)。
[0035] 圖15。在來自于具有降低的發動蛋白2表達的8周齡Mtml-/y小鼠的ΤΑ肌肉中，結蛋 白定位和三聯體結構組織得到挽救。使用結蛋白抗體(Α)或DHPRa抗體(Β)對來自于8周齡小 鼠的肌肉橫切片進行染色，并通過共聚焦顯微鏡進行成像。在A和B中，比例尺為50μπι(上側 子圖）以及比例尺為20μηι(下側子圖）。注意到Mtml_/y中存在結蛋白的細胞質累積，在大多 數Mtml-/yDnm2+/_纖維中這一現象得到挽救。
[0036] 圖16。來自于6月齡和12月齡小鼠的足跡模式。畫出最佳擬合線來描繪測得的后足 之間的角度。值得注意的是，與WT和Dnm2+/_小鼠相比，Dnm2+/_小鼠用外翻的足行 走。分析數據在圖7B中示出。（B)每月進行前肢抓握測試(前爪）（n =每組至少5只小鼠）。圖 描繪了平均值土s.e.m.。組之間未觀察到顯著差異。
[0037]圖17。具有降低的發動蛋白2表達的6月齡Mtml_/y小鼠的體積描記結果。對靜息小 鼠進行了體積描記測試以評估靜息呼吸模式。全部的圖描繪平均值土s.e.m.。組之間未觀 察到顯著差異。
[0038] 圖18。僅骨骼肌中的發動蛋白2的雜合性缺失改善Mtml-/y小鼠的病理。(A)利用HE 或SDH對來自于16周齡小鼠的ΤΑ橫切片進行染色。比例尺300μπι。對來自于16周齡GAS肌肉 (B)和S0L肌肉（C)的橫切片的纖維面積進行分析。將纖維大小以500μπι 2的間隔分組，并以每 組(η = 3-6只小鼠）的總纖維百分比表示。（D)對具有內部核或中央核的纖維的頻率進行計 數(η = 3-6只小鼠）。對來自于16周齡小鼠的腓腸肌(GAS)(E)、脛骨前肌(TA)(F)、比目魚肌 (S0L)(G)(顯示的圖像來自于同一蛋白印跡）以及膈肌(H)肌肉的裂解液進行DW2、MTM1和 GAPDH(上樣對照）的免疫印跡。全部的圖描繪平均值土s.e.nK(*p〈0.05，#p〈0.01，#*p〈 0.001)〇
[0039] 圖HMtHil-zV Dnm2skm+~j、鼠中的蛋白表達水平。對來自于16周齡小鼠的腓腸肌 (GAS) (A)、脛骨前肌(TA) (B)和膈膜(C)骨骼肌的裂解液進行D匪2、MTM1和GAPDH(上樣對照） 的免疫印跡。
[0040] 圖20。扮111-/-小鼠圍產期死亡;Binl-/-Dnm2+/-小鼠存活且體重增加。圖20-A，以 克示出的體重顯示Binl-/-Dnm2+/_小鼠達到34克。圖20-B，10周齡野生型小鼠和Binl-/-Dnm2+/_小鼠是無法區分的。
[0041 ] 圖21。與野生型小鼠（WT小鼠）相比，在臨床分析中Binl-/-Dnm2+/_小鼠沒有表現 出性能缺陷。（A-F)分析了年輕(2-6月齡)和年老（12-17月齡)Binl-/-Dnm2+/_小鼠。（G-H) Binl-/-Dnm2+/_小鼠和野生型(WT)小鼠在兩種年齡處的比最大力量(相比于肌肉重量的絕 對最大力量)和半弛豫時間都相似，支持正常的肌肉力量并且抗疲勞。
[0042] 圖22。B in 1 -/-Dnm2+/_小鼠表現出與對照接近的組織學。B i η 1 -/-Dnm2+/_小鼠顯 示出具有正常形狀和大小(HE:蘇木精-伊紅染色）以及正常氧化染色（SDH)的肌纖維。它們 表現出核更中央化的傾向，而沒有過度再生的跡象。
[0043] 圖23。纖維大小(A)和核位置小鼠表現出類似的纖維大小，并 具有較小纖維的輕微傾向，當比較全部纖維直徑的平均值時，該傾向不顯著（左）Ainl-/-Dnm2+/_小鼠具有更中央化的核(右）。
[0044]圖24。發動蛋白2mRNA外顯子和發動蛋白2蛋白結構域:a)選擇用于被shRNA靶向的 發動蛋白2mRNA區域(上），導致中央核性肌病的·Μ2中的顯性突變(下）A)GTPase結構域、 中間(MID)結構域、普列克底物蛋白同源(PH)結構域、GTPase效應結構域(GED)和富含脯氨 酸的結構域(PRD)。
[0045]圖25。在shDnm2轉染的HEK細胞中發動蛋白2的蛋白表達。a)利用h_M2(編碼人 M2的質粒)和靶向·Μ2πιΚΝΑ的shRNA共轉染的HEK(人胚腎）細胞的Wetern印跡。b)密度測 定分析顯示shRNA編號(N°)B、C、F、I和J靶向hDNM2,并有效降低hDNM2的表達。
[0046] 圖26。在shDnm2轉染的C2C12細胞中發動蛋白2的mRNA表達。在shRNA轉染的C2C12 (小鼠成肌細胞）中評價Dnm2mRNA的水平。所選擇的shRNA有效地將Dnm2mRNA減少至約50 %。 [0047]圖27。在注射AAV的WT(野生型）脛骨前肌(TA)肌肉中發動蛋白2的蛋白表達。a)注 射表達shDnm2編號C或干擾（scrambled)序列的AAV的WT TA的Western印跡。b)密度測定分 析顯示，shRNA編號C在體內靶向Dnm2，并且，與注射AAV-干擾的WT相比，shRNA編號C將Dnm2 的表達降低至約60%。
[0048] 圖28DAAV肌肉內注射5周后K0 TA的重量和Dnm2蛋白表達。a)與注射AAV- 干擾的ΤΑ相比，肌肉內注射編碼shDnm2編號C的AAV示出肌肉重量增加。b)注射表達shDnm2 編號C或干擾序列的AAV的K0腓腸肌的Western印跡。
[0049] 圖29。在AAV肌肉內注射5周后，利用H&E (蘇木精&伊紅)對Mtml_/y K0腓腸肌肌肉 橫切片進行染色。與注射AAV-干擾序列的K0腓腸肌（左）相比，肌肉內注射編碼 shDnm2編號C的AAV(右）顯示出在Mtml-/y K0腓腸肌中肌肉組織學的改善和纖維大小的增 加。
[0050] 圖30。在注射AAV的K0腓腸肌肌肉橫切片中的纖維大小分布、纖維大小平 均值&核位置的定量。a)纖維大小分布顯示，與注射AAV-干擾的K0腓腸肌相比，注 射AAV-shDnm2編號C的Mtml-/y K0腓腸肌展示出更大的纖維。b)纖維大小平均值測定表明， 與注射AAV-干擾的K0腓腸肌相比，注射AAV-shDnm2的Mtml-/y K0腓腸肌展現出較 大的纖維（大小幾乎加倍）。〇)與注射AAV-干擾的K0腓腸肌相比，注射AAV-shDnm2 編號C的Mtml-/y K0腓腸肌在肌纖維內展現出的位置異常的核較少。對于(a)&(b)，測定了〉 800個纖維。對于(c )，每個樣品對1000個纖維計數。
【具體實施方式】
[0051] 除非另有定義，本文所使用的全部技術術語和科學術語具有與本發明所屬領域中 的普通技術人員所一般理解的含義相同的含義。
[0052] 發動蛋白2由DW2基因 （Gene ID 1785)編碼。更確切地說，D匪2基因位于第19號染 色體第10,919,884堿基對至第10,942,586堿基對（61?(：1137/1^19發布），或位于％_ 000019 · 10位置的第10，718,053堿基對至第10，831,910堿基對(GRCh38/hgl9)。發動蛋白2 基因或基因產物也被稱作其它名稱，包括但不限于CMTDI1、CMTDIB、DI-CMTB、DYN2、DYN2_ HUMAN、發動蛋白 II、DYNII。
[0053] 發動蛋白2抑制劑
[0054] 本文所使用的術語"發動蛋白2抑制劑"指能夠特異性地降低發動蛋白2的表達或 者抑制發動蛋白2的活性或功能的任何分子。優選地，此類發動蛋白2抑制劑是直接抑制劑， 這意味著它直接與發動蛋白2蛋白或編碼所述發動蛋白2的核酸或它們的一部分相互作用。 根據本發明的發動蛋白2抑制劑能夠在體內和/或體外抑制或降低發動蛋白2的功能活性。 抑制劑可以將發動蛋白2的功能活性抑制至少約30%，優選至少約50%，優選至少約70%、 75 %或80 %，更優選85 %、90 %或95 %。特別地，抑制劑可以將發動蛋白2的表達抑制至少約 10%，優選至少約30%，優選至少約50%，優選至少約70%、75%或80%，更優選85%、90% 或 95%。
[0055] 本發明的發動蛋白2抑制劑可以通過阻斷和/或抑制發動蛋白2的活性或功能而起 作用。這例如可以通過抑制發動蛋白2的酶活性來實現。本領域技術人員可以根據已知的方 法，例如通過測試網格蛋白介導的內吞作用中發動蛋白2的功能或GTPase活性，來容易地評 價發動蛋白2的功能活性或酶活性(Macia E.等，Dynasore,a cell-permeable inhibitor of dynamin:Developmental cell 10,839_850,2006年6月）。就61?&86活性或脂質結合、亞 細胞定位、網格蛋白介導的內吞作用、突觸囊泡內吞作用的抑制劑而言，可以使用如下文獻 所描述的方法:McCluskey等，Traffic，2013 ;McGeachie等，ACS Chem Biol，2013。就發動蛋 白2的GTPase活性、寡聚化、脂質結合而言，可以使用如下文獻所描述的方法:Wang等，J BiolChem2010;SKennistor^PLemmon，EMB0J，2010〇
[0056] 本發明的發動蛋白2抑制劑還可以通過阻斷和/或抑制發動蛋白2的表達(包括轉 錄、剪接、轉錄成熟或翻譯)起作用。可借助本領域技術人員所知的任何手段對發動蛋白2表 達的降低或抑制進行評估，所述手段包括但不限于:例如使用抗發動蛋白2抗體，借助例如 We s t ern印跡分析(例如如圖1所示)或EL ISA來評價發動蛋白2的蛋白水平;和/或例如使用 任何可獲得的技術(例如定量PCR)來評價發動蛋白2的mRNA水平(例如如圖2所示）。
[0057] 發動蛋白2抑制劑優選選自于由如下抑制劑所組成的組:針對發動蛋白2的抗體； 特異性干擾發動蛋白2表達的核酸分子;和抑制發動蛋白2酶活性（即，抑制GTPase活性）、表 達(如通過抑制啟動子、剪接或翻譯)或功能(如抑制寡聚化、活化、脂質結合或伴侶結合)的 小分子。
[0058] 根據具體的實施方式，發動蛋白2抑制劑選自于由針對發動蛋白2的抗體或特異性 干擾發動蛋白2表達的核酸分子(或核苷酸)所組成的組。在優選的實施方式中，發動蛋白2 抑制劑選自于由特異性干擾發動蛋白2表達的核酸分子所組成的組。根據本發明，該特異性 干擾發動蛋白2表達的核酸分子通常是非天然存在的核酸。在具體的實施方式中，發動蛋白 2抑制劑是特異性干擾發動蛋白2表達的RNAi、反義核酸或核酶。在具體的實施方式中，發動 蛋白2抑制劑是siRNA或shRNA。
[0059] 在本發明中，所述核酸能夠與編碼發動蛋白2的基因或轉錄物特異性雜交。"特異 性雜交"意味著在嚴格條件下雜交。具體而言，嚴格條件可由如下條件定義:鹽濃度、有機溶 劑(如甲酰胺）的濃度、溫度和本領域公知的其它條件。典型的嚴格雜交條件包括30°C以上、 優選35°C以上、更優選超過42°C的溫度，和/或低于約500mM、優選低于200mM的鹽度。然而， 應理解的是，根據本發明的核酸不需要具有與靶序列100%的互補性來進行特異性雜交。具 體而言，具有至少相當于約90%的互補性程度的核酸能夠特異性雜交。優選地，根據本發明 的核酸和靶序列之間的互補性程度相當于至少95%、96%、97%、98%、99%或100%。
[0060] 術語"互補的"或"互補性"指多核苷酸與另一多核苷酸分子形成堿基對的能力。堿 基對典型地由反平行多核苷酸鏈中的核苷酸單元之間的氫鍵形成。互補的多核苷酸鏈能夠 以Watson-Crick方式進行堿基配對(例如，A與T、A與U、C與G)，或以允許雙鏈形成的任何其 它方式進行堿基配對。如本領域技術人員所知曉的，當使用RNA而不是DNA時，認為尿嘧啶而 不是胸腺嘧啶為與腺苷互補的堿基。然而，除非另有說明，在本發明的上下文中表示為U時， 隱含能夠替換為T。完美互補性或100%互補性指一條多核苷酸鏈的每個核苷酸單元均能夠 結合第二多核苷酸鏈的核苷酸單元的情況。不夠完美的互補性指兩條鏈的一些但不是全部 核苷酸單元能夠相互結合的情況。例如，對于兩個20-mer而言，如果各鏈僅兩個堿基對能夠 相互結合，多核苷酸鏈展現出10 %的互補性。同樣地，如果各鏈的18個堿基對能夠相互結 合，多核苷酸鏈展現出90 %的互補性。
[0061 ]本文所使用的術語"iRNA"、"RNAi"或"干擾RNA"指能夠下調靶蛋白表達的任何 RNA。它包括小干擾RNA(siRNA)、雙鏈RNA(dsRNA)、單鏈RNA(ssRNA)和短發夾RNA(shRNA)分 子。RNA干擾定義為dsRNA在轉錄后水平特異性地阻遏靶基因表達的現象。在正常情況下， RNA干擾由數千堿基對長度的雙鏈RNA分子(dsRNA)引發。在體內，導入細胞的dsRNA被切割 為稱為siRNA的短dsRNA分子的混合物。催化該切割的酶Dicer是包含RNase III結構域的內 切RNase(end〇-RNase) (Bernstein，Caudy等，200INature，2001年 1 月 18 日；409(6818) :363- 6)。在哺乳動物細胞中，由Dicer產生的siRNA長度為21-23bp，其具有19或20個核苷酸的雙 鏈序列、2個核苷酸的3'垂懸和5'-三磷酸末端(Zamore，Tuschl等，Cell，2000年3月31日， 101(1) :25-33;Elbashir，Lendeckel等，Genes Dev，2001年1 月 15 日，15(2): 188-200; Elbashir，Martinez等，EMBO J，2001 年 12月3 日，20(23):6877-88)。根據本發明，丨1?祖不包 括microRNA。
[0062] 大量專利和專利申請(例如W0 99/32619)已一般性地描述了siRNA分子抑制基因 表達的用途。Z，Wang等，Pharm Res(2011)28:2983-2995的綜述中還詳述了借助siRNA和 shRNA的RNA干擾治療。
[0063] 通常將siRNA或shRNA設計為針對翻譯起始密碼子下游19-50個核苷酸的區域，而 通常避開5'UTR(非翻譯區）和3'UTR。應該對所選擇的siRNA或shRNA靶序列進行針對EST數 據庫的BLAST搜索，以確保靶向唯一的期望的基因。有助于siRNA或shRNA的制備和使用的多 種產品為商購可得的。
[0064] 在優選的實施方式中，RNAi分子是長度為至少約10-40個核苷酸、優選約15-30堿 基核苷酸的siRNA。
[0065] siRNA或shRNA可包括天然存在的RNA、合成的RNA或重組產生的RNA，以及通過添 加、刪除、置換和/或改變一個或多個核苷酸而不同于天然存在的RNA的改造 RNA。此類改造 可包括將非核苷酸物質添加至例如siRNA的分子末端或添加至siRNA的一個或多個內部核 苷酸，包括使s iRNA耐受核酸酶消化的修飾。
[0066] -些發動蛋白2抑制核酸是商購可得的。例如可以列舉但不限于如下：Abno va-Novus Biologicals，參考號為H00001785-R05-H00001785-R08的發動蛋白2RNAi;Santa Cruz Biotechnology，參考號為sc-35236的發動蛋白 II siRNA(h)，參考號為sc-35236-PR 的發動蛋白II(h)-PR，參考號為sc-35236-SH的發動蛋白II shRNA質粒(h)，參考號為sc-35236-V的發動蛋白II shRNA(h)慢病毒顆粒。
[0067] 在具體的實施方式中，特異性干擾發動蛋白2的核酸分子是特異性干擾發動蛋白2 的全長肌肉人cDNA序列（如SEQ ID No 1所示，添加有12b的轉錄變體1(NM_001005360.2) (外顯子10a，13ter))的至少一部分的核酸。更具體而言，根據該實施方式，RNAi分子是長度 為至少約10-40個核苷酸的siRNA或shRNA、優選約15-30堿基核苷酸的iRNA。在具體的實施 方式中，s iRNA或shRNA靶向發動蛋白2mRNA的至少一個外顯子;更具體而言，發動蛋白2mRNA 的外顯子1、4、5、12b、13、15、17和21中的至少一個。
[0068] 在具體的實施方式中，特異性干擾發動蛋白2的核酸分子包含選自于由如下序列 所組成的組中的序列、或者特異性干擾發動蛋白2的核酸分子由選自于由如下序列所組成 的組中的序列組成：

[0085]也可用反義核酸來下調發動蛋白2的表達。反義核酸可與編碼發動蛋白2的正義核 酸的全部或部分互補(例如與雙鏈cDNA分子的編碼鏈互補或與mRNA序列互補），認為反義核 酸干擾祀mRNA的翻譯。本發明使用的反義核酸特異性干擾發動蛋白2的表達。
[0086]根據一個實施方式，反義核酸是與編碼發動蛋白2的革EmRNA互補的RNA分子。
[0087]根據另一實施方式，反義核苷酸表不與編碼發動蛋白2的pre-mRNA的一部分互補 的單鏈核酸序列(DNA或RNA)。具體而言，將本發明的反義核苷酸設計為阻斷發動蛋白2pre-mRNA中的剪接受體（SA)位點和/或外顯子剪接增強子(ESE)和/或分支點和/或能夠調制 pre-mRNA剪接的任何序列，即，將其設計為與包含SA、ESE、分支點序列或能夠調制pre-mRNA 剪接的任何序列的發動蛋白2pre-mRNA的一部分互補。更具體而言，反義核苷酸用于誘導發 動蛋白2pre-mRNA內的外顯子跳躍(exon-skipping)，從而在所得mRNA中引起移碼，這產生 含有提前終止密碼子的截短cDNA。這種策略因此允許DW2蛋白水平降低。在具體的實施方 式中，反義核苷酸用于誘導發動蛋白2pr e-mRNA內的外顯子跳躍。例如，將所使用的反義核 苷酸設計為特異性誘導外顯子2或外顯子8跳躍。在具體的實施方式中，本發明的反義核苷 酸能夠誘導人·Μ2πιΚΝΑ中包含提前終止密碼子。顯示外顯子2或外顯子8跳躍導致發動蛋白 2的蛋白缺失（如如下文獻所描述："Reducing dynamin 2expression rescues X-linked centronuclear myopathy"，Cowling BS，Chevremont T，Prokic I，Kretz C,Ferry A， Coirault C，Koutsopoulos 0，Laugel V,Romero NB，Laporte J，J Clin Invest，2014年3 月3 日，124(3) :1350-63(1〇1:10.1172/7(：171206，電子出版：2014年2月24日；以及1^116111 E，Pereira JA，Suter U，Hum Mol Genet，2013年11月1日，22(21):4417-29doi:10.1093/ hmg/ddt292，電子出版:2013年6月27日）。
[0088]在具體的實施方式中，將反義核苷酸設計為特異性誘導·Μ2外顯子2或外顯子8跳 躍，并包含如下序列中的一條，或由如下序列中的一條組成：
[0089] U7-Ex2(具有反義U7snRNA，靶向DNM2外顯子2的跳躍），包含如下序列：
[0090] SEQ ID No 26：GTCACCCGGAGGCCTCTCATTCTGCAGCTC
[0091] U7-Ex8(具有反義U7snRNA，靶向DNM2外顯子8的跳躍），包含如下序列：
[0092] SEQ ID No 27：ACACACTAGAGTTGTCTGGTGGAGCCCGCATCA
[0093] 反義核酸的長度可為例如約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個核苷酸。具體而 言，反義RNA分子的長度通常為15-50個核苷酸。可使用本領域所知曉的程序，利用化學合成 和酶連接反應來構建本發明使用的反義核酸。具體而言，反義RNA可以是化學合成的、通過 體外轉錄由線性模板(例如PCR產物)或環狀模板(例如病毒或非病毒載體)產生的、或者通 過體內轉錄由病毒或非病毒載體產生的。可對反義核酸進行修飾，以具有增強的穩定性、核 酸酶耐受性、靶標特異性和改進的藥理學特性。例如，反義核酸可以包含設計用于增加反義 和正義核酸之間形成的雙鏈的物理穩定性的修飾的核苷酸或/和骨架。
[0094] 在本發明的上下文中，"核酶"是能夠切割核酶與之具有互補區的單鏈核酸（如 mRNA)的具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子。因此，核酶可用于催化性地切割mRNA轉錄 物，從而抑制由該mRNA編碼的蛋白的翻譯。可利用本領域公知的方法設計、產生和給予對功 能性發動蛋白2具有特異性的核酶分子（參見例如Fanning和Symonds(2006)RNA Towards Medicine(Handbook of Experimental Pharmacology)，Springer編：289-303頁）。
[0095] 根據本發明，也可將基因組編輯用作工具。基因組編輯是一類基因工程，其中，使 用人工工程化的核酸酶或"分子剪刀"將DNA插入基因組、從基因組中替換或從基因組中移 除。核酸酶在基因組中的期望位置處制造特定的雙鏈斷裂(DSB)，并利用細胞內源機制借助 同源重組(HR)和非同源末端連接(NHEJ)的天然過程來修復被誘導的斷裂。目前使用的是四 個家族的工程化核酸酶：鋅指核酸酶（ZFN)、轉錄激活因子樣效應因子核酸酶（TALEN)、 CRISPR/Cas系統（更具體而言，如在如下文獻中描述的Cas9系統：P.Mali等，Nature Methods，第10卷第10期，2013年10月）或工程化大范圍核酸酶(meganuclease)再工程化的 歸巢(homing)核酸內切酶。根據本發明，可將所述核酸酶作為DNA或mRNA遞送至細胞，將此 類DNA或mRNA工程化以靶向·Μ2基因。根據一個實施方式，所述發動蛋白2抑制劑是經工程 化以靶向·Μ2基因以及遞送使用基因組編輯療法的核酸酶的DNA或mRNA，或者，所述發動蛋 白2抑制劑是經工程化以靶向DMN2的使用基因組編輯療法的核酸酶。
[0096] 可以將根據本發明所使用的如上定義的核苷酸以DNA前體或編碼它們的分子的形 式進行給藥。
[0097] 對于體內使用，可借助化學修飾(如磷酸骨架修飾(例如硫代磷酸鍵））對本發明的 核苷酸進行穩定化。可以如下形式給予本發明的核苷酸:游離(裸的）形式;或使用增強穩定 性和/或靶向性的遞送系統(例如脂質體）；或納入至其它載體(如水凝膠、環糊精、可生物降 解的納米微囊、生物粘附性微球或蛋白性載體）；或與陽離子肽組合。也可將其偶聯至仿生 細胞穿透肽。也可以其前體或編碼DNA的形式給藥。核苷酸的化學穩定化版本還包括"嗎啉 代"（磷酰二胺嗎啉代寡聚物-PM0)、2'-0-甲基寡聚物、帶AcHN-(RXRRBR)2XB肽標簽的ΡΜ0 (R，精氨酸;X，6-氨基己酸;B，（R)_丙氨酸）（PPMO)、三環DNA或小核（sn)RNA。可實現該效果 的后幾種形式的核苷酸為小核RNA分子，包括1]1、1]2、1]4、1]4&丨&〇、1]5、1]7、1]11和1]12(或其它 UsnRNP)，優選U7snRNA(如上識別的SEQ ID No 26和SEQ ID No 27)，特別是與基于但不限 于慢病毒、逆轉錄病毒或腺相關病毒的病毒轉移法組合使用的情況。全部這些技術為本領 域所公知。
[0098]本發明的特異性干擾發動蛋白2表達的核酸分子可單獨或與載體共同遞送至體 內。在最廣的意義上，"載體"是能夠促進核苷酸轉移至細胞(優選為表達·Μ2的細胞）的任 何媒介。優選地，與無載體所獲得的降解程度相比，載體將核苷酸運送至細胞使得所述核苷 酸具有降低的降解程度。一般來說，本發明中有用的載體包括但不限于:已通過插入或納入 本發明的核苷酸進行處理的質粒、噬菌粒、病毒以及衍生自病毒或細菌來源的其它媒介。病 毒載體是優選的載體類型，包括但不限于來自于如下病毒的核酸序列:慢病毒(如HIV-1)、 逆轉錄病毒（如莫洛尼鼠類白血病病毒、腺病毒、腺相關病毒）；SV40型病毒;皰疹病毒（如 HSV-1病毒和痘苗病毒）。可容易地使用本文未指出然而本領域已知的其它載體。在其臨床 應用已被驗證并可用于遞送核苷酸的載體中，慢病毒、逆轉錄病毒和腺相關病毒(AAV)顯示 出用于外顯子跳躍策略的較大潛力。
[0099]本文所使用的術語"抗體"旨在廣義上指任何免疫結合劑（如以6、181、184、18〇和 IgE)以及人源化抗體或嵌合抗體。在某些實施方式中，由于IgG和IgM為在生理狀態下最常 見的抗體并且最容易制造，優選IgG和/或IgM。術語"抗體"用于指具有抗原結合區的任何抗 體樣分子，包括抗體片段如Fab'、Fab、F(ab'）2、單結構域抗體(DAB)、Fv、scFv(單鏈Fv)等。 制備和使用多種基于抗體的構建體和片段的技術為本領域所公知。制備和表征抗體的手段 也為本領域所公知（參見例如Harlow，E ·和Lane，D. (1988)Antibodies:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory編）。
[0100] "人源化"抗體是其中的一個或多個人免疫球蛋白的恒定和可變骨架區融合至動 物免疫球蛋白的結合區（例如CDR)的抗體。本發明涉及的"人源化"抗體是來自于小鼠、大鼠 或其它物種并帶有人的恒定和/或可變區結構域的嵌合抗體;雙特異性抗體;重組抗體和工 程化抗體，以及上述抗體的片段。此類人源化抗體設計為保留非人抗體(所述結合區由其衍 生而來)的結合特異性，但避免針對該非人抗體的免疫反應。
[0101] "嵌合"抗體是具有如下特征的抗體分子：（a)恒定區或其部分被改變、替換或交 換，從而抗原結合位點（可變區)連接至不同或改變的類型、效應因子功能和/或物種的恒定 區，或賦予嵌合抗體新特性的完全不同的分子(例如酶、毒素、激素、生長因子、藥物等）；或 (b)可變區或其部分被具有不同或改變的抗原特異性的可變區交換、替換或改變。
[0102] 針對發動蛋白2的抗體為商購可得的，例如Novus Biologicals出售或制造的如下 抗體：目錄編號：發動蛋白2抗體NB300-617、發動蛋白2抗體NBP2-16244、發動蛋白2抗體 (6C9)H00001785-M01; Santa Cruz Biotechnology 出售或制造的如下抗體：目錄編號：sc_ 81150、3(：-6400、8(3-166525、8(3-166669、8(3-166526;80^〇8(^61^68出售或制造的抗體抗 M2(小鼠抗體，610264);或IGBMC-Illkirch出售或制造的抗體抗·Μ2:Κ2679、Κ2680、 R2865、R2866、R2640或R2641。
[0103] 在另一具體的實施方式中，發動蛋白2抑制劑是抑制發動蛋白2酶活性或功能的小 分子。
[0104] 本文所使用的術語"抑制發動蛋白2的活性、表達或功能的小分子"指具有抑制或 降低發動蛋白2的活性、表達或功能的能力的小分子，可以是有機或無機化合物，通常小于 1000道爾頓。該小分子可以來自于任何已知的生物(包括但不限于動物、植物、細菌、真菌和 病毒)或來自于合成分子庫。可借助本文檔描述的方法識別抑制發動蛋白2的活性、表達或 功能的小分子。
[0105] 發動蛋白抑制劑在Harper CB等，Trends Cell Biol.，2013年2月，23(2) :90-101， 綜述中描述。在具體的實施方式中，此類分子選自于由如下分子所組成的組：
[0106] -Dynasore (發動蛋白1和發動蛋白2的非競爭性、細胞透過性縮氨基脲 (semi carbazone)化合物抑制劑一 CAS編號304448-55-3 )，其化學名稱是3-羥基萘-2-甲酸 (3,4-二羥基苯亞甲基)酰肼，
[0107] 一取(11'〇17-〇711&8(^6(發動蛋白2的強效抑制劑（1〇5() = 2.641^))(取(11'〇叉7-Dynasore是發動蛋白抑制劑Dynasore的細胞透過性羥基化類似物一 CAS編號1256493-34-1)，其化學名稱是3-羥基-N'-[(2,4,5-三羥基苯基)亞甲基]萘-2-甲酰肼，
[0108] 一十四烷基三甲基溴化銨（CAS編號1119-97-7)，由Abeam以MiTMAB?(abl20466)的 名稱銷售(細胞透過性發動蛋白1和發動蛋白2抑制劑(對于發動蛋白II的抑制，IC 5Q = 8.4y Μ)。它靶向普列克底物蛋白同源(PH)(脂質結合)結構域。它抑制受體介導的內吞作用和突 觸囊泡內吞作用（IC 5〇值2.2μΜ)，
[0109] - Phthaladyn-23(細胞透過性鄰苯二甲酰亞胺化合物，據報道抑制發動蛋白 2GTPase活性（1(：5〇 = 63以厘）），？11也&1&(^11-23的化學名稱是4-氯-2-((2-(3-硝基苯基)-1， 3_二氧代-2,3-二氫-1H-異吲哚-5-羰基)-氨基)-苯甲酸，
[0110] -Dynole 34_2，其為發動蛋白抑制劑V( sebt. com)，作用于GTPase活性，對GTP無 競爭性，Dynole 34-2的化學名稱是2-氰基-N-辛基-3-[l-(3-二甲基氨丙基)-1Η-吲哚-3-基]丙烯酰胺，
[0111] - Μ-divi-l (線粒體分裂抑制劑，IC5〇= 10μΜ ) (sebt · com)，M-divi_l的化學名稱 是3-(2,4-二氯-5-甲氧基苯基）-2-硫烷基喹唑啉-4(3!1)-酮（3-(2,4-01(^1(^〇-5-methoxyphenyl)-2-sulfanylquinazolin-4(3H)-〇ne),
[0112] - Iminodyn_22/17(sebt · com) (Iminodyn 22: IC5〇 = 390nM，作用于GTPase變構位 點，相對于GTP顯示非競爭性拮抗作用），Iminodyn 22的化學名稱是N，N'_(丙烷-1，3-二基） 雙(7，8_二羥基-2-亞氨基-2H-苯并吡喃-3-甲酰胺），Iminodyn 17的化學名稱是N，N'_(乙 烷-1，2-二基)雙(7，8-二羥基-2-亞氨基-2H-苯并吡喃-3-甲酰胺），
[0113] -OcTMAB，即十八烷基三甲基溴化銨(abcam.com)，它靶向F Η結構域，
[0114] 一發動蛋白抑制肽(Tocris Biosciences 1774):具有氨基酸序列QVPSRPNRAP，
[0115] 一 Dyng〇-4a(IC5Q - 2·5μΜ)，它作用于 GTPase 變構位點，Dyngo_4a 的化學名稱是 3-羥基-N ' -[ (2，4，5-三羥基苯基)亞甲基]萘-2-甲酰肼，
[0116] 一 RTIL-13(IC5Q - 2.3μΜ)，它是靶向PH結構域的去甲斑蝥素支架，RTIL-13的化學 名稱是4-(Ν，Ν-二甲基-Ν-十八烷基-Ν-乙基)-4-氮雜-10-氧雜三環-[5.2.1 ]癸烷-3，5-二 酮溴化物。
[0117]發動蛋白2抑制劑的用途
[0118]本發明涉及通過向有需要的患者給予治療有效量的如上述定義的發動蛋白2抑制 劑來治療中央核性肌病的方法，還涉及此類發動蛋白2抑制劑在治療中央核性肌病中的用 途。本發明還涉及發動蛋白2抑制劑在制造用于治療中央核性肌病的藥物組合物中的用途。 本發明還涉及用于治療中央核性肌病的發動蛋白2抑制劑。
[0119] 此外，本發明涉及包含發動蛋白2抑制劑和任選的藥學上可接受的載體的藥物組 合物，具體而言用于中央核性肌病的治療。
[0120] 在本發明具體的實施方式中，待治療的疾病選自于由如下疾病所組成的組:X連鎖 CNM(XLCNM)、常染色體隱性CNM(ARCM〇和常染色體顯性CNM(ADCNM)。在更具體的優選實施 方式中，中央核性肌病是XLCNM(又稱肌管肌病)或ARCNM。在另一個具體的實施方式中，中央 核性肌病是BIN1突變造成的中央核性肌病，該病理可以是隱性或顯性的中央核性肌病。
[0121] 本文所使用的術語"治療有效量"指的是給予患者的足以構成中央核性肌病的治 療的治療劑的量。在具體的實施方式中，待給予的治療有效量是足以將發動蛋白2的表達、 活性或功能降低至正常水平的同等水平或優選地低于正常水平的量。正常水平為不表現出 中央核性肌病的受試者的發動蛋白2的表達、活性或功能(例如，如圖1所示）。可通過本領域 普通技術人員公知的標準程序來確定待給予的發動蛋白2抑制劑的量。需要對患者的生理 數據(例如年齡、大小和重量）、給藥途徑和待治療的疾病加以考慮來確定合適的劑量，任選 地與不表現出中央核性肌病的受試者進行比較。本領域技術人員將認識到的是，待給予的 發動蛋白2抑制劑或者載體(所述載體包含或表達特異性干擾發動蛋白2表達的核酸）的量 為足以誘發不期望的中央核性肌病癥狀得到改善的量。該量可以改變，尤其是依賴于如下 因素而改變:選定的發動蛋白2抑制劑，患者的性別、年齡、體重、整體身體狀況等，并可基于 個案確定。該量也可根據治療方案的其它組成因素（例如給予其它藥物等)而改變。一般來 說，當發動蛋白2抑制劑是核酸時，合適的劑量范圍為約1 mg/kg至約10 Omg/kg、更通常為約 2mg/kg/天至約10mg/kg/天。如果選擇基于病毒的核酸遞送，合適的劑量將依賴于不同因 素，如使用的病毒、遞送途徑(肌肉內、靜脈內、動脈內或其它），但通常可為1〇_ 9病毒顆粒/kg 至1〇_15病毒顆粒/kg。如果抑制劑是抑制發動蛋白2的活性、表達或功能的小分子，每單位劑 量可以包含例如2mg/kg體重至300mg/kg體重、特別是5mg/kg體重至100mg/kg體重。如果抑 制劑是抗體，每單位劑量可以包含例如〇. lmg/kg體重至20mg/kg體重、特別是4mg/kg體重至 10mg/kg體重。本領域技術人員將認識到的是，此類參數通常是在臨床試驗過程中確定。此 外，本領域技術人員將認識到的是，通過本文所述的治療，疾病癥狀可能完全緩解，然而并 非必須如此。即便部分的或間歇性的癥狀緩解對于接受者也可大有裨益。此外，對患者的治 療可為單個事件，或在多個時機給予患者發動蛋白2抑制劑，依賴于獲得的結果，所述多個 時機可相隔幾天、相隔幾個星期、或者相隔幾個月、或者甚至相隔幾年。
[0122] 按照本領域技術人員知曉的標準制藥實踐（參見例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy(第20版），A.R.Gennaro，Lippincott Williams&Wilkins編， 2000;以及Encyclopedia of Pharmaceutical Technology，J.Swarbrick和J.C.Boylan編， 1988_1999，Marcel Dekker，New York)來配制本發明的藥物組合物。
[0123] 可能的藥物組合物包括那些適于經口、直腸、陰道內、粘膜、局部(包括經皮、口腔 和舌下）、或胃腸外(包括皮下、肌肉內、靜脈內、動脈內和皮內）給藥的藥物組合物。對于這 些制劑，可根據本領域技術人員公知的技術使用常規賦形劑。
[0124] 更具體而言，為了提供局部治療效果，優選特定的肌肉給藥途徑。特別是優選肌肉 內給藥。
[0125]可將根據本發明的藥物組合物配制為在給藥后實質上立即釋放活性藥物，或在給 藥后的任意預定時間或時間段釋放活性藥物。
[0126] 在本發明的上下文中，術語治療指治愈性的（curative)、對癥的（symptomatic)和 預防性的處理。本文使用的術語疾病的"治療"指的是任何旨在延長受試者(或患者)壽命的 行為，如疾病進展的延遲和治療。可將治療設計為根除疾病、阻止疾病進展和/或促進疾病 康復(regression)。術語疾病的"治療"也指任何旨在減少與疾病相關的癥狀(如張力減退 和肌肉力弱）的行為。更具體而言，根據本發明的治療旨在推遲中央核性肌病表型或癥狀的 出現，改善運動(motor)和/或肌肉行為和/或壽命，特別是通過挽救肌纖維細胞內組織化 (包括肌原纖維組織化、三聯體結構和/或核定位)來實現。
[0127] 待治療的受試者（或患者）是任何哺乳動物，優選是人。優選地，受試者是人患者 (無論其年齡或性別）。新生兒、嬰兒、兒童也包括在內。
[0128] 發動蛋白2抑制劑的篩選
[0129] 本發明還涉及對有益于治療中央核性肌病(優選為XLCW)的分子進行識別或篩選 的方法，所述識別或篩選基于此類分子抑制發動蛋白2的表達、活性和/或功能的能力。
[0130] 具體而言，本發明給出包含如下步驟的篩選方法：
[0131] a)提供或獲得候選化合物；以及
[0132] b)確定所述候選化合物是否抑制發動蛋白2的活性、功能和/或表達；
[0133] c)其中，所述候選化合物抑制所述發動蛋白2的活性、功能或表達的能力指示所述 候選化合物表明了對于中央核性肌病治療的有效性。
[0134] 在本方法的框架內，待測試的候選化合物可以是任何分子性質，例如，它可對應于 化學分子(優選小分子）、抗體、肽、多肽、適體、siRNA、shRNA、snRNA、正義寡核苷酸或反義寡 核苷酸、或核酶。
[0135] 可以使用本領域技術人員知曉的任何方法(例如上文指出或在實施例中描述的方 法)測試所述候選化合物抑制發動蛋白2的表達、活性或功能的能力。
[0136] 對適于治療中央核性肌病的分子進行篩選或識別的方法可任選地進一步包括如 下步驟:在體內或體外將所選擇的分子給予中央核性肌病非人動物模型或其部分(組織或 細胞，如肌肉組織或肌細胞），并分析對肌病發病或進展的作用。
[0137] 作為中央核性肌病非人動物模型，可以舉出Mtml外顯子4K0小鼠、MtmlR69C敲入小 鼠、MtmlTaconic基因陷阱（Mtml gt/y)、Dnm2敲入R465W小鼠、Mtml突變的拉布拉多尋回犬、 Binl突變的大丹犬、或在如下實施例中使用的小鼠。
[0138] 出于說明而并非限制的目的給出如下實施例。
[0139] 實施例
[0140] 實施例1
[0141] 材料。使用的一抗是：小鼠抗 DHPRadCavl · 1)亞基（MA3_920;Affinity Bioreagents)、α-輔肌動蛋白（EA-53, Si gma-Aldrich)、小窩蛋白 3(克隆 26, BD Biosciences)、結蛋白（Y-20 ; Santa Cruz Biotechnology)和甘油酸_3_磷酸脫氫酶 (GAPDH，MAB374 ; Chemicon)單克隆抗體；及兔抗RYR1 (由 Isabelle Marty，Grenoble Institut des Neurosciences，法國慷慨贈與）。兔抗DNM2抗體(R2680和R2865，在如下文獻 中表征：Cowling，B.S.等，2011，Increased express ion of wild-type or a centronuclear myopathy mutant of dynamin 2in skeletal muscle of adult mice leads to structural defects and muscle weakness，Am J Pathol 178:2224_2235〇 Increased expression of wild-type or a centronuclear myopathy mutant of dynamin 2in skeletal muscle of adult mice leads to structural defects and muscle weakness，Am J Pathol 178:2224-2235)以及抗MTMl(R2827)(Hnia，K.等，J.2011， Myotubularin controls desmin intermediate filament architecture and mitochondrial dynamics in human and mouse skeletal muscle，J Clin Invest 121： 70-85)在IGBMC(法國）生產。Alexa綴合二抗購自Invitrogen。針對小鼠和兔IgG并綴合有辣 根過氧化物酶(HRP)的二抗購自Jackson ImmunoResearch Laboratories購買了如下產 品：Hoechst核染色（B2883，Sigma-Aldrich)、ECL化學發光反應試劑盒（Pierce )、 Lipofectamine?(Life Technologies) 、Tri試劑（Molecular Research Center, Ohio , USA)、SYBR Green IMaster試劑盒（Roche Diagnostics)、miScript逆轉錄試劑盒 (Qiagen)、特異性miScript 引物檢測（Qiagen)和miScript Sybr green PCR試劑盒 (Qiagen)。患者對照活檢AHJ38(1.5個月）和39(3.4個月）、使用的具有奶￥1突變的乂1^0#活 檢是 AHJ35(15 天）（MTM1-內含子 ll-10A>GS420_R421insFIG)和 AHJ36(lm)(MTMl-c.445-49_ 445-4del)、l(MTMl-p.Leu213Pro)和 15(MTMl-p.Ileu466dup)和患者（patient) 12129/89 (MTMl-p · Val49Phef sX6，未發表）。
[0142] Dnm2雜合小鼠的生成。制造 Dnm2外顯子8側翼具有LoxP位點的靶向載體（圖10)，然 后線性化，并電穿孔導入胚胎干(ES)細胞。將重組ES細胞注射入C57BL/6囊胚(該囊胚被植 入假孕雌性），并確定生殖系傳遞。交配并分析的小鼠為129pas系(CMV啟動子）。
[0143] Mtml-/y/Dnm2雜合小鼠的生成。Mtml-/y小鼠的創建和表征先前已有描述(Buj-Bello，A.等，2002，The lipid phosphatase myotubularin is essential for skeletal muscle maintenance but not for myogenesis in mice，Proc Natl Acad Sci USA 99:15060-15065;Al-Qusairi，L等，2009，T_tubule disorganization and defective excitation-contraction coupling in muscle fibers lacking myotubularin lipid phosphatase，Proc Natl Acad Sci U S A 106:18763-18768)。使雌性雜合Mtml小鼠 129pas系與雄性Dnm2雜合小鼠交配，以在雄性后代中產生四種可能的基因型:Mtml+/yDnm2 +/+(WT);Mtml+/yDnm2+/-(Dnm2+/_);Mtml_/yDnm2+/+(稱為Mtml_/y);和Mtml-/yDnm2+/-。 分析的全部小鼠為雄性。
[0144] Mtml-/yDnm2skm+/-和Mtml-/yDnm2⑴skm+/-小鼠的生成。人骨骼肌α肌動蛋白（HSA-Cre)C57BL/6和HSA Cre-ERTM、鼠來自 IGBMC(法國）（Schuler，Μ·等，2005，Temporally controlled targeted somatic mutagenesis in skeletal muscles of the mouse， Genesis 41:165-170;Miniou，P·等，1999，Gene targeting restricted to mouse striated muscle lineage，Nucleic Acids Res27: e27) 〇使Floxed Dnm2+/_小鼠與HSA-Cre小鼠和HSA Cre_ERT2交配，分別生成Cre-陽性Dnm2skm+/_和Dnm2skm(i)+/-小鼠D使雄性 Drnn2skm+A或Drnn2(i)skm+A小鼠與雌性小鼠交配。對具有如下基因型的雄性后代進行 了分析：品系 1，Mtml+/yDnm2+/+(WT)、Mtml-/yDnm2+/+(Mtml_/y)、Mtml-/yDnm2skm+/-;和品 系2，]\^1111+/：7〇111112+/+(?1')、]\^1111-/：7〇111112+/+(]\^1111-/：7)、]\^1111-/：7〇111112+/-!13六-〇^-81^ 2他莫 昔芬誘導(Mtml-/yDnm2(1)skm+A)小鼠。為了在出生后誘導切除Dnm2,每天對3周齡的小鼠注 射lmg他莫昔芬(濃度lmg/100μΙ)，注射3天。全部小鼠在16周齡時處死。分析的全部小鼠為 雄性、50 % 129pas 系(Mtml _/y) 50 % C57BL/6 系（HSA啟動子）小鼠。
[0145] 動物實驗。將動物安置在具有12:12小時光/暗周期的溫控室（19_22°C)中。每周對 小鼠稱重至一歲。根據動物實驗的國家和歐洲法規，通過C0 2吸入后實施頸椎脫位，在需要 時將小鼠人道地處死。將肌肉與其它組織解剖出（當需要用于TEM時，使TA肌肉處于麻醉 下），并分別在液氮冷卻的異戊烷和液氮中冷凍以用于組織學測定法和免疫印跡測定法。
[0146] Dnm2+/_小鼠的表型分析。利用EUM0DIC表型分析程序(http: //www. eumodic · eu/) 對10-15周齡的Dnm2雜合雄性和雌性小鼠進行表型分析，其結果為公眾可得（http :// www. europhenome . org/)。這里展示的雄性小鼠 （n =每組10只）的血液化學、ECG測定、 Dexascan和肌電圖測試作為EUMODIC表型分析程序（Institut Clinique de la Souris (ICS，Illkirch，法國，http: //www. ics-mci · fr/))的流程 1和流程2的一部分實施。
[0147] 線繩、抓握(2爪和4爪）、懸吊、旋轉棒和足跡測試。線繩測試：以小鼠的前肢將其懸 在線材上，給予20秒使其后肢爬上線材。每只小鼠進行三次測試，測試間休息5分鐘。掉落被 認為等于20秒（n =每組至少5只小鼠）。握力測試：把2個前爪或全部4爪放在測力計 (Bioseb，Chavi 1 le，法國）的網格上，并向相反的方向通過鼠尾拉小鼠。記錄抓握失敗之前 小鼠所產生的最大力量。每只小鼠進行三次測試，測試間休息30秒(2爪測試，n =每組至少5 只小鼠；4爪測試，n =每組5-7只小鼠）。懸吊測試:將小鼠懸吊于籠蓋最長60秒。記錄每次測 試小鼠掉下籠子的時間。每只小鼠進行三次測試。旋轉棒測試：使用加速旋轉棒測試 (Panlab，Bar Cel〇na，西班牙)對協調性和全身肌肉力量以及易疲勞性進行測試。小鼠被放 置在5分鐘內從4rpm加速至40rpm的棒上。每天三次測試，測試間休息5分鐘，第1天為訓練 日，然后記錄4天。對動物的延遲掉落(latency to fall)(以秒計)進行打分。對于上面列出 的各實驗，計算三次測試的平均值(n =每組5-7只小鼠）。足跡測試:將小鼠的后足涂上無毒 墨水，并允許小鼠走過地面襯有紙的隧道(長50cm，寬9cm，高6cm)。隨后使用ImageJ分析程 序從產生的足跡模式測量后肢之間的角度。對每只小鼠分析至少6個足跡(n =每組5-8只小 鼠）。
[0148] 體積描記測定。該測試用于測定未受約束未受刺激小鼠的自主呼吸模式，使用全 身氣壓體積描記器(EMKA Technologies)(在ICS，Illkirch，法國）（n =每組3-5只小鼠）進 行。
[0149] 了六肌肉收縮性能。如前所述((：〇￥1丨邱，8.3.等，2011，舳了？3讓〇1178:2224-2235 ; Vignaud，A.等，2005，Exp Physiol 90:487_495;Vignaud，A·等，J Biomed Biotechnol 20 10 : 724914)，通過原位測定響應于神經和肌肉刺激的肌肉等長收縮（isometric contraction)來評估肌肉力量測定。顯示了來自于神經刺激的結果(n =每組5-11只小鼠）。 以到達所產生的最大力量的50%所花費的時間來測定疲勞。收縮測定后，通過頸椎脫位處 死動物。然后解剖出TA肌肉并稱重，以確定比最大力量。
[0150] 膈肌收縮性能。如前所述(50)，在來自于肋骨膈膜腹側部分的肌肉條上評估膈膜 等長收縮。簡而言之，每只小鼠原位解剖出兩個肌肉條。各肌肉被安置在含有Krebs-Henseleit溶液的組織室中。使用95%〇2-5%C〇2的氣體混合物對溶液進行吹氣，并保持在27 °C、pH 7.4。用彈簧夾夾住肌肉末端，并連接至電磁力傳感器。借助平行于肌肉放置并傳遞 時長為lms的電刺激的2個鉑電極對膈膜條進行電刺激。確定力-頻率曲線。在1 OOHz的刺激 頻率、400ms的訓練時長下獲得絕對最大力量。在實驗結束時，由肌肉重量與最佳肌肉長度 (Lo)的比率來計算每一個肌肉橫截面積（以mm 2計），假定肌肉密度為1.06。將總等長峰值力 量相對于每個橫截面積進行歸一化，以獲得總張力，以mN.mnf 2計(n =每組3-5只小鼠）。
[0151] Western印跡。在冰上將小鼠肌肉切碎并在10倍重量/體積的l%NP-40Tris-Cl緩 沖液(pH 8)中均質化3 X30s(Ultra Turrax均質機），然后在4°C提取30min。采用DC蛋白測 定試劑盒(Bio-Rad Laboratories)確定蛋白濃度，并借助SDS-PAGE和硝酸纖維素膜上的 Western印跡對裂解液進行分析。使用的一抗是·Μ2-Κ2680( 1:500)、DNM2-R2865(1:500)、 1?￥1-1?2827(1:500)和64?0!1(1:10,000) ;二抗是抗兔!11^或抗小鼠!11^(1:10,000)。對 Western印跡膜進行掃描，并使用ImageJ軟件(Rasband，W. S.，ImageJ，美國國立衛生研究 院，Be thesda，Mary land，USA，http: //rsb · info · n ih · gov/ij/，1997-2009)確定帶強度。按 照對應的總GATOH值對密度測定值進行標準化，并以相對于所列出的對照的倍數差異表示 (n =每組5-7只小鼠）。
[0152] qRT-PCR分析。使用Tri試劑（Molecular Research Center，0hio，USA)從8周齡腔 骨前肌骨骼肌裂解液提取總RNA，并使用Oligo dT引物進行反轉錄和擴增。然后使用 LightCycler 480(Roche Diagnostics，Meylan，法國）與 DNM2 引物（正向引物 CCAACAAAGGCATCTCCCCT(SEQ ID No 28);反向引物TGGTGAGTAGACCCGAAGGT(SEQ ID No 29)，以GAFOH mRNA為標準，使用SYBR Green IMaster試劑盒（Roche Diagnostics)進行實 時定量RT-PCR。將結果相對于對應的總GAPDH值進行標準化，以相對于WT同窩對照的倍數差 異表示(n =每組2-3只小鼠，進行三次重復）。
[0153] 骨骼肌的組織學與免疫熒光分析。制備小鼠骨骼肌的冷凍縱切片和冷凍橫切片(8 μπι)，固定并使用針對DHPRcn (1: 1〇〇)、RYR1 (1: 200)、α-輔肌動蛋白（1:1，〇〇〇)、小窩蛋白3 (1:1，000)、DNM2-R2680( 1:200)、MTM1-R2827( 1:200)和結蛋白（1:100)的抗體染色。通過用 H〇echSt(Sigma-Aldrich)共染10分鐘檢測核。借助激光掃描共聚焦顯微鏡(TCS SP5;Leica Microsystems，Mannheim，Germany)對樣品進行觀察。將空氣干燥的橫切片固定，并使用蘇 木精和伊紅（HE)或琥珀酸脫氫酶（SDH)進行染色，通過配備有熒光模塊L11600-21 (Hamamatsu Photonics，日本）的玻片掃描儀NanoZoomer 2HT或DMRXA2顯微鏡（Leica Microsystems Gmbh)進行圖像采集。使用FIJI圖像分析軟件在來自于ΤΑ小鼠骨骼肌的HE切 片中對橫截面積(CSA)進行分析。由每組4-7只小鼠計算CSA(ym 2)(每只小鼠>500個纖維）。 使用ImageJ圖像分析軟件中的細胞計數器插件，在來自于4-6只小鼠的>500個纖維中，對具 有中央化的核或內部化的核的TA肌纖維的百分比進行計數。
[0?54] 透射電子顯微鏡。通過腹腔內注射每克體重10μ1氯胺酮（20mg/ml，Virbac， Carros，France)和甲苯噻嗪（0 · 4%，Rompun，Bayer，Wuppertal，德國）將小鼠麻醉。用0 · 1M 二甲胂酸鹽緩沖液(pH 7.2)中的2.5%戊二醛固定ΤΑ肌肉活檢樣本，并如先前描述進行加 工（Buj-Bello，A.等，2002，Proc Natl Acad Sci U S A 99:15060-15065;Cowling，B.S. 等，2011，Am J Pathol，178: 2224-2235)。在肌肉縱切片上識別三聯體結構，并對每肌小節 的三聯體數目進行定量。如前所述(Amoasii，L.等，2012，PL〇S Genet，8:e100 2965)，通過將 清楚識別的三聯體數目除以存在于圖像中的肌小節總數來計算三聯體/肌小節的比例。每 只小鼠對40-80個三聯體進行計數。
[0?55]顯微術與統計分析。全部顯微術在IGBMC成像中心實施。將顯微術的全部樣品封裝 于Fluorsave試劑(reagent) (Merck)中并在室溫觀察。利用配備有彩色CCD相機(Coolsnap cf colour，Photometries)的焚光顯微鏡（DM4000;Leica microsystems)實施光學顯微術。 使用共聚焦激光掃描顯微鏡(TCS SP2或SP5;Leica Microsystems，Mannheim，德國）實施共 聚焦顯微術。使用ImageJ和FIJI分析軟件進行圖像分析。除非另有說明，采用非配對學生t 檢驗進行統計分析。認為P值〈0.05為顯著。
[0156] 研究批準。動物實驗經由機構倫理委員會Com'Eth IGBMC-ICS(2012-128)批準。全 部的人活檢樣本都是在獲得知情同意后使用的。
[0157] 結果
[0158] Dnm2雜合(Dnm2+/_)小鼠的創建和表征。之前顯示，在胚胎發生過程中Dnm2的組成 型敲除是早期致死的（Ferguson，S.M.等，2009，Coordinated actions of actin and BAR proteins upstream of dynamin at endocytic clathrin-coated pits,Dev Cell 17: 811-822)。通過靶向Dnm2的外顯子8創建Dnm2敲除(Dnm2-/_)小鼠（圖10)(詳見方法部分）。 在100個幼崽中，我們沒有識別出任何Dnm2-/_小鼠，證實Dnm2-/_是胚胎致死的。識別了如 孟德爾遺傳比率所預期的雜合(Dnm2+/_)幼崽，并借助EUM0DIC表型分析程序對這些幼崽進 行了進一步的分析(詳情見方法部分和http: //www. eumodic. eu/)。基本的血液化學測試表 明，野生型(WT)和雜合(Dnm2+/_)小鼠在尿素(表明正常腎功能）、鈣(滲透穩態)和總膽固醇 (表明沒有心血管疾病)水平上沒有差異（圖11A)。正常ECG測量說明心臟的電活動沒有改變 (圖11B)。整體上體重未表現出明顯差異（圖11C)，WT和Dnm2+/_小鼠在瘦質組織或脂肪的量 上也沒有差異（圖11D)。然后進行基本肌肉功能測試。肌電圖測試顯示單神經傳導速度 (SNCV)沒有差異（圖11EKWT和Dnm2+/_小鼠脛骨前肌(TA)肌肉質量相似（圖11F)，并且未檢 測到TA肌肉在絕對最大力量或比最大力量或易疲勞性上的差異（圖11G-I)，總體上表明 Dnm2+/_小鼠在臨床上和生理上類似于WT小鼠，在肌肉功能上沒有可檢測的差異。
[0159] X連鎖中央核性肌病中的·Μ2水平。在研究·Μ2下調在XLC匪中的治療潛力之前， 通過western印跡分析檢查來自于XLCNM患者的肌肉裂解液的DW2蛋白水平（圖1Α)。與年齡 匹配的對照活檢相比，來自于所測試的五個新生兒XLC匪肌肉活檢中識別出·Μ2蛋白表達 的1.5倍增加（圖1Β)。然后確認在XLC匪動物模型中是否也觀察到DNM2表達增加。本研究采 用了之前表征過和準確再現XLCNM的小鼠（Buj_Bello，A.等，2002，Proc Natl Acad Sci U S A 99:15060-15065;Al-Qusairi，L.等，2009，Proc Natl Acad Sci U S A 106: 18763-18768;Amoasii，L.等，2012，PLoS Genet 8:e100 2965)。與WT同窩對照相比，來自于5 周齡Mtml-/y小鼠的ΤΑ肌肉裂解液表現出DNM2水平顯著增加（圖1C、圖ID)，表明增加的DNM2 與XLC匪表型相關。在膈肌中也觀察到DW2表達的增加（圖1E、圖1F)，且該肌肉表現出在組 織學上受到影響，具有更多的包含錯誤定位的核的萎縮的纖維（圖1G)。這一發現表明，呼吸 功能不全是造成Mtml _/y小鼠死亡的原因。
[0160] 降低·Μ2的表達大幅延長小鼠的壽命。在Dnm2+/_小鼠中，在基因水平上 將DNM2降低至50%沒有可檢測的臨床或生理影響。為了測試發動蛋白2表達的降低是否可 以挽救由MTM1突變造成的X連鎖C匪，使Mtml+/_小鼠與Dnm2+/_小鼠雜交，以產生Mtml-/ yDnm2+/_雄性后代。如以往所報道的，大多數Mtml-/y小鼠在1-3月齡間死亡(Buj-Bello，A. 等，2002，Proc Natl Acad Sci U S A 99:15060-15065)，而100%的Mtml-/yDnm2+/_小鼠 存活至少一年（圖2A)，與WT小鼠相比體重無顯著差異（圖2B)，表明降低·Μ2的表達可以挽 救在小鼠中觀察到的早期致死。未處死的Mtml-/yDnm2+/_小鼠現在已超過2歲。在 8w時（約60 %的小鼠仍存活），通過常規檢查無法將Mtml-/yDnm2+/_小鼠與WT小鼠 區分開，而Mtml _/y小鼠顯示出運動和活動的顯著減少。
[0161 ] 對來自于不同年齡的幾種肌肉的裂解液進行western印跡分析，以確定D匪2蛋白 表達的水平。正如預期的那樣，與WT小鼠相比，8周齡(8w)和6月齡(6m)的Dnm2+/_和Mtm 1 -/ yDnm2+/_小鼠膈肌中的·Μ2蛋白水平均減少約50% (圖2C)。8w時，與WT小鼠相比， 小鼠表現出膈膜中DNM2的增加，這與5周齡小鼠的結果相一致（圖IF)。在腓腸肌（圖2D)、脛 骨前肌（圖2E)和比目魚肌（圖2F)肌肉中，在8w、16w和6m觀察到同樣的趨勢（圖14)。因此與 WT小鼠相比，不同年齡Mtml_/y小鼠的不同肌肉中·Μ2水平一致增加，不同年齡Dnm2+/_和 Mtml -/yDnm2+/_小鼠的不同肌肉中·Μ2水平一致減少。
[0162] 為了確定不同的·Μ2蛋白表達是否歸因于蛋白合成的改變，對8w的ΤΑ肌肉裂解液 進行 qRT-PCR 分析。與 WT和 小鼠相比，Dnm2+/_和 Mtml-/yDnm2+/_小鼠中Dnm2的mRNA 水平都明顯減少（圖2G)，這與·Μ2蛋白表達相關聯（圖2E)。有趣的是，與WT小鼠相比，在 Mtml _/y肌肉裂解液中Dnm2mRNA表達未見顯著增加，表明在Mtml _/y肌肉中DNM2蛋白表達的 增加可能是由于DNM2穩定性的增加或降解的減少，而不是轉錄的升高。
[0163] 由于TA肌肉是Mtml-/y小鼠中最受影響的肌肉之一，通過免疫熒光分析研究了 8w 小鼠 ΤΑ肌肉中的MTM1和·Μ2定位。由α-輔肌動蛋白染色所識別出的Z線表現為相對未受干 擾（圖12Α)。在Mtml-/y和Mtml-/yDnm2+/_小鼠中，DNM2與α-輔肌動蛋白共定位于Ζ線，并顯 示相對未受干擾（圖12Α)。正如所預期的，在Mtml-/y和Mtml-/yDnm2+/_小鼠中幾乎檢測不 到肌管素（圖12B)。總之，DNM2的表達降低將Mtml-/y小鼠的壽命和體重挽救至野生型水平。 [0 164] 通過降低DNM2表達挽救Mtml-/y小鼠的肌肉萎縮。為了進一步分析Mtml-/y小鼠中 DW2表達降低的影響，測定了不同肌肉的質量。在Mtm卜/y小鼠中快速抽搐的腓腸肌萎縮， 然而對Mtml-/yDnm2+/_小鼠分析至1歲仍未觀察到萎縮（圖2H)。同樣，與WT小鼠相比，在直 至1歲的Mtml-/yDnm2+/_小鼠中，其它快速抽搐的肌肉（EDL和跖肌)未表現出萎縮（圖13A、 圖13B)。8w時，與Mtml-/yDnm2+/_、WT和Dnm2+/_小鼠相比，在Mtml_/y小鼠中表征最多的TA 肌肉在Mtml_/y小鼠中表現出強烈的萎縮（圖21)。在這個年齡，Mtml-/yDnm2+/_的TA重量與 WT小鼠無法區分。在16w，與Mtml_/y小鼠不同，Mtml-/yDnm2+/_小鼠仍然存活（圖2A)，并且， 與WT和Dnm2+/_小鼠相比，表現出一些TA萎縮，這表明在Mtml-/yDnm2+/_小鼠中TA萎縮推 遲。有趣的是，在8周時，在Mtml-/y小鼠中緩慢抽搐的比目魚肌表現出萎縮，而與WT小鼠相 比，在Mtml-/yDnm2+/-小鼠中直至1歲都沒有萎縮出現（圖2J)。當測定相對于體重的總肌肉 質量時，觀察到類似的結果（圖13C-圖13E)。未觀察到Mtml-/yDnm2+/_和WT小鼠之間肝臟或 心臟重量的差異（圖13F、圖13G)。因此，在Mtml-/y小鼠中隨著DNM2表達的降低，腓腸肌和比 目魚肌的肌肉萎縮被完全挽救，且TA肌肉中肌肉萎縮強烈推遲。
[0165] 通過降低DNM2表達，Mtml-/y小鼠的CM1組織學特性被大幅挽救。CNM在組織學上表 現為內部核錯誤定位和肌纖維發育不良。對兩個主要的時間點進行了分析：早期（8周齡 (8w))，此時大部分Mtml-/y小鼠還活著;和晚期（16周齡（16w))，此時95%的小鼠已 經死亡。在8w，Mtm 1 _/y TA肌肉表現出特征性的核錯誤定位（圖3A、圖3F)、減少的纖維大小 (圖3A、圖3D)和具有肌膜下及中央聚集的異常SDH染色（圖3A)。如就腓腸肌和比目魚肌所觀 察到的，Mtml-/yDnm2+/-TA肌肉在組織學上類似于WT和Dnm2+/_小鼠（圖13H、圖131)，SDH染 色中只有少數異常纖維（圖3A)。纖維發育不良得到挽救，并且與小鼠相比，內部核 和中央核顯著減少（圖3A、圖3D、圖3F)。此外，圍繞核的膜堆積減少（圖3B)。至16周，來自于 Mtml-/yDnm2+/-小鼠的TA肌肉表型是混合的，一些區域表現為健康，而其它區域類似于8w 的Mtml-/y小鼠，具有肌纖維發育不良、核錯誤定位和異常SDH染色（圖3C、圖3E、圖3F)。隨后 分析了在Mtm 1 _/y小鼠中顯示被破壞的結蛋白（MTM1結合伴侶）定位(Hn ia，K.等，2011，J Clin Invest 121:70-85) Itml-zV小鼠顯示出結蛋白定位中的強烈擾動，這在Mtml-/ yDnm2+/_小鼠中幾乎沒有觀察到（圖15A)，表明正常的結蛋白定位在8w的Mtml-/yDnm2+/-小鼠中得以恢復。總之，這些結果表明，通過發動蛋白2蛋白表達的降低，Mtml-/y小鼠中不 同肌肉的CNM表型的呈現被挽救或強烈推遲。
[0166] 減少·Μ2表達改善小鼠的肌肉力量和表現。為了確定降低·Μ2表達除挽 救Mtml-/y小鼠的組織學表型以外是否還挽救功能表型，進行了各種測試。線繩測試要求借 助前爪懸吊的小鼠舉起后肢并用后肢抓住棒。直到8w時，Mtml-/y小鼠在數次測試中從線繩 上掉落而無法進行測試，而Mtml-/yDnm2+/-小鼠以類似于WT和Dnm2+/_小鼠的情況進行了 測試(圖4A)，表明在該年齡全身力量得到挽救。在8w和16w在TA肌肉中測量絕對最大力量和 比最大力量(相對于肌肉質量）。在8w時，Mtml-/y小鼠表現出極弱的絕對最大肌肉力量和比 最大肌肉力量，而Mtml-/yDnm2+/_小鼠以類似于WT和Dnm2+/_小鼠的情況進行了測試（圖 4B、圖4C)。在16w，Mtml-/yDnm2+/_小鼠的TA肌肉的最大力量減小，這與組織學數據相一致。 此外，在8w未觀察到易疲勞性的變化，然而在16w，TA肌肉疲勞快于對照（圖4D)。值得注意的 是，在組織學和生理學上，16w的Mtml-/yDnm2+/_小鼠的表現優于8w的Mtml-/y小鼠，這表明 疾病的進展減慢;或者，正如在16w的TA肌肉的組織學上觀察到的混合表型所表明的，在一 些而不是全部肌纖維中得到挽救。與Mtml-/y小鼠相比，Mtml-/yDnm2+/-小鼠中TA肌肉的整 體萎縮和降低的最大肌肉力量得到減弱和強烈推遲。
[0?67] Mtml-/yDnm2+/_小鼠改善的肌肉超微結構。下面確認Mtml-/yDnm2+/_肌肉的超微 結構是否得到挽救。對來自于8w和16w的Mtml-/yDnm2+/_小鼠的TA肌肉實施透射電子顯微 術(TEM) Jw的Mtml-/yDnm2+/-TA在形態學上類似于WT和Dnm2+/_小鼠，具有對齊的Z線和肌 小節，且無明顯線粒體結構異常;而Mtml-/y肌肉顯示異常線粒體形狀、異常膜堆積和Z線對 齊錯誤以及改變的肌原纖維寬度（圖5A)。值得注意的是，來自于16w的Mtml-/yDnm2+/_小鼠 的肌肉是非均質的，一些區域表現為健康（圖5B，左下），而其它區域表現出被干擾(右下）。 此外，在16周齡Mtml-/yDnm2+/-小鼠的一些區域中可檢測出線粒體異常，這在8周不明顯。 這支持了我們先前的組織學和生理學結果，表明在不同的時間點，Mtml-/yDnm2+/-TA肌肉 中的CNM表型被部分但實質性地挽救。
[0168] 在Mtm 1 -/yDnm2+/_小鼠中三聯體結構正常化。CNM患者和CNM動物模型之間享有的 共同特征為骨豁肌內三聯體的結構和位置的破壞（Toussaint，A.等，2011，Defects in amphiphysin 2(BIN1)and triads in several forms of centronuclear myopathies, 八(^&如111'〇卩&1:11〇1 121:253-266;0〇￥1;[叫，]\]\，等，2009，1^〇88〇;1^1117〇1：1113111&1'；[11 function results in T-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy，PLoS Genet 5:e100 0372;Al-Qusairi，L.等，2009，T_tubule disorganization and defective excitation-contraction coupling in muscle fibers lacking myotubularin lipid phosphatase,Proc Natl Acad Sci USA 106： 18763_18768;Beggs等，2010，MTMlmutation associated with X-linked myotubular myopathy in Labrador Retrievers，Proc Natl Acad Sci U S A 107:14697-14702)。為 了確定在Mtml-/yDnm2+/_小鼠中三聯體結構是否受到影響，通過免疫標記檢查三聯體標志 物的定位。發現于成熟肌肉橫小管（T-tubules)上的電壓依賴性|丐通道DHPRa定位于WT和 Dnm2+/_小鼠的TA肌纖維內的punctuate結構中，與橫小管定位相一致（圖15B)。然而，在 Mtml-/y肌肉中這一特異性染色消失，表明橫小管的嚴重破壞。在Mtml-/yDnm2+/_肌肉中， DHPRa的定位與WT和Dnm2+/_肌肉相似，表明在這些小鼠中橫小管結構得到挽救。通過對肌 肉切片進行蘭諾定受體(RyRl)(所述RyRl為特異性定位于三聯體的肌質網的鈣通道)染色 證實了這一點。橫切圖像顯示了來自于Mtml-/yDnm2+/_小鼠的大多數纖維中RyRl定位得到 挽救，只有少數纖維顯示出如在Mtml-/y小鼠中普遍觀察到的RyRl堆積（圖6A)。在縱切圖像 上觀察到在WT和Dnm2+/_肌肉中的Z線（以a-輔肌動蛋白標記)周圍的雙重RyRl染色，這與三 聯體定位相一致。Mtml-/y肌肉中該染色被嚴重擾亂，而在Mtml-/yDnm2+/_肌肉中得到部分 挽救。為了進一步分析三聯體，獲取來自于8w小鼠的高放大倍數TEM照片。觀察到與WT和 Dnm2+/_小鼠相比，小鼠中橫小管/三聯體結構被嚴重破壞，而在Mtml-/yDnm2+/_小 鼠中正確定位的三聯體清晰可見（圖6B)。三聯體分析證實，在WT、Dnm2+/_或Mtml-/yDnm2 +/_小鼠中，每肌小節的三聯體數量沒有差異，而Mtml-/y小鼠表現出每肌小節的三聯體數 量減少（圖6C)。因此，在8w的Mtml-/yDnm2+/_小鼠中，三聯體的定位和結構得到挽救。
[0169]在肌肉發育和再生過程中小窩蛋白3位于橫小管，而在成熟的肌肉中，小窩蛋白3 主要定位于肌膜（在Miniou，P.等，1999，Gene targeting restricted to mouse striated muscle lineage，Nucleic Acids Res 27:e27中進行綜述）。為了確定在Mtml_/y和Mtml-/ yDnm2+/_小鼠中小窩蛋白3定位是否被擾亂，使用小窩蛋白3抗體對肌肉橫切片進行染色。 WT和Dnm2+/_肌肉示出小窩蛋白3如預期的那樣定位于肌膜，而來自于Mtml-/y小鼠的許多 纖維表現出小窩蛋白3強烈的內部染色模式（圖6D)。這種表型在Mtm卜/yDnm2+/_肌肉中得 到大幅挽救，只是偶爾有纖維顯示出小窩蛋白3的內部定位。
[0170] Mtm 1 -/yDnm2+/_小鼠的長期生理表型。XLC匪在患者中的存在伴有非常嚴重的肌 肉力弱，并且在Mtml-/y小鼠中為1-3月內致死;然而，在這些小鼠中降低發動蛋白2表達挽 救了壽命，并在8w和16w大幅改善了肌肉力量。對更晚時間點的Mtml-/yDnm2+/_小鼠的表型 進行確定，以評價與正常壽命匹配的肌肉功能程度。6月齡和12月齡的Mtml-/yDnm2+/-小鼠 能夠移動并完成基本任務。老年Mtml-/yDnm2+/_小鼠看起來類似于WT小鼠（圖7A)，但出現 了行走時后足外翻。通過將后足放在墨水中并測量行走時后足之間的角度對此進行定量 (圖16A;圖7B)。該特征在6-12m后不再發展，因為兩種月齡的測定結果相似。為了確定這些 小鼠的整體最大腿部力量，使用測力計進行握力測試。當僅測定兩只前爪時，在最初的12個 月，WT或Mtm卜/yDnm2+/_小鼠之間未觀察到區別（圖S7B)。當測定四只爪子時，在6m和12m， 觀察到與WT小鼠相比，Mtml-/yDnm2+/_小鼠力量均小幅減少（圖7C)，表明與WT小鼠相比 Mtm 1 _/y Dnm2+/-小鼠的后肢表現出最大肌肉力量降低，該降低不是進展性的。對總體運動 協調性、力量和耐力進行的旋轉棒測試在6m或12m未觀察到差別（圖7D)，證實Mtm 1 _/yDnm2 +/_的總體協調性和整體力量未被嚴重擾亂。懸吊測試是需要將小鼠懸吊于籠蓋60秒的大 運動量測試。受到嚴重影響的Mtml-/y小鼠在1月齡之后不能完成該測試（圖7E)。作為比較， 直至12個月的最后測試年齡，老年Mtml-/yDnm2+/_能夠完成該測試，盡管比WT和Dnm2+/_小 鼠完成程度低（圖7E)。鑒于Mtml-/yDnm2+/_小鼠直至12個月都能夠成功地完成基本運動強 度測試，我們的結論是疾病表型并未隨時間發展，壽命和基本運動功能得到挽救。
[0171] Mtml-/yDnm2+/_小鼠中長期膈膜功能正常。顯示在XLCNM模型中，單個肌 肉似乎受到不同影響，并由于DW2的減少而被不同程度地挽救（圖2C-J;圖13)。因為XLCNM 患者患有危及生命的呼吸衰竭，XLCNM患者壽命的主要關注點在于膈膜的持續(ongoing)功 會泛（Jungbluth，H.，Wallgren-Pettersson，C.^PLaporte，J.，2008，Centronuclear (myotubular)myopathy，Orphanet J Rare Dis 3:26)。此外，在5界的]\11：1111-/：7小鼠中膈膜組 織學被強烈改變（圖1G)。因此測試了6m Mtml-/yDnm2+/_小鼠的膈肌功能。利用體積描記測 試測量靜息狀態下小鼠的自主呼吸模式。Mtml-/yDnm2+/_小鼠與WT和Dnm2+/_小鼠表現相 似，未檢測到顯著差異（圖17和圖7F)。測定了分離的膈肌條的比最大力量。未檢測到力量-頻率關系的顯著差異，然而觀察到比最大力量的減少（圖7G)。組織學上Mtml-/yDnm2+/_膈 肌與WT和Dnm2+/_肌肉相似，未觀察到核位置或纖維化的重大改變（圖7H)。與在5w(圖1E、圖 1F)和8w(圖2C)DNM2蛋白水平升高的小鼠相比，在6m時Mtml-/yDnm2+/_小鼠的膈肌 中維持降低的·Μ2蛋白水平（圖2C)。總體上Mtml-/yDnm2+/_小鼠的膈肌與對照小鼠沒有區 另IJ，支持了通過·Μ2減少XLCNM表型得到大范圍表型改善這一結果。
[0172] 在Mtml_/y小鼠中·Μ2的肌肉特異性減少足以挽救表型并改善壽命。在本研究中， 通過在子宮內在全部組織中降低·Μ2表達，我們能夠充分挽救小鼠的壽命以及疾 病的大多數臨床特征和組織學特征。為了測試肌肉表型的挽救是否是細胞自發的，獲得了 人骨骼肌α-肌動蛋白（HSA)-Cre和HSA Cre-ERT2小鼠（Schuler，M·等，2005，Temporal ly controlled targeted somatic mutagenesis in skeletal muscles of the mouse， Genesis 41:165-170)，使它們與floxed Dnm2小鼠雜交以產生Dnm2skm+/-(Cre陽性)和Dnm2 (i)skm+A(Cre-ERT2)雜合小鼠。使這些小鼠再與Mtml-/y小鼠雜交以產生該背景下的DNM2組織 特異性切除。當降低肌肉中的·Μ2表達(Mtml-/yDnm2skm+/-，由9d. p. c .活化的HSA啟動子） (Miniou，P.等，1999，Gene targeting restricted to mouse striated muscle lineage， Nucleic Acids Res 27:e27)，Mtml-/yDnm2skm+/-小鼠的壽命增加，75%的小鼠存活直到至 少16周，而沒有小鼠存活到這個年齡（圖8A)，這與Mtml-/yDnm2+/_小鼠的結果相一 致（圖2A)。使得4只WT和4只Mtml-/y Dnm2skm+/1、鼠的同期群繼續存活，用于未來的長期分 析，全部小鼠現在為9-12月齡。與小鼠相比，在Mtml-/yDnm2 skm+A小鼠中觀察到體重 相應增加（圖8B)。在Mtml-/yDnm2skm+/-小鼠和WT小鼠之間，未觀察到腓腸肌或比目魚肌的質 量差異（圖8C)。在16周，當全部同窩小鼠死亡時，與WT同窩小鼠相比，Mtml-/ yDnm2skm+A小鼠的ΤΑ肌肉表現出一些肌肉萎縮，伴有肌肉質量以及纖維大小的減少(與增加 的中央核和內部核有關）；并表現出一些異常SDH染色（圖8D-F)，與來自于16周齡Mtml-/ yDnm2+/_小鼠的ΤΑ肌肉相似（圖2)。這些改變不如在8w的小鼠中看到的明顯。重要 的是，與WT小鼠相比，腓腸肌和比目魚肌的纖維大小或核位置并沒有表現出顯著的差異（圖 18A-D)，表明在不同肌肉中表型的挽救不同。檢測了在16w不同肌肉中的·Μ2蛋白水平，與 WT相比，在膈膜中·Μ2表達顯著減少，但是在其它所測量的肌肉中未減少（圖8G、圖S9E-圖 S9H)。不能獲得這個年齡的小鼠從而比較DW2水平，在這些肌肉中DW2水平在更年 輕的時間點增加（圖2)。由于膈膜是呼吸所需的至關重要的肌肉，在這里DNM2表達的降低對 于增加 Mtml-/yDnm2skm+/-小鼠的存活而言可能是重要的。在小鼠的膈肌中DNM2表達 的降低對于XLCNM的挽救似乎是決定性的。
[0173] 出生后·Μ2的肌肉特異性減少足以挽救小鼠。在HSA-Cre ERT2體系下使 Mtml-/y小鼠與Dnm2+/_小鼠雜交，允許出生后通過他莫昔芬注射誘導肌肉內·Μ2的切除 (Schuler，Μ·等，2005，Temporally controlled targeted somatic mutagenesis in skeletal muscles of the mouse，Genesis 41:165-170)。重要地，在小鼠3周齡時，在諸如 肌肉萎縮(圖2)和核中央化的癥狀發作后實施他莫昔芬注射(Al-Qusairi，L.等，2009，Proc Natl Acad Sci U S A 106:18763-18768)。70%經注射的Mtml-/yDnm2⑴skm+/-小鼠存活至 少至16周（圖9A)。與Mtml_/y小鼠相比，觀察到更大的體重，然而與WT小鼠相比，16周時體重 仍然顯著降低（圖9B)。與較早時間點的Mtml-/y小鼠（圖2)不同，在16周，與WT小鼠相比，未 觀察到腓腸肌、比目魚肌或TA肌肉的歸一化質量的差別（圖9C)。對Mtml-/yDnm2 (1)skm+A小鼠 TA肌肉的進一步分析顯示，肌肉表現出一些纖維發育不良（圖9D、圖9E)，并伴有增加的中央 核和內部核以及異常SDH染色（圖9D、圖9F)，這與來自于16周Mtml-/yDnm2+/_的TA肌肉（圖 3)類似。注意到與WT小鼠相比，來自于16周Mtml-/yDnm2(i)skmV-小鼠的腓腸肌中DNM2蛋白表 達減少，然而在TA肌肉和膈肌中觀察到·Μ2蛋白表達的增加（圖9G、圖S10)。這些差異可能 是由于他莫昔芬介導的Cre重組酶活化時DW2切除效率的不同。在16w膈膜中DW2表達的增 加可能與8-16周齡Mtml-/yDnm2 (1)skm+A小鼠存活率的降低相關聯。因此，可以得出這樣的結 論:在出生后，在Mtml-/y受影響的年齡，肌肉中DW2水平的降低足以改善小鼠中觀 察到的壽命和CNM表型。
[0174] 實施例2
[0175] 材料和方法與實施例1中使用的材料和方法相同或等同。
[0176] Binl-/-小鼠是用于ARCNM的小鼠模型，出生后存活不超過24小時。
[0177] 如下表1顯示了從具有不同基因型的小鼠所獲得的結果。
[0178] 表1
[0180] Binl-/-小鼠在圍產期死亡。在由Binl+/_雄性與Binl+/_雌性雜交獲得的數窩幼 崽出生后的幾天進行基因型計數，顯示沒有Binl-/-基因型。
[0181] 作為·Μ2的下調可以明顯改善用于ARC匪的小鼠模型（Binl-/-小鼠）的表型的說 明，B i η 1 -/-小鼠中發動蛋白2降低50 %可以有效挽救早期致死，使B in 1 -/-Dnm2+/_小鼠存 活至少12個月（圖20)，該小鼠具有亞正常體重（圖20)和正常的比肌肉力量、抗疲勞性、力量 和協調性行為（圖21)。組織學檢查和定量顯示，直至至少12月齡，Binl-/-Dnm2+/_肌肉具有 正常的纖維形狀和大小、正常的氧化染色和略有增加的中央核，沒有過度再生的跡象（圖 22-23) 〇
[0182] 因此，·Μ2減少可顯著改善小鼠中數種形式的CW(在Mtm 1 _/y小鼠中為XLC匪，在 Binl-/-小鼠中為ARCNM)。
[0183] 實施例3:
[0184] 材料和方法
[0185] 生產和純化AAV:
[0186] 利用pAAV2插入物、pXRl和pHelper對AAV-293細胞系進行三重轉染，生成AAV2/9載 體;所述PAAV2插入物包含在CMV啟動子控制下、側翼具有血清型2反向末端重復的插入物； 所述pXRl包含AAV血清型9的rep和cap基因；所述pHelper編碼腺病毒輔助功能。對細胞裂解 液進行3次凍融循環，然后用50U/mL Benzonase(Sigma)在37°C處理30分鐘，并通過離心澄 清。使用離心過濾器（Amicon Ultra_15Centrifugal Filter Devices 30K，Millipore， Bedford)進行碘克沙醇梯度超速離心、隨后相對于Dulbecco's磷酸鹽緩沖鹽水進行透析并 濃縮，純化病毒載體。借助實時PCR，使用質粒標準pAAV-eGFP，對物理粒子進行定量，以每毫 升病毒基因組(vg/ml)示出效價。在這些實驗中使用的rAAV效價為5 X 10n-7 X 10nvg/ml。
[0187] 小鼠的野生型脛骨前肌(T.A)和腓腸肌的AAV轉導：
[0188] 通過 i ·ρ·注射5yl/g氣胺酬（20mg/ml; Virbac，Carros，France)和甲苯噻嘆 (0 · 4 %，Rompun; Bayer，Wuppertal，德國）將3周齡的雄性野生型129PAS小鼠麻醉。向左腿肌 肉注射25μ1 AAV2/9shDnm2編號C，并向右腿肌肉注射等量的干擾型AAV2/9。動物被安置在 具有12:12小時光/暗周期的溫控室（19-22Γ)中。根據動物實驗的國家和歐洲法規，通過 C02吸入后實施頸椎脫位處死小鼠。注射后5周將TA和Gast.肌肉解剖出、稱重，并在液氮冷 卻的異戊烷和液氮中冷凍，用于組織學研究。
[0189] 組織學評估：
[0190]制備8μπι橫切片，固定并用H&E (蘇木精&伊紅)染色。使用Fi j i軟件從H&E切片分析 纖維大小。使用Fiji圖像分析軟件的細胞計數插件對具有中央化核或內部化核的TA肌肉纖 維的百分比進行計數。使用Fiji軟件測量纖維面積。對于各樣品，對超過800個纖維進行計 數和測量。
[0191] 細胞轉染：
[0192] 利用購自Thermo Fisher Scientific的lipofectamine2000,用編碼shDnm2的質 粒和編碼肌肉特異性亞型hDW2 (人DW2)的質粒對HEK (人胚腎)細胞進行共轉染。利用購自 Lonza的Amaxa kit V Cell Line Nucleofector?，使用編碼shDnm2的質粒對C2C12小鼠成 肌細胞進行電穿孔。
[0193] 表2:用于針對DNM2基因的shRNA的序列和潛在的脫靶對象。
[0194] 發動蛋白2mRNA的外顯子12b具有如下序列：
[0195] SEQ ID No 30:5'ctgttactat actgagcagc tggtgacctg 3'，
[0196] 或對應于編碼的蛋白序列SEQ ID No 31: (Cys Tyr Tyr Thr Glu Gin Leu Val Thr Cys)〇
[0197] 靶·Μ2序列與鼠 Dnm2和人DW2為100%同源。沒有同源性大于80%的脫靶基因，排 除了有效下調脫靶對象的情況。
[0198] 表2
[0200]結果（圖 24-圖 30)
[0201] -shRNA特異性地靶向·Μ2序列（圖24)以及可在轉染的HEK細胞（圖25)、轉染的 C2C12鼠成肌細胞（圖26)、注射有表達靶向·Μ2的shRNA的AAV的野生型小鼠的脛骨前肌（圖 27;AAGGACATGATCCTGCAGTTCAT:SEQ C或SEQ ID No 2)中有效地降低發動蛋白2水平的實 例。
[0202] -向脛骨前肌（T A )和腓腸肌中注射表達靶向D N Μ 2的s h R N A (AAGGACATGATCCTGCAGTTCAT-SEQ C或SEQ ID No 2)的AAV 5周后的K0小鼠模型 (用于XLCNM)中表型改善的實例:相對于注射對照干擾shRNA的情況，靶向DW2的shRNA改善 了經注射的肌肉的重量（圖28)、一般的組織學（圖29)，在定性和定量評估方面增加了纖維 大小（圖29和圖30)以及使得核定位恰當（圖30)。
【主權項】
1. 一種用于治療中央核性肌病的發動蛋白2抑制劑，其中，所述發動蛋白2抑制劑選自 于由如下抑制劑所組成的組： 針對發動蛋白2的抗體;特異性干擾發動蛋白2表達的核酸分子；以及抑制發動蛋白2的 活性、表達或功能的小分子。2. 根據權利要求1所述的用于治療中央核性肌病的發動蛋白2抑制劑，其中，所述小分 子選自于由如下小分子所組成的組： 3-羥基萘-2-甲酸(3，4-二羥基苯亞甲基)酰肼;3-羥基-N '-[(2，4，5-三羥基苯基)亞甲 基]萘-2-甲酰肼;十四烷基三甲基溴化銨;4-氯-2- ((2- (3-硝基苯基)-1，3-二氧代-2，3-二 氫-1H-異吲哚-5-羰基)-氨基)-苯甲酸；2-氰基-N-辛基-3-[l-(3-二甲基氨丙基)-1Η-Β引 哚-3-基]丙烯酰胺；3-(2，4-二氯-5-甲氧基苯基)-2-硫烷基喹唑啉-4(3H)-酮;N，N'-(丙 烷-1，3-二基)雙(7，8-二羥基-2-亞氨基-2H-苯并吡喃-3-甲酰胺）;N，N ' -(乙烷-1，2-二基） 雙(7,8-二羥基-2-亞氨基-2H-苯并吡喃-3-甲酰胺）；十八烷基三甲基溴化銨;具有氨基酸 序列QVPSRPNRAP的發動蛋白抑制肽;3-羥基4'-[(2,4,5-三羥基苯基)亞甲基]萘-2-甲酰 肼;和4-(N，N-二甲基-N-十八烷基-N-乙基)-4-氮雜-10-氧雜三環-[5.2.1 ]癸烷-3，5-二酮 溴化物。3. 根據權利要求1或2所述的用于治療中央核性肌病的發動蛋白2抑制劑，其中，所述中 央核性肌病選自于由如下疾病所組成的組： X連鎖CNM、常染色體隱性CNM和常染色體顯性CNM。4. 根據權利要求1或2所述的用于治療中央核性肌病的發動蛋白2抑制劑，其中，所述中 央核性肌病是X連鎖CNM或常染色體隱性CNM。5. 根據權利要求1或2所述的用于治療中央核性肌病的發動蛋白2抑制劑，其中，所述中 央核性肌病是由BIN1突變造成的中央核性肌病。6. 根據權利要求1、3、4和5中任一項所述的用于治療中央核性肌病的發動蛋白2抑制 劑，其中，所述發動蛋白2抑制劑選自于由如下抑制劑所組成的組： 針對發動蛋白2的抗體;或特異性干擾發動蛋白2表達的核酸分子。7. 根據權利要求1、3、4、5和6中任一項所述的用于治療中央核性肌病的發動蛋白2抑制 劑，其中，所述發動蛋白2抑制劑是特異性干擾發動蛋白2表達的核酶、RNAi或反義核酸，優 選地，所述發動蛋白2抑制劑是siRNA或shRNA。8. 根據權利要求1和3-7中任一項所述的用于治療中央核性肌病的發動蛋白2抑制劑， 其中，所述發動蛋白2抑制劑為誘導發動蛋白2pr e-mRNA內的外顯子跳躍的反義核苷酸。9. 根據權利要求8所述的用于治療中央核性肌病的發動蛋白2抑制劑，其中，所述發動 蛋白2抑制劑是設計為特異性誘導DW2外顯子2或外顯子8跳躍的反義核苷酸;優選地，所述 反義核苷酸包含如下序列中的一條，或由如下序列中的一條組成： 靶向·Μ2外顯子2跳躍的U7-Ex2,包含如下序列： SEQ ID No 26：GTCACCCGGAGGCCTCTCATTCTGCAGCTC； 靶向·Μ2外顯子8跳躍的U7-Ex8,包含如下序列： SEQ ID No 27:ACACACTAGAGTTGTCTGGTGGAGCCCGCATCA。10. 根據權利要求1和3-7中任一項所述的用于治療中央核性肌病的發動蛋白2抑制劑， 其中，所述發動蛋白2抑制劑是特異性干擾發動蛋白2的核酸分子，所述核酸分子包含選自 于由SEQ ID No 2-SEQ ID No 25所組成的組中的序列，或者所述核酸分子由選自于由SEQ ID No 2-SEQ ID No 25所組成的組中的序列組成。11. 根據權利要求1和3-6中任一項所述的用于治療中央核性肌病的發動蛋白2抑制劑， 其中，所述發動蛋白2抑制劑是經工程化以靶向D匪2基因以及遞送使用基因組編輯療法的 核酸酶的DNA、mRNA或核酸酶。12. 根據權利要求1-11中任一項所述的用于治療中央核性肌病的發動蛋白2抑制劑，其 中，以足以將所述發動蛋白2的表達或所述發動蛋白2的活性、表達或功能降低至正常水平 的同等水平或優選地低于正常水平的量給予所述抑制劑。13. -種對有益于治療中央核性肌病的分子進行篩選或識別的方法，所述中央核性肌 病優選為XLCNM，所述方法包括以下步驟： a. 提供或獲得候選化合物；以及 b. 確定所述候選化合物是否抑制發動蛋白2的活性、功能和/或表達； c. 如果所述候選化合物抑制發動蛋白2的活性、表達、功能，選擇所述候選化合物。14. 根據權利要求13所述的方法，其中，所述方法進一步包括如下步驟:在體外將所選 擇的分子給予中央核性肌病非人動物模型或其部分，并分析對肌病發病或進展的作用。15. -種用于治療中央核性肌病的藥物組合物，所述藥物組合物包含發動蛋白2抑制劑 和藥學上可接受的載體/賦形劑。16. 根據權利要求15所述的藥物組合物，其中，所述發動蛋白2抑制劑為如權利要求1-11中任一項所定義的發動蛋白2抑制劑。
【文檔編號】C12N15/113GK105940108SQ201480069303
【公開日】2016年9月14日
【申請日】2014年10月20日
【發明人】喬斯林·拉波特, 貝林達·考林, 伊莎姆·塔斯法歐特
【申請人】斯特拉斯堡大學, 法國國家科學研究中心, 國家健康醫學研究所