一步法反轉錄pcr檢測和分型寨卡病毒的試劑盒及其檢測方法

一步法反轉錄pcr檢測和分型寨卡病毒的試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發明提供一步法反轉錄PCR檢測和分型寨卡病毒的引物、探針及試劑盒，以及其檢測方法和應用，以用于靈敏地、特異地、高效快速地同時檢測和分型兩種寨卡病毒基因型(亞洲型和非洲型)。本發明的設計原理在于：基于反轉錄PCR技術，建立一套適用于同時檢測和分型兩種寨卡病毒的一步法FRET?PCR系統。此系統基于寨卡病毒兩種基因型以及與之同源性較高的其他相關病原體的全基因序列，選擇相對保守的區間設計引物和探針，通過特異性地擴增，可以靈敏、快速地從臨床樣品中檢測并篩選出陽性樣品，進而根據高分辨率熔解曲線中熔解溫度Tm值的不同，從而可信度高地區分寨卡病毒亞洲型和寨卡病毒非洲型，該試劑盒和檢測方法操作便捷高效，適合于檢測大量樣本。
【專利說明】
一步法反轉錄PCR檢測和分型寨卡病毒的試劑盒及其檢測 方法
技術領域
[0001] 本發明涉及生物科學技術領域，具體涉及一步法反轉錄PCR檢測和分型寨卡病毒 的試劑盒及其檢測方法。
【背景技術】
[0002] 寨卡病毒病也稱寨卡熱(Zika fever)，是由寨卡病毒(Zika virus，ZIKAV)引起并 通過伊蚊(主要包括埃及伊蚊Aedes aegypti，白紋伊蚊Aedes albopictus，非洲伊蚊Aedes Africana)等吸血昆蟲進行傳播的急性病毒性蟲媒傳染病。該病還可以由孕婦在懷孕或生 產過程中傳播給胎兒或嬰兒，或者通過性傳播或輸血傳播。寨卡病毒感染的潛伏期約為3-12天，以發熱、皮疹、劇烈關節疼痛、肌肉疼痛以及結膜炎為主要臨床癥狀，小兒感染病例還 可出現神經系統、眼部和聽力等改變，孕婦感染寨卡病毒可能導致新生兒小頭畸形甚至胎 兒死亡。寨卡病毒廣泛分布于非洲大陸北部以及許多東南亞國家，包括印度、馬來西亞、菲 律賓、泰國、越南、巴基斯坦以及印度尼西亞，近年來在東非海岸、印度洋島嶼、美洲及加勒 比海地區島嶼流行。截至2016年1月，在非洲、亞洲、美洲以及太平洋島嶼上至少45個國家均 發現寨卡病毒傳播的證據，其中在南美洲有23個國家和地區正在流行，且流行地區呈現不 斷擴大的趨勢，感染病例數也不斷上升。截止2016年2月28日，我國已發生8例輸入性寨卡病 毒感染病例。近年來，隨著全球化進程的加快及全球變暖的加劇，為該病毒由流行地區向非 流行地區的傳播創造了條件；同時，由于寨卡熱與登革熱（Dengue fever)、黃病毒熱 (Yellow fever)、基孔肯雅熱（Chikungunya fever)、日本腦炎（Japanese encephalitis) 的臨床癥狀相似且傳播媒介類似，使得很多寨卡熱被誤診為登革熱和基孔肯雅熱。目前尚 無藥物可以預防和治療寨卡熱。
[0003] 寨卡病毒屬于黃病毒科，黃病毒屬，單股正鏈RNA病毒。寨卡病毒全基因長度約為 11Kb，直徑40~70nm，有包膜，包含10794個核苷酸，編碼3419個氨基酸，寨卡病毒基因編碼3 個結構蛋白：衣殼蛋白（C)、膜前體蛋白（prM)和包膜蛋白（M)，以及7個非結構蛋白（NS1， 吧2 &，吧213，吧3，吧4&，吧413和吧5)。根據分子生物學和生物信息學分析表明，寨卡病毒主要 存在兩個基因型：寨卡病毒非洲型（Zika virus African genotype)和寨卡病毒亞洲型 (Zika virus Asian genotype)。目前寨卡病毒的檢測方法主要有：
[0004] (1)病毒分離培養。通過從感染機體內分離得到寨卡病毒，然后將該病毒接種在 C6/36、BHK-21、Ver〇na、Hela細胞和原代鼠腎細胞等細胞系或者乳鼠、蚊子等動物中培養增 殖后進行判斷。該檢測方法具有靈敏度高、特異性強等優點，但是由于寨卡病毒的高致病 性，對培養環境、操作人員、培養條件和儀器設備等有較高的要求；
[0005] (2)血清學檢測方法。該方法用抗原和抗體結合的理論，通過包被的抗原（或者抗 體)檢測人或動物的血清抗體(或者抗原)來進行判斷。目前，寨卡病毒抗原血清學檢測方法 研究較少，抗體檢測方法較多，主要包括免疫層析法、免疫熒光法、酶聯免疫吸附法 (ELISA)、血凝抑制法、病毒中和試驗等。其中，免疫層析、免疫熒光和ELISA是目前實驗室診 斷和商業化試劑盒應用最廣泛的血清學檢測方法。由于寨卡病毒特異抗體一般需在機體感 染病毒5天后才產生，此外，不同基因型的寨卡病毒之間，以及寨卡病毒和其他與之相近的 病原體(如:登革熱病毒、西尼羅河熱病毒、黃熱病病毒等黃病毒科病毒)之間會發生交叉反 應(張碩，李德新。寨卡病毒和寨卡病毒病。病毒學報，2016,第32卷，第1期），從而影響確診。 這些都使得該方法無法適用于在寨卡熱集中爆發時進行快速和準確的檢測和診斷；
[0006] (3)分子生物學方法。該方法主要通過聚合酶鏈式反應(PCR)方法檢測樣本中有無 寨卡病毒的RNA來進行判斷。分子生物學方法具有所需樣本來源多樣（如：病毒培養液、血 液、蚊子標本等均可）、樣本用量少、檢測快速準確、靈敏度高、特異性強等特點，使其成為目 前應用最廣泛的臨床檢測方法之一。其中應用的關鍵是確保RNA中無 RNA酶和基因組DNA的 污染。其中，反轉錄聚合酶鏈式反應技術(Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)，是以實時熒光RT-PCR為主的分子生物學方法，為寨卡病毒感染的診斷、 預防和控制提供了快速、準確、有效的診斷方法。使用常規的RT-PCR檢測方法，一般在發病 后4天內在感染者外周血中可檢測到病毒核酸;而應用更靈敏的實時熒光RT-PCR技術，可以 在感染當日或發病7日后可檢測到病毒核酸。因此，對處于發熱期的可疑病例，首選的實驗 室檢測方法為實時熒光RT-PCR，而且可將PCR產物進行序列測定，準確判定是否為寨卡病毒 感染或者感染的寨卡病毒的基因型。
[0007] 然而，現有的寨卡病毒PCR檢測方法不能實時、特異和靈敏地檢測或區分寨卡病毒 核酸的兩種基因型。寨卡病毒分為非洲型和亞洲型，寨卡病毒非洲型主要在非洲地區流行， 而寨卡病毒亞洲型主要在東亞和東南亞地區流行，因此兩種基因型的寨卡病毒存在基因水 平上的差異，如果要同時檢測兩種基因型的寨卡病毒需要從兩種基因型寨卡病毒的全基因 序列中選擇保守序列并巧妙地設計引物可以同時擴增兩種基因型的寨卡病毒，但是不會擴 增其他與之相近的的病毒；同時，如果要達到區分兩種寨卡病毒基因型的目的，需要將陽性 樣品或可疑樣品通過對PCR產物的基因測序后進行判定。因此，建立寨卡病毒的快速、方便、 準確的檢驗檢測方法，有利于了解寨卡病毒的生物學特性、臨床診斷，并將其應用于寨卡 病毒感染的檢測工作，對防止其傳入我國具有重要意義。
[0008] 已公布中國專利申請（申請號：201610099248.7)提供了一種用于亞洲型寨卡病毒 的熒光RT-PCR正向、反向引物和熒光寡核苷酸探針、試劑盒及檢測方法，用以快速、高效、定 性的檢測樣本中的亞洲型寨卡病毒。該專利申請的技術方案：1)只能檢測寨卡病毒亞洲型； 2)是利用水解探針（熒光寡核苷酸探針）的熒光反轉錄PCR進行檢測，因而在進行相關樣品 檢測時只有擴增曲線而沒有熔解曲線，從而只能通過擴增曲線的有無來判定樣品的陰陽 性，無法有效地減少或避免假陽性結果，其檢測結果的可行度有待提高;3)其試劑盒的最低 檢出限為1X10 3拷貝/mL。

【發明內容】

[0009] 本發明的目的是提供一種高度靈敏、特異、可以高效快速地檢測和分型兩種寨卡 病毒基因型的引物、探針及試劑盒，以及其檢測方法和應用。本發明的設計原理在于:基于 反轉錄PCR技術，建立一套適用于同時檢測和分型兩種寨卡病毒的的一步法FRET-PCR系統。 此系統基于寨卡病毒兩種基因型以及與之同源性較高的其他相關病原體的全基因序列，選 擇相對保守的區間設計引物和探針，經過特異性地擴增，可以靈敏、快速地從臨床樣品中檢 測并篩選出陽性樣品，進而根據高分辨率熔解曲線中熔解溫度1值的不同，從而可信度高 地區分寨卡病毒亞洲型和寨卡病毒非洲型。
[0010]為了實現上述目的，本發明的技術方案如下：
[0011 ]本發明提供了一種反轉錄PCR檢測寨卡病毒的試劑盒，包括引物、探針和FRET-PCR 標準品，其中：
[0012]所述引物為上游引物和下游引物;所述上游引物具有SEQ ID No.1的核苷酸序列； 所述下游引物具有SEQ ID No.2的核苷酸序列；
[0013]所述探針為6-FAM探針和LCRed640探針；所述6-FAM探針具有SEQIDNo.3的核苷 酸序列;所述LCRed640探針具有SEQIDNO.4的核苷酸序列；
[0014] 進一步地，所述試劑盒包括:上述引物、6-FAM探針和LCRed640探針，以及PCR緩沖 液、熱啟動Taq酶、dNTP和FRET-PCR標準品；還可以包括PCR陰性對照，可選地，所述PCR陰性 對照為雙蒸水。
[0015] 進一步地，所述FRET-PCR標準品包括DNA質粒標準品和RNA標準品。其中，所述DNA 質粒標準品是將具有SEQ ID No.5和SEQ ID No.6序列的核苷酸片段插入pUC57載體構建而 成的重組質粒;所述RNA標準品是將含有SEQ ID No. 5和SEQ ID No.6序列和T7啟動子序列 的質粒通過體外轉錄獲得的RNA核苷酸。
[0016]更進一步地，所述DNA質粒標準品和RNA標準品模板的濃度為100基因拷貝/微升。 [0017]本發明提供了一種反轉錄PCR檢須彳寨卡病毒的試劑盒的反轉錄PCR擴增檢測體系， 反轉錄PCR擴增對象包括RNA標準品或者RNA模板、RNA提取的陰性對照和RT-PCR陰性對照；
[0018] 反轉錄PCR擴增檢測體系包括如下擴增體系:體積比為擴增體系總體積50%的樣 品RNA模板或者RNA標準品、lx PCR緩沖液、ΙμΜ的上游引物、ΙμΜ下游引物、0.2μΜ的6-FAM探 針、0.2μΜ的LCRed640探針、2個單位的商業化Taq酶、200μΜ dNTP、0.14個單位的商業化反轉 錄酶、20個單位的商業化RNA酶抑制劑;優選地，所述的擴增體系的總體積為20μ 1或者40μ 1。
[0019] 進一步地，所述的反轉錄PCR擴增體系的反應條件包括:反轉錄、預變性、18個溫度 遞減的高嚴謹循環、30個欠嚴謹的熒光獲得循環和1個降溫循環，其中：
[0020] 反轉錄：lxl5min@55°C ;預變性：lx2min@95°C ; 18個溫度遞減的高嚴謹循環： 6xlseci95〇C ,12seci72〇C ,30seci72〇C ；9xlseci95〇C ,12seci70〇C ,30seci72〇C ；3xlseci95 °C，12sec@68°C，30sec@72°C ;30個欠嚴謹的熒光獲得循環：30xlsec@95°C，8sec@55-58°C， 3〇8θ(：@67Γ and 3〇8θ(：@72Γ;降溫循環：lxlsec@4(TC。
[0021 ]本發明提供了一種反轉錄PCR檢測寨卡病毒的試劑盒的實時熒光定量FRET-PCR擴 增檢測體系，實時熒光定量FRET-PCR擴增對象包括DNA質粒標準品、PCR陰性對照；
[0022]實時熒光定量FRET-PCR擴增檢測體系包括如下擴增體系:體積比為擴增體系總體 積50%的樣品DNA模板或者DNA質粒標準品、lx PCR緩沖液、ΙμΜ上游引物、ΙμΜ下游引物、0.2 μΜ的6-FAM探針、0.2μΜ的LCRed640探針、2個單位的商業化Taq酶、200μΜ dNTP，優選地，所述 的擴增體系的總體積為20μ1或者40μ1。
[0023]進一步地，所述的實時熒光定量FRET-PCR擴增檢測體系的PCR擴增反應條件包括： 預變性、18個溫度遞減的高嚴謹循環、30個欠嚴謹的熒光獲得循環、1個持續熒光獲得的熔 解循環和1個降溫循環，其中：
[0024]預變性：lx2min@95°C;18 個溫度遞減的高嚴謹循環：6xlsec@95°C，12sec@72°C， 30seci72〇C ；9xlseci95〇C ,12seci70〇C ,30seci72〇C ；3xlseci95〇C ,12seci68〇C ,30seci72 °C ; 30個欠嚴謹的熒光獲得循環：30xlsec@95°C，8sec@55-58°C，30sec@67°Cand 30sec@72 °C ; 1 個熔解循環：lxlsec@95°C，10sec@40°C，@85°C持續收集熒光；降溫循環：lxlsec@40°C。
[0025] 本發明還公開了一種檢測和分型寨卡病毒的檢測方法，其特征在于，包括以下步 驟：
[0026] 步驟1:準備檢測樣品RNA模板；
[0027] 步驟2:按照產品說明配制引物和探針;配制如上述的用于檢測和分型寨卡病毒的 一步法反轉錄PCR反應體系和用于質粒標準品的PCR反應體系，對步驟1中所述的待檢RNA模 板和標準品進行擴增;其反應條件包括:反轉錄、預變性、18個溫度遞減的高嚴謹循環、30個 欠嚴謹的熒光獲得循環和1個降溫循環;反轉錄：lxl5min@55°C ;預變性：lx2min@95°C ; 18個 溫度遞減的高嚴謹循環：61186(3@95。(：，1286(3@72。(：，3〇86(3@72。(：；91186(3@95。(：，1286(3@70 °C，30sec@72°C ;3xlsec@95°C，12sec@68°C，30sec@72°C ;30個欠嚴謹的熒光獲得循環： 30χ?8θ(3@95Γ，88θ(3@55-58Γ，3〇8 θ(3@67Γ and 3〇8θ(：@72Γ;降溫循環：lxlsec@4(TC;在每 個循環的退火時收集熒光信號;所述熒光探針和標準探針分別對應目標熒光通道、寨卡病 毒非洲型標準品熒光通道和寨卡病毒亞洲型標準品熒光通道；
[0028] 步驟3 :反應結束后，讀取并記錄檢測通道擴增曲線和熔解溫度1"值;所述檢測通 道包括目標熒光通道、寨卡病毒非洲型標準熒光通道和寨卡病毒亞洲型標準熒光通道，所 述目標熒光通道的熔解溫度Tfl，所述非洲型標準熒光通道的熔解溫度TfAF，所述亞洲型 標準熒光通道的熔解溫度T m-AS，根據以下內容進行檢測結果的判定：
[0029] 1)當目標熒光通道和標準熒光通道均有擴增曲線，且熔解溫度Tm-1和T m-AF-致 (±1C°)，則檢測樣品為寨卡病毒非洲型病毒陽性；
[0030] 2)當目標熒光通道和標準熒光通道均有擴增曲線，且熔解溫度Tm-1和T m-AS-致 (±1C°)，則檢測樣品為寨卡病毒亞洲型病毒陽性；
[0031] 3)當目標熒光通道無擴增曲線和熔解溫度，標準熒光通道同時有擴增曲線和熔解 溫度!^值，則檢測樣品為寨卡病毒陰性；
[0032] 4)當目標熒光通道有擴增曲線但無熔解溫度，標準熒光通道同時具有擴增曲線和 熔解溫度，重復一次實驗，結果相同，則檢測樣品為寨卡病毒陰性；
[0033] 5)當目標熒光通道無擴增曲線但有熔解溫度，標準熒光通道同時具有擴增曲線和 熔解溫度，且T m-1和Tm_AF-致（±1C°)，重復一次實驗，結果相同，則檢測樣品為寨卡病毒非 洲型陽性；
[0034] 6)當目標熒光通道無擴增曲線但有熔解溫度，標準熒光通道同時具有擴增曲線和 熔解溫度，且T m-1和Tm-AS-致（±1C°)，重復一次實驗，結果相同，則檢測樣品為寨卡病毒亞 洲型陽性。
[0035] 本發明上面所述的反轉錄PCR檢測寨卡病毒的試劑盒及其檢測方法在檢測寨卡病 毒核酸中的應用。
[0036] 本發明的技術方案達到了如下的有益效果：
[0037] 本發明提供了用于檢測和分型寨卡病毒2種基因型的一步法反轉錄PCR引物和探 針的試劑盒及檢測方法，通過熒光共振能量轉移(FRET)探針檢測技術達到快速高效、方便、 準確、特異地檢測和分型待檢樣品中寨卡病毒核酸，從而判斷樣品中是否存在寨卡病毒病、 且確定其感染的寨卡病毒基因型。
[0038] 1)本發明根據寨卡病毒2種基因型核酸序列中保守區間建立了一種可以對2種寨 卡病毒基因型進行同時檢測和分型的反轉錄PCR系統，其中，首先從NCBI上獲得2種寨卡病 毒基因型以及與之同源性較高的其他相關病原體的全基因序列，選擇其中對寨卡病毒相對 保守的區間巧妙地設計了一對引物和一對探針，以特異地擴增并通過高分辨率熔解曲線分 析的1^值的不同，區分2種基因型的寨卡病毒，從而能夠高效且特異性地同時檢測和分型兩 種基因型的寨卡病毒；
[0039] 2)在高效且特異性地同時檢測和分型兩種基因型的寨卡病毒的基礎上，本發明巧 妙地選擇寨卡病毒保守區域作為目的片段設計引物和探針，還確保此系統不擴增其它非寨 卡病毒的微生物，尤其是與其同源性相近的其他黃病毒屬中的病毒，如登革熱病毒(Dengue virus)、黃熱病病毒(Yellow fever virus)基孔肯雅病毒(Chikungunya virus)、乙型腦炎 病毒(Japanese enchephalitis virus)、西尼羅河熱病毒(West Nile virus)等；以及與其 臨床表現相似且傳播媒介相同、經常被誤診的傳染病，如瘧疾等，從而使寨卡病毒的檢測具 有更尚的準確性；
[0040] 3)本發明申請通過雜交探針（熒光共振能量轉移原理，FRET:Fluorescence Resonance Energy Transfer)焚光定量反轉錄PCR方法進行檢測的，此檢測PCR體系不僅具 有擴增曲線且同時具有熔解曲線，因此只有同時具有擴增曲線和熔解曲線才判定為陽性樣 品，所以提高了檢測結果的可信度，大大減少了假陽性的結果；
[0041] 4)本發明所提供的檢測試劑盒和檢測方法可以靈敏度高、快速準確、特異性地檢 測和分型兩種基因型的寨卡病毒，尤其適用于臨床癥狀不明顯的寨卡病毒感染早期或恢復 期，機體內病毒的含量相對較低的時期，是對處于發熱期的可疑寨卡病毒感染病例的首選 實驗室檢測方法。本發明具有高靈敏度的反轉錄FRET-PCR體系，在該體系擴增效率的檢測 中，可以有效地擴增最低ΠΓ 7禽流感病毒H1N1的RNA核酸(從雞胚尿囊液中制備的RNA核酸標 準品）；此外，其實時熒光RT-PCR體系可以在每10μ1的樣品最低檢測到1個拷貝的樣品核酸 (100拷貝/mL)，從而能夠及時、快速地診斷、監測和控制傳染病，尤其像寨卡熱這種急性傳 染病；
[0042] 5)本發明所提供的檢測試劑盒和檢測方法，操作便捷高效，適合于檢測大量樣本， 為寨卡病毒感染爆發時的快速、準確地診斷大批臨床樣品，并盡快地控制本病毒感染提供 了堅實的基礎。
【附圖說明】
[0043] 圖1是本發明寨卡病毒非洲型的擴增曲線的示意圖。圖中，各濃度依次為IX 104/ 反應，1 X 103/反應，1 X 102/反應，1 X 101/反應，1 X 10*7反應的寨卡病毒非洲型質粒標準 品，各2個重復數據，NC為陰性對照樣品，橫坐標Cycle表示PCR反應擴增循環數，縱坐標 Fluorescence (498-640)表不在640nm處的焚光強度。
[0044] 圖2是本發明寨卡病毒非洲型的熔解曲線的示意圖。圖中，各曲線為IX 104/反應， 1 X 103/反應，1 X 102/反應，1 X 101/反應，1 X 10*7反應的寨卡病毒非洲型質粒標準品及陰 性對照的恪解曲線，各2個重復數據，橫坐標Temperature表示PCR反應恪解溫度Tm值，縱坐 標-((1/(11')?111〇代8〇611〇6(498-640)表示在64〇111]1處的焚光強度的二階負導數。
[0045] 圖3是本發明寨卡病毒亞洲型的擴增曲線的示意圖。圖中，各濃度依次為1 ΧΙΟ4/ 反應，1 X 103/反應，1 X 102/反應，1 X 101/反應，1 X 10*7反應的寨卡病毒亞洲型質粒標準 品，各2個重復數據，NC為陰性對照樣品，橫坐標Cycle表示PCR反應擴增循環數，縱坐標 Fluorescence (498-640)表不在640nm處的焚光強度。
[0046] 圖4是本發明寨卡病毒亞洲型的熔解曲線的示意圖。圖中，各曲線為IX 104/反應， 1 X 103/反應，1 X 102/反應，1 X 101/反應，1 X 10Q/反應的寨卡病毒亞洲型質粒標準品及陰 性對照的恪解曲線，各2個重復數據，橫坐標Temperature表示PCR反應恪解溫度Tm值，縱坐 標-((1/(11')?111〇代8〇611〇6(498-640)表示在64〇111]1處的焚光強度的二階負導數。
[0047] 圖5是本發明兩種基因型寨卡病毒質粒的熔解曲線的示意圖。圖中，曲線為IX 1〇3/反應的寨卡病毒非洲型和寨卡病毒亞洲型質粒標準品和陰性對照的高分辨率熔解曲 線，各3個重復數據，橫坐標Temperature表示PCR反應恪解溫度Tm值，縱坐標_(d/dT) Fluorescence (498-640)表示在640nm處的焚光強度的二階負導數。
[0048]圖6是本發明中反轉錄PCR體系的擴增曲線的示意圖。圖中，各濃度依次為IX 10-3/ 反應，1 X 10_4/反應，1 X 10_5/反應，1 X 10_6/反應，1 X 10_7/反應的流感病毒RNA核酸標準品， 各3個重復數據，NC為陰性對照樣品，橫坐標Cycle表示PCR反應擴增循環數，縱坐標 Fluorescence (498-640)表不在640nm處的焚光強度。
[0049] 圖7是本發明中反轉錄PCR體系的熔解曲線的示意圖。圖中，各曲線為IX 10-3/反 應，1 X 10-4/反應，1 X 10-5/反應，1 X 10-6/反應，1 X 1〇々反應的流感病毒RNA核酸標準品及 陰性對照的熔解曲線，各2個重復數據，橫坐標Temperature表示PCR反應熔解溫度1?值，縱 坐標-(d/dT)Fluorescence (498-640)表示在640nm處的焚光強度的二階負導數。
[0050] 圖8是本發明兩種寨卡病毒基因型瓊脂糖凝膠電泳的示意圖。圖中各泳道依次為： 泳道-1:標準品；泳道-2:寨卡病毒非洲型（Zika virus Asian genotype，ZIKV_Asian);泳 道_3:寨卡病毒亞洲型（Zika virus African genotype，ZIKV_African)。其中，標準品 (Ladder)各條帶大小依次為 100bp，200bp，300bp，400bp，500bp，600bp，700bp，800bp， 900bp，和lOOObp。
【具體實施方式】
[0051] 為了闡明本發明的技術方案及技術目的，下面結合附圖及【具體實施方式】對本發明 做進一步的介紹。
[0052] 本發明提供了用于檢測和分型寨卡病毒2種基因型的一步法反轉錄PCR引物和探 針的試劑盒及檢測方法，通過熒光能量共振轉移(FRET)探針檢測技術達到快速、方便、準 確、特異地檢測和分型待檢樣品中寨卡病毒核酸，從而判斷樣品中是否存在寨卡病毒病且 確定其感染的寨卡病毒基因型。
[0053] 實施例1
[0054]本實施例1中提供了一種用于檢測和分型寨卡病毒2種基因型的一步法反轉錄 FRET-PCR的試劑盒，包括引物和探針，以及PCR緩沖液、熱啟動Taq酶、dNTP、FRET-PCR標準 品、以及雙蒸水PCR陰性對照；
[0055] 其中，所述引物為上游引物和下游引物;所述探針為6-FAM探針和LCRed640探針； 所述引物和探針的核苷酸序列分別如下：
[0060] 其中6-FAM探針為供體探針，在其3'端標記有供體染料FAM;LCRed640探針為受體 探針，在其5 '端標記有受體染料LCRedi t640.供體染料由儀器中自帶的合適的激發濾光片 激發，并釋放能量激發受體染料，受體染料激發后發射出不同波長的熒光，其熒光量與PCR 產生的靶DNA的數量呈成正比。
[0061 ]所述FRET-PCR標準品是由商業化基因合成公司（金斯瑞生物科技，中國南京)獲得 的寨卡病毒非洲型和亞洲型保守區間的核苷酸片段插入PUC57載體構建而成的重組質粒。 所述DNA質粒標準品的濃度為100基因拷貝/微升。
[0062] 其中，所述寨卡病毒亞洲型（Zika virus Asian genotype)特異性保守序列具有 SEQ ID吣.5的序列：
[0064] 所述寨卡病毒非洲型（Zika virus African genotype)特異性保守序列具有SEQ ID No.6的序列：
[0066]采用本例所述的試劑盒對檢測樣品進行檢測時，主要包括以下步驟：
[0067]步驟A:待檢樣品RNA的提取：所述樣品RNA可以采取羅氏診斷公司生產的H i gh Pure RNA Isoaltion Kit(Roche，Germany)試劑盒，按照試劑盒說明書進行提取。
[0068] 步驟B:以步驟A的待檢樣品RNA為模板，配制一步法反轉錄FRET-PCR反應體系，進 行擴增反應，其中反應體系如下：反轉錄PCR擴增檢測體系包括20μ1的擴增體系，?ομL的待 測樣品RNA模板或者體外轉錄RNA樣品、lxPCR緩沖液、ΙμΜ上游引物、ΙμΜ下游引物、0.2μΜ的 6-FAM探針、0.2μΜ的LCRed640探針、2個單位的商業化Taq酶、200μΜ dNTP、0.14個單位的商 業化反轉錄酶、20個單位的商業化RNA酶抑制劑。
[0069]其中，所述反應條件包括:反轉錄、預變性、18個溫度遞減的高嚴謹循環、30個欠嚴 謹的熒光獲得循環和1個降溫循環;反轉錄：lxl5min@55°C ;預變性：lx2min@95°C ; 18個溫度 遞減的高嚴謹循環：6χ?8θ(：@95Γ，128θ(3@72Γ，3〇8θ(：@72Γ ;9χ?8θ(：@95Γ，12sec@7(TC， 30sec@72°C ;3xlsec@95°C，12sec@68°C，30sec@72°C ;30個欠嚴謹的熒光獲得循環： 30χ?8θ(：@95Γ，88θ(3@55-58Γ，3〇8θ(：@67Γ and 3〇8θ(：@72Γ ;降溫循環：lxlsec@4(TC 〇
[0070]步驟C:結果分析
[0071 ] 1)讀取并記錄檢測通道擴增曲線和熔解溫度Tm值;所述檢測通道包括目標熒光通 道、寨卡病毒非洲型標準熒光通道和寨卡病毒亞洲型標準熒光通道，所述目標熒光通道的 熔解溫度Tfl，所述非洲型標準熒光通道的熔解溫度TfAF，所述亞洲型標準熒光通道的熔 解溫度Tm-AS。
[0072] 2)質量控制
[0073 ]陰性對照:無擴增曲線且無熔解溫度；
[0074] 陽性對照:具有擴增曲線，同時具有熔解溫度Tm-AF和Tm-AS;
[0075] 以上兩個條件需要在同一次實驗中同時滿足，否則本次實驗無效，需要重新進行 實驗。
[0076] 3)結果判讀
[0077] a)當目標熒光通道和標準熒光通道均有擴增曲線，且熔解溫度Tm-1和Tm-AF-致 (±1C°)，則檢測樣品為寨卡病毒非洲型病毒陽性；
[0078] b)當目標熒光通道和標準熒光通道均有擴增曲線，且熔解溫度Tm-1和Tm-AS-致 (±1C°)，則檢測樣品為寨卡病毒亞洲型病毒陽性；
[0079] c)當目標熒光通道無擴增曲線和熔解溫度，標準熒光通道同時有擴增曲線和熔解 溫度!^值，則檢測樣品為寨卡病毒陰性；
[0080] d)當目標熒光通道有擴增曲線但無熔解溫度，標準熒光通道同時具有擴增曲線和 熔解溫度，重復一次實驗，結果相同，則檢測樣品為寨卡病毒陰性；
[0081] e)當目標熒光通道無擴增曲線但有熔解溫度，標準熒光通道同時具有擴增曲線和 熔解溫度，且Tm-1和T m_AF-致（±1C°)，重復一次實驗，結果相同，則檢測樣品為寨卡病毒非 洲型陽性；
[0082] f)當目標熒光通道無擴增曲線但有熔解溫度，標準熒光通道同時具有擴增曲線和 熔解溫度，且Tm-1和T m_AS-致（±1C°)，重復一次實驗，結果相同，則檢測樣品為寨卡病毒亞 洲型陽性；
[0083] 實施例2
[0084]本實施例2通過載有寨卡病毒非洲型和寨卡病毒亞洲型的質粒標準品驗證本發明 中一步法反轉錄FRET-PCR檢測方法的靈敏度、特異性和擴增效率。
[0085] 1)本發明檢測方法靈敏度的確定
[0086] 步驟A: DNA質粒標準品的制備
[0087] 由金斯瑞（金斯瑞生物科技，中國南京）合成寨卡病毒2個基因型（ZIKV-Asian、 ZIKV-African)目的片段的DNA序列。依據合成物的分子量和絕對重量，計算合成物所含的 基因拷貝的絕對數目。隨后，對合成物進行稀釋，制備每個反應的稀釋試劑含IX 1〇4拷貝、1 X103拷貝、IX 102拷貝、IX 101拷貝、IX 10°拷貝的目的基因作為標準品。用本發明系統擴 增含不同基因濃度的稀釋液，來確定本發明檢測此基因的靈敏度。本發明試劑盒中提供寨 卡病毒2個基因型、濃度為100基因拷貝/微升的DNA質粒標準品。
[0088]步驟B:以步驟A獲得的DNA質粒樣品為擴增模板，配制20μ1的FRET-PCR擴增體系， 包括1 〇μ 1的樣品DNA模板、1 xPCR緩沖液、1 μΜ上游引物、ΙμΜ下游引物、0.2μΜ的6-FAM探針、 0.2μΜ的LCRed640探針、2個單位的商業化Taq酶、200μΜ dNTP。
[0089] 步驟C:對步驟B中的反應體系進行PCR擴增，所述PCR擴增設置反應條件包括:預變 性、18個溫度遞減的高嚴謹循環、30個欠嚴謹的熒光獲得循環、1個持續熒光獲得的熔解循 環和1個降溫循環；預變性：lx2min@95°C ; 18個溫度遞減的高嚴謹循環：6xlsec@95°C， 12seci72〇C ,30seci72〇C ；9xlseci95〇C a2seci70〇C ,30seci72〇C ；3xlseci95〇C , 12seci68 °C，30sec@72°C ;30個欠嚴謹的熒光獲得循環：30xlsec@95°C，8sec@55-58°C，30sec@67°C and 30sec@72°C ; 1 個熔解循環：lxlsec@95°C，10sec@40°C，@85°C持續收集熒光；降溫循環： lxlsec@40°C。
[0090] 重復上述檢測兩次。
[0091] 實驗結果（圖1至圖4)表明，本發明所建立的一步法反轉錄FRET-PCR具有高靈敏 度，不僅可以擴增2種寨卡病毒(寨卡病毒非洲型和寨卡病毒亞洲型），而且最低可以檢測到 單個拷貝的寨卡病毒DNA質粒標準品；此外，兩次重復測試結果基本一致，說明本方法具有 可重復性。
[0092] 2)本發明反轉錄PCR特異性的確定
[0093]本發明的特異性從三個方面得到保證：
[0094] a)通過BLAST搜索驗證其不會擴增其它非寨卡熱病原體尤其是與其同源性相近或 臨床特征相似的病原體核酸：
[0095] 設計的引物和探針經過 NCBI (www · ncbi · nlm · nih · gov)中的 BLAST (WWW · blast · ncbi. nlm. nih · gov/Blast · cgi)搜索，確認本發明設計的引物能特異地擴增所 有的寨卡病毒基因型(寨卡病毒非洲型、寨卡病毒亞洲型），而不擴增其它非寨卡熱病原體 尤其是與其同源性相近(登革熱病毒、基孔肯雅病毒、埃博拉病毒、乙型腦炎病毒等)或臨床 特征相似(瘧疾等)的病原體核酸。通過BLAST確認，本發明RT-PCR的探針和引物可以特異地 擴增和檢測兩種寨卡病毒基因型的核酸但不擴增其他相關病毒的核酸；
[0096] b)通過高分辨率熔解曲線中Tm值的不同驗證其可以區分寨卡病毒兩種基因型 (ZIKV-Asian^ZIKV-African)：
[0097 ] 步驟A: DNA質粒標準品的制備
[0098]由金斯瑞（金斯瑞生物科技，中國南京）合成寨卡病毒2個基因型（ZIKV-Asian、 ZIKV-African)目的片段的DNA序列。依據合成物的分子量和絕對重量，計算合成物所含的 基因拷貝的絕對數目。隨后，對合成物進行稀釋，制備每個反應的稀釋試劑含IX 1〇4拷貝、1 X 103拷貝、1 X 102拷貝、1 X 101拷貝、1 X 10°拷貝的目的基因作為標準品。
[0099]步驟B:以步驟A獲得的DNA樣品為擴增模板，配制20μ1的FRET-PCR擴增體系，包括 1〇μ1的樣品DNA模板、lxPCR緩沖液、ΙμΜ上游引物、ΙμΜ下游引物、0.2μΜ的6-FAM探針、0.2μΜ 的LCRed640探針、2個單位的商業化Taq酶、200μΜ dNTP。
[01 00]步驟C:對步驟B中的反應體系進行PCR擴增，所述PCR擴增設置反應條件包括:預變 性、18個溫度遞減的高嚴謹循環、30個欠嚴謹的熒光獲得循環、1個持續熒光獲得的熔解循 環和1個降溫循環；預變性：lx2min@95°C ; 18個溫度遞減的高嚴謹循環：6xlsec@95°C， 12seci72〇C ,30seci72〇C ；9xlseci95〇C a2seci70〇C ,30seci72〇C ；3xlseci95〇C , 12seci68 °C，30sec@72°C ;30個欠嚴謹的熒光獲得循環：30xlsec@95°C，8sec@55-58°C，30sec@67°C and 30sec@72°C ; 1 個熔解循環：lxlsec@95°C，10sec@40°C，@85°C持續收集熒光；降溫循環： lxlsec@40°C。
[0101] 重復上述檢測三次。
[0102] 結果如圖1-5所示，本發明系統可以特異、高效的擴增兩種血清型的寨卡病毒DNA; 同時，本發明可以通過高分辨率熔解曲線中Tm值的不同區分兩種寨卡病毒的非洲型和亞洲 型，寨卡病毒非洲型具有雙峰，即兩個Tm值(54.1°(：;64.8°(：);而寨卡病毒亞洲型為單峰，即 具有一個Tm(53.8°C)值。因此，本發明中所建立的一步法反轉錄FRET-PCR可以通過高分辨 率熔解曲線中Tm值的不同區分寨卡病毒非洲型和寨卡病毒亞洲型。
[0103] c)通過瓊脂糖凝膠電泳驗證其可以區分寨卡病毒兩種基因型(ZIKV-Asian、ZIKV-Afr i can)之間的特異性：
[0104] 將上述b)部分中產生的PCR產物進行濃度為3 %瓊脂糖凝膠電泳，其中各孔上樣量 為 10μ1，標準品各條帶從小到大依次為 100bp，200bp，300bp，400bp，500bp，600bp，700bp， 800bp，900bp，和lOOObp。
[0105] 結果如圖8所示，泳道-1:標準品；泳道-2:寨卡病毒非洲型（Zika virus Asian genotype，ZIKV_Asian);泳道-3:寨卡病毒亞洲型（Zika virus African genotype，ZIKV_ African)，寨卡病毒兩種基因型顯示167堿基對(bp)的條帶大小。
[0106] 3)本發明中反轉錄PCR體系效率的確定：
[0107] 步驟A: RNA標準品的制備
[0108] 用禽流感病毒H1N1感染雞胚后收取其尿囊液，用商業RNA提取試劑盒(High Pure RNA Isolation Kit，羅氏，德國）進行RNA核酸提取后，用TE緩沖液，PH為8.0進行10-3，10一4， 10- 5，1〇Λ 1〇Λ 10-8梯度稀釋后作為檢測反轉錄PCR系統效率的標準品。
[0109] 步驟Β:以步驟Α的獲得RNA為模板，配制一步法反轉錄FRET-PCR反應體系，進行擴 增反應，其中反應體系如下:反轉錄PCR擴增檢測體系包括20μ1的擴增體系，10μ1的樣品RNA 模板、1 xPCR緩沖液、ΙμΜ流感上游引物（5 ' -GCACTTGATATTGTGGATTCTTGATCGTCTT-3 '）、ΙμΜ流 感下游引物（5 ' -GACAAAATGACCATCGTCAACATCCACA-3 '）、0 · 2μΜ的流感6-FAM探針（5'_ CTACGGAAGGAGTGCCTGAGTCTATG-6-FAM-3 '）、0 · 2μΜ的流感LCRed640探針（5 ' -LCRED640-GGGAAGAATATCGGCAGGAACAGCAGA-PH0SPHATE-3'）、2個單位的商業化Taq酶、200μΜ dNTP、 0.14個單位的商業化反轉錄酶、20個單位的商業化RNA酶抑制劑。
[0110] 步驟C:對步驟B中配制的PCR反應體系進行擴增，其中擴增條件包括反轉錄、預變 性、18個溫度遞減的高嚴謹循環、30個欠嚴謹的熒光獲得循環和1個降溫循環。反轉錄： lxl5min@55°C;預變性：lx2min@95°C;18 個溫度遞減的高嚴謹循環:6xlsec@95°C，12sec@72 °C ,30seci72〇C ；9xlseci95〇C ,12seci70〇C ,30seci72〇C ；3xlseci95〇C ,12seci68〇C ,30seci 72°C;30個欠嚴謹的熒光獲得循環：30xlsec@95°C，8sec@55-58°C，30sec@67°C and 30sec@ 72°C ;降溫循環：lxlsec@40°C 〇
[0111] 結果如圖6和圖7，其表明本發明的反轉錄FRET-PCR體系具有較高的靈敏度，可以 檢測到反應體系中最低為10-7拷貝的禽流感病毒RNA分子。
[0112] 實施例3
[0113] 本實施例3利用基因合成目的核酸片段并導入的質粒通過商業化試劑盒在體外轉 錄合成病毒RNA核酸后，對本發明中一步法反轉錄FRET-PCR檢測方法進行驗證，本實施例3 中以檢測寨卡病毒亞洲型為例，具體操作流程如下：
[0114] 步驟A:由金斯瑞(金斯瑞生物科技，中國南京)合成含有寨卡病毒亞洲型目的片段 DNA(SEQ ID No.5)和T7啟動子的質粒批pUC57,用合適的限制性內切酶(Sac I，寶生物，大 連)對質粒進行酶切;通過PCR擴增提高目的DNA濃度；用商業化轉錄試劑盒( MEGAscript? Kit，ambion?by lifetechn〇l〇ges?，美國））對pcr擴增產物進行轉錄并獲得RNA產物;轉錄 完成后，將轉錄產物稀釋后用于反轉錄PCR進行擴增。
[0115] 1)質粒的稀釋
[0116] 將含有合成質粒的微型離心管4000轉離心2分鐘，然后加入40μ1 TE緩沖液，PH為 8.0配成質粒濃度為lOOng/μΙ的溶液；
[0117] 2)質粒的酶切
[0118] 用商業化限制性內切酶SacKSac I，寶生物，大連)對質粒進行酶切，其反應體系 為20μ1，且各試劑成分組成如下表;將各反應液混合后放入37°C環境中孵育1個小時;然后 將反應體系混合液放入56 °C環境中加熱20分鐘使限制性內切酶失火，從而終止酶切反應；
[0120] 3)PCR擴增酶切產物
[0121]用以下引物從線性質粒上擴增一段含有T7轉錄啟動子和目的DNA片段、長度為733 個堿基對(bp)的片段，從而為后續轉錄提供足夠濃度的目的DNA，大于等于Uig/μL;
[0122] P-上游引物：5 ' -AGCTATTATGCCGCCACCATCC-3 '
[0123] P-下游引物:5 ' -CAGAGTGTCACACGGCTCAGCC-3 '
[0124] 4)體外轉錄
[0125] 在室溫條件下溶解試劑盒中所有相關試劑(將RNA Polymerase Enzyme Mix置于-20 °C冰箱中待使用時取出）；
[0126] 在室溫下混合下表中的各試劑并通過移液器上下吹打混勻；
[0128] 在37°C環境中孵育4小時；加入ΙμL TURBO DNase，混勻后在37°C環境中孵育15分 鐘，從而去除反應體系中的核酸DNA，從而最終獲得體外轉錄的寨卡病毒RNA核酸。
[0129] 將上述轉錄產物用TE緩沖液(PH8.0)進行10-3，10-4,10-5稀釋；用本發明建立的可 以檢測所有寨卡病毒基因型的RT-PCR體系擴增通過上述方法獲得的轉錄產物稀釋液(核 酸 RNA)
[0130]步驟B:以步驟A的獲得的體外轉錄寨卡病毒RNA為模板，配制一步法反轉錄FRET-PCR反應體系，進行擴增反應，其中反應體系如下:反轉錄PCR擴增檢測體系包括20μ1的擴增 體系，1〇μ1的RNA標準品、lxPCR緩沖液、ΙμΜ上游引物、ΙμΜ下游引物、0.2μΜ的6-FAM探針、0.2 μΜ的LCRed640探針、2個單位的商業化Taq酶、200μΜ dNTP、0.14個單位的商業化反轉錄酶、 20個單位的商業化RNA酶抑制劑。其反應條件見實施例1步驟B。
[0131] 步驟C:結果分析
[0132] 結果表明，轉錄產物熒光擴增曲線在640nm處有熒光的出現和增強，且熔解曲線處 有單一、穩定的熔解峰和Im值。因此，本發明所建立的反轉錄PCR體系可以有效的擴增RNA， 即可以快速、有效地擴增臨床樣品中寨卡病毒RNA核酸。
[0133] 本發明方法不僅能快速、方便、準確地檢測到寨卡病毒，同時能通過分型確定其基 因型，為世界范圍內尤其是寨卡病毒暴發流行的國家和地區在控制、預防寨卡病毒的感染 提供了技術支持。
[0134] 以上顯示和描述了本發明的基本原理、主要特征和本發明的優點。本行業的技術 人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本 發明的原理，在不脫離本發明精神和范圍的前提下，本發明還會有各種變化和改進，本發明 要求保護范圍由所附的權利要求書、說明書及其等效物界定。

【主權項】
1. 一種一步法反轉錄PCR檢測和分型寨卡病毒的引物和探針，其特征在于，所述引物包 括上游引物和下游引物，所述探針包括6-FAM探針和LCRed640探針，其中： 所述上游引物具有SEQ ID No. 1的核苷酸序列； 所述下游引物具有SEQ ID No.2的核苷酸序列； 所述6-FAM探針具有SEQIDNo.3的核苷酸序列； 所述LCRed640探針具有SEQIDNo.4的核苷酸序列。2. -種一步法反轉錄PCR檢測和分型寨卡病毒的試劑盒，其特征在于，包括如權利要求 1所述的引物和探針，以及FRET-PCR標準品。3. 如權利要求2所述的一種一步法反轉錄PCR檢測和分型寨卡病毒的試劑盒，其特征在 于，所述試劑盒還包括:PCR緩沖液、熱啟動Taq酶和dNTP。4. 如權利要求2或者3所述的一種一步法反轉錄PCR檢測和分型寨卡病毒的試劑盒，其 特征在于，所述FRET-PCR標準品包括DNA質粒標準品和RNA標準品；其中，所述DNA質粒標準 品是將具有SEQ ID No.5和SEQ ID No.6序列的核苷酸片段插入pUC57載體構建而成的重組 質粒;所述RNA標準品是將含有SEQ ID No.5和SEQ ID No.6序列和T7啟動子序列的質粒通 過體外轉錄獲得的RNA核苷酸。5. -種一步法反轉錄PCR檢測和分析寨卡病毒的試劑盒的反轉錄PCR擴增檢測體系，其 特征在于，所述的反轉錄PCR擴增檢測體系包括如下擴增體系：體積比為擴增體系總體積 50%的樣品RNA模板或者RNA標準品、lx PCR緩沖液、ΙμΜ如權利要求1所述的上游引物、ΙμΜ 如權利要求1所述的下游引物、〇. 2μΜ如權利要求1所述的6-FAM探針、0.2μΜ如權利要求1所 述的LCRed640探針、2個單位的商業化Taq酶、200μΜ dNTP、0.14個單位的商業化反轉錄酶和 20個單位的商業化RNA酶抑制劑。6. 如權利要求5所述的一種一步法反轉錄PCR檢測和分析寨卡病毒的試劑盒的反轉錄 PCR擴增檢測體系，其特征在于，所述的反轉錄PCR擴增體系的反應條件包括:反轉錄、預變 性、18個溫度遞減的高嚴謹循環、30個欠嚴謹的熒光獲得循環和1個降溫循環，其中： 反轉錄：lxl5min@55°C ;預變性：lx2min@95°C ; 18個溫度遞減的高嚴謹循環:6xlsec@95 °C ,12seci72〇C ,30seci72〇C ；9xlseci95〇C ,12seci70〇C ,30seci72〇C ；3xlseci95〇C ,12seci 68°(：，3086(3@72°(：;30個欠嚴謹的熒光獲得循環：3(^186(3@95°(：，886(3@55-58°(：，3086(3@67 1€ and 30sec@72°C ;降溫循環：lxlsedMCTC。7. -種一步法反轉錄PCR檢測和分型寨卡病毒的試劑盒的實時熒光定量FRET-PCR擴增 檢測體系，其特征在于，所述的實時熒光定量FRET-PCR擴增檢測體系包括如下擴增體系:體 積比為擴增體系總體積50%的樣品DNA模板或者DNA質粒標準品、lx PCR緩沖液、ΙμΜ上游引 物、ΙμΜ下游引物、0.2μΜ的6-FAM探針、0.2μΜ的LCRed640探針、2個單位的商業化Taq酶、和 200μΜ dNTP〇8. 如權利要求7所述的一種一步法反轉錄PCR檢測和分型寨卡病毒的試劑盒的實時熒 光定量FRET-PCR擴增檢測體系，其特征在于，所述的實時熒光定量FRET-PCR擴增檢測體系 的PCR擴增反應條件包括:預變性、18個溫度遞減的高嚴謹循環、30個欠嚴謹的熒光獲得循 環、1個持續熒光獲得的熔解循環和1個降溫循環，其中： 預變性：lx2min@95°C;18 個溫度遞減的高嚴謹循環:6xlsec@95°C，12sec@72°C，30sec@ 72°C;9xlsec@95°C，12sec@70°C，30sec@72°C;3xlsec@95°C，12sec@68°C，30sec@72°C ;30 個 欠嚴謹的熒光獲得循環：3(^186(3@95°(：，886(3@55-58°(：，3〇86(3@671^11(13〇86(3@72°(： ;1個熔 解循環：lxlsec@95°C，10sec@40°C，@85°C持續收集熒光；降溫循環：lxlsec@40°C。9. 一種檢測和分型寨卡病毒的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟： 步驟1:準備檢測樣品RNA模板； 步驟2:配制如權利要求1所述的引物和探針;配制如權利請求5所述的用于檢測和分型 寨卡病毒的一步法反轉錄PCR擴增檢測體系，對步驟1中所述的待檢RNA模板和標準品進行 擴增;其反應條件包括:反轉錄、預變性、18個溫度遞減的高嚴謹循環、30個欠嚴謹的熒光獲 得循環和1個降溫循環;反轉錄：lxl5min@55°C ;預變性：lx2min@95°C ; 18個溫度遞減的高嚴 謹循環：6χ?8θ(3@95Γ，128θ(：@72Γ，3〇8θ(：@72Γ ;9χ?8θ(3@95Γ，12sec@7(TC，3〇8θ(：@72Γ ; 3xlsec@95°C，12sec@68°C，30sec@72°C ;30個欠嚴謹的熒光獲得循環：30xlsec@95°C，8sec@ 55-58°C，30sec@67°C and 30sec@72°C ;降溫循環：lxlsec@40°C ;在每個循環的退火時收集 熒光信號;所述熒光探針和標準探針分別對應目標熒光通道、寨卡病毒非洲型標準品熒光 通道和寨卡病毒亞洲型標準品熒光通道； 步驟3:反應結束后，讀取并記錄檢測通道擴增曲線和熔解溫度1"值;所述檢測通道包括 目標熒光通道、寨卡病毒非洲型標準熒光通道和寨卡病毒亞洲型標準熒光通道，所述目標 熒光通道的熔解溫度Tm-1，所述非洲型標準熒光通道的熔解溫度T m-AF，所述亞洲型標準熒 光通道的熔解溫度Tm-AS，根據以下內容進行檢測結果的判定： 1) 當目標熒光通道和標準熒光通道均有擴增曲線，且熔解溫度Tm_l和Tm-AF-致（± 1 °C)，則檢測樣品為寨卡病毒非洲型病毒陽性； 2) 當目標熒光通道和標準熒光通道均有擴增曲線，且熔解溫度Tm-1和Tm-AS-致（±1 °C)，則檢測樣品為寨卡病毒亞洲型病毒陽性； 3) 當目標熒光通道無擴增曲線和熔解溫度，標準熒光通道同時有擴增曲線和熔解溫度 !^值，則檢測樣品為寨卡病毒陰性； 4) 當目標熒光通道有擴增曲線但無熔解溫度，標準熒光通道同時具有擴增曲線和熔解 溫度，重復一次實驗，結果相同，則檢測樣品為寨卡病毒陰性； 5) 當目標熒光通道無擴增曲線但有熔解溫度，標準熒光通道同時具有擴增曲線和熔解 溫度，且Tm-1和T m-AF-致（± 1°C)，重復一次實驗，結果相同，則檢測樣品為寨卡病毒非洲型 陽性； 6) 當目標熒光通道無擴增曲線但有熔解溫度，標準熒光通道同時具有擴增曲線和熔解 溫度，且Tm-0PT m-AS-致（± 1°C)，重復一次實驗，結果相同，則檢測樣品為寨卡病毒亞洲型 陽性。10. 如權利要求1、2、5、7或者9所述的任意一項在檢測寨卡病毒核酸中的應用。
【文檔編號】C12Q1/70GK105936946SQ201610481524
【公開日】2016年9月14日
【申請日】2016年6月27日
【發明人】王成明, 張繼壘, 王瑤瑤, 有金鳳, 仇海香, 黃可
【申請人】揚州大學