一種快速鑒定特定血清型沙門菌的pcr檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明屬于生物技術檢測領域，具體涉及一種快速鑒定特定血清型沙門菌的PCR檢測試劑盒。所述試劑盒中包括tcpS基因檢測引物，所述tcpS基因檢測引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物。本發明的試劑盒能快速高通量鑒定腸炎、雞白痢/傷寒和都柏林血清型沙門菌，可作為沙門菌傳統血清學分型的輔助方法，并為這三種特定血清型沙門菌的監測與實驗室診斷提供了一種簡單快速、重復性好的新方法。
【專利說明】
一種快速鑒定特定血清型沙門菌的PCR檢測試劑盒
技術領域
[0001] 本發明屬于生物技術檢測領域，具體涉及一種快速鑒定特定血清型沙門菌的PCR 檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002] 沙門菌病是公共衛生學上有重要意義的人畜共患病之一，其病原沙門菌屬于腸桿 菌科，蛋、家畜和肉制品是主要傳播媒介，它不但可引起多種畜禽疾病，造成全身性敗血癥 和腸炎，還可以作為食源性疾病的病原體，引起人類胃腸炎和食物中毒。在我國，細菌性食 物中毒中，約有70 %~80 %是由沙門菌引起的。目前，根據Kauf fman-Whi te (K-W)血清型分 型方法，依據沙門菌菌體抗原及鞭毛抗原的不同，沙門菌目前的血清型有2500種以上，中國 已報道了 292種不同的血清型，分屬于35個0群。
[0003] 傳統的檢測方法即非選擇性和選擇性增菌、生化特性及血清學鑒定很費力、耗時， 需4-7天才能完成，其它如抗體檢測法，雖然快速，但其高假陽性使之不適于常規檢測。此 外，低水平的病原菌污染，食品加工后導致沙門菌的"致傷"及食品其它成分的干擾等因素， 使得沙門菌的檢測受到一些限制。因此，急需一些快速、特異、敏感的檢測方法，以及時發現 致病菌，控制污染及其可能對人體健康產生的危害。
【發明內容】
[0004] 針對現有技術中所存在的問題，本發明的目的在于提供一種快速鑒定特定血清型 沙門菌的PCR檢測試劑盒及其制備和應用。
[0005] 為了實現上述目的及其他相關目的，本發明采用如下技術方案：
[0006] 本發明的第一方面，提供一種快速鑒定特定血清型沙門菌的PCR檢測試劑盒，所述 試劑盒中包括tcpS基因檢測引物，所述tcpS基因檢測引物包括核苷酸序列如SEQ ID N0.1 所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物。
[0007] 本發明的試劑盒采用PCR檢測技術進行tcpS基因檢測，根據擴增及檢測情況可分 析判斷檢測對象是否屬于腸炎沙門菌、雞白痢/傷寒沙門菌或者都柏林沙門菌之一。因此， 引物的設計是本發明試劑盒的關鍵。
[0008] 基于本發明所述試劑盒是采用PCR技術來進行檢測的，所以試劑盒中還可以包括 其他一些PCR所需要的常規試劑，如:無菌水(ddH2〇)、dNTP、PCR buffer、rTaq酶、樣品基因 組DNA提取試劑等常用PCR反應試劑中的一種或多種。由于此類PCR常用試劑均可經市場途 徑單獨購得或者自行配置，因此具體需要將哪些試劑裝配入試劑盒，可以根據客戶實際需 要配置，為方便起見，也可全部裝配入試劑盒。
[0009] 本發明的試劑盒，可以是含有獨立包裝的引物對，也可以是含有配置好的含有引 物對的PCR檢測液。
[0010] 所述PCR檢測液可自行配置，也可直接以市售的不含引物的通用PCR檢測液加入引 物獲得。例如，所述試劑盒中還可以含有無菌水(ddH2〇)、dNTP、PCR buf f er、rTaq酶。加入本 發明的引物、待檢樣本DNA提取物或者或者樣本菌液即可獲得PCR反應體系。
[0011] 優選地，所述試劑盒中還可含有陽性對照。所述陽性對照為含有tcpS基因表達的 DNA樣本。
[0012] 優選地，所述試劑盒中還可含有陰性對照。陰性對照可為無 tcpS基因表達的DNA樣 本。
[0013] 本發明的第二方面，提供了前述快速鑒定特定血清型沙門菌的PCR檢測試劑盒的 使用方法，包括如下步驟：
[0014] (1)提取樣品基因組DNA;
[0015] (2)加樣:將樣品基因組DNA、陽性對照或陰性對照分別加入裝有PCR反應體系的 PCR管中，獲得對應的樣品反應管、陽性反應管或陰性反應管，所述PCR反應體系中含有前述 tcpS基因檢測引物；
[0016] (3 )PCR反應:反應管置于PCR儀上，設置循環參數，進行PCR反應；
[0017] (4)PCR反應結束后，分析結果。
[0018] 優選地，所述方法為非疾病診斷目的的方法。
[0019] 步驟(1)中，提取樣品基因組DNA為現有技術。
[0020]優選地，步驟(3)中，PCR反應的條件設置為：（a)94°C 5min;(b)94°C 45s;(c)59°C 45s;(d)72°C lmin，步驟(a)~（d)循環 30 次，（e)72°C lOmin。
[0021] 本發明的第三方面，提供了前述試劑盒在制備tcpS基因檢測產品中的用途。
[0022] 優選地，所述檢測產品用于檢測和篩選屬于腸炎沙門菌、雞白痢/傷寒沙門菌或者 都柏林沙門菌之任一的沙門菌。
[0023] 與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：
[0024] 本發明通過廣泛而深入的研究，首次發現tcpS基因僅存在于腸炎、雞白痢/傷寒和 都柏林這三種血清型沙門菌中，以特異性引物通過PCR技術驗證了tcpS基因在不同沙門菌 血清型及其它細菌中的分布。本發明的試劑盒能快速高通量鑒定腸炎、雞白痢/傷寒和都柏 林血清型沙門菌，可作為沙門菌傳統血清學分型的輔助方法，并為這三種特定血清型沙門 菌的監測與實驗室診斷提供了一種簡單快速、重復性好的新方法。
【附圖說明】
[0025] 圖1:為在NCBI全基因組數據庫中Blastn搜索tcpS基因；其中，"Description"為含 有tcpS基因的細菌名稱，"Ident"為tcpS基因核苷酸序列的相似性。
[0026] 圖2 :為PCR鑒定tcpS基因在沙門菌不同血清型中的分布圖片；其中，泳道Μ為： DL2000Marker;泳道 050041丄50336、51^5928、506004、9855和569為：化口5基因（882&口處有目 的條帶）；C50041和C50336為腸炎沙門菌，SL5928為都柏林沙門菌，S06004和9855為雞白痢 沙門菌，SG9為雞傷寒沙門菌，Y8為鼠傷寒沙門菌，Y7為德爾卑沙門菌，C500為豬霍亂沙門 菌，G2為倫敦沙門菌，T8為鴨沙門菌，T9為火雞沙門菌，T3為烏干達沙門菌，ZX為羅森沙門 菌。
[0027]圖3:為PCR鑒定tcpS基因在不同種細菌中的分布圖片；其中，泳道Μ為：DL2000 Marker;泳道C50041為:tcpS基因（882bp處有目的條帶）；C50041為腸炎沙門菌，1314和1352 為大腸桿菌，S19為布魯氏菌，E⑶e和XYSN為李斯特菌，11186和104為空腸彎曲菌，H37Rv為 結核分枝桿菌。
[0028] 圖4A:為PCR鑒定1~48株沙門菌中含tcpS的細菌，其中，泳道Μ為：DL2000Marker; 泳道1~48為豬場分離的沙門菌;可擴增出目的條帶的泳道即為腸炎沙門菌、雞白痢/傷寒 沙門菌或者都柏林沙門菌這三種血清型之一。
[0029] 圖4B:為PCR鑒定49~96株沙門菌中含tcpS的細菌，其中，泳道Μ為:DL2000Marker; 泳道49~96為豬場分離的沙門菌;可擴增出目的條帶的泳道即為腸炎沙門菌、雞白痢/傷寒 沙門菌或者都柏林沙門菌這三種血清型之一。
[0030] 圖4C:為PCR鑒定97~128株沙門菌中含tcpS的細菌，其中，泳道Μ為： DL2000Marker;泳道97~128為豬場分離的沙門菌;可擴增出目的條帶的泳道即為腸炎沙門 菌、雞白痢/傷寒沙門菌或者都柏林沙門菌這三種血清型之一。
[0031] 圖5:為PCR鑒定1~22株沙門菌中含tcpS的細菌，其中，泳道Μ為:DL2000Marker;泳 道1~2 2為雞場分離的沙門菌;可擴增出目的條帶的泳道即為腸炎沙門菌、雞白痢/傷寒沙 門菌或者都柏林沙門菌這三種血清型之一。
[0032] 圖6:為PCR鑒定1~11株沙門菌中含tcpS的細菌，其中，泳道Μ為:DL2000Marker;泳 道1~11為牛場分離的沙門菌;可擴增出目的條帶的泳道即為腸炎沙門菌、雞白痢/傷寒沙 門菌或者都柏林沙門菌這三種血清型之一。
【具體實施方式】
[0033] 在進一步描述本發明【具體實施方式】之前，應理解，本發明的保護范圍不局限于下 述特定的具體實施方案;還應當理解，本發明實施例中使用的術語是為了描述特定的具體 實施方案，而不是為了限制本發明的保護范圍。
[0034] 當實施例給出數值范圍時，應理解，除非本發明另有說明，每個數值范圍的兩個端 點以及兩個端點之間任何一個數值均可選用。除非另外定義，本發明中使用的所有技術和 科學術語與本技術領域技術人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設備、 材料外，根據本技術領域的技術人員對現有技術的掌握及本發明的記載，還可以使用與本 發明實施例中所述的方法、設備、材料相似或等同的現有技術的任何方法、設備和材料來實 現本發明。
[0035] 實施例1生物信息學方法鑒定tcpS基因的分布
[0036] 在 NCBI 中使用Blastn在線比對軟件（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast, cgi)在全基因組數據庫中搜索tcpS基因，搜索結果表明tcpS基因僅存在于腸炎沙門 菌、雞白痢/傷寒沙門菌和都柏林沙門菌中，且核苷酸序列相似性為100%，而沙門菌其它血 清型和其它物種均沒有這個基因（圖1)。
[0037]實施例2試劑盒的制備
[0038]引物設計與合成：以tcpS基因為模板，設計并分析引物，并根據基因組DNA序列情 況，從中選擇最佳檢測用引物對，其核苷酸序列如下表1所示：
[0039]表 1
[0041 ] 上述引物對可單獨包裝，也可以配成PCR檢測液。所述PCR檢測液中，上述引物對的 量采用本領域技術人員所知悉的常規用量即可。
[0042] 也就是說，本發明的試劑盒，可以是含有上述獨立包裝的引物對，也可以是含有配 置好的含有引物對的PCR檢測液。
[0043] 進一步地，所述試劑盒還可以含有無菌水(ddH2〇)、dNTP、PCR buffer、rTaq酶、樣 品基因組DNA提取試劑等等。
[0044] 實施例3試劑盒鑒定tcpS基因僅存在特定血清型沙門菌中
[0045] 采用實施例2所述試劑盒中的引物，以不同血清型沙門菌和其它細菌的基因組分 別為模板，PCR方法鑒定tcpS基因在不同細菌中的分布特點。
[0046] PCR 反應體系為（254〇:(1(1!12〇16.2541^(1犯13241^10\?0?1311打612.541^汀。口5-FlyL，tcpS-R lyL，模板2yL，rTaq酶0 · 25yL。
[0047] PCR程序為94°C 5min;94°C 45s，59°C 45s，72°C lmin，30個循環；72°C lOmin。
[0048] PCR產物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳，PCR電泳結果表明僅在以腸炎、雞白痢/傷寒和 都柏林沙門菌基因組為模板的泳道中有目的條帶（圖2、圖3)，膠回收后測序結果表明所有 的tcpS基因的核苷酸相似性均為100 %。表明以實施例2所述試劑盒中特定的tcpS擴增引 物，可以通過PCR方法快速鑒定未知細菌是否為這三種血清型沙門菌。
[0049] 實施例4試劑盒在豬場的應用
[0050] 采用實施例2中試劑盒，檢測128株沙門菌，可快速準確地檢測出腸炎沙門菌、雞白 痢/傷寒沙門菌和都柏林沙門菌這三種血清型。具體步驟如下：
[0051] 1)沙門菌的分離
[0052] 本試驗中樣品采自江蘇某豬場，樣品的采集、增菌及沙門菌的分離和生理生化鑒 定參考現有技術中已建立方法（Li Y，et al.Food Control，2016;Cai Y，et al.Int J Food Microbiol ,2016)，本次試驗共分離鑒定了 128株沙門菌。
[0053 ] 2) PCR方法檢測樣本中腸炎沙門菌、雞白痢/傷寒沙門菌和都柏林沙門菌
[0054]將128株沙門菌分別接種到LB液體培養基中，37°C 180rpm過夜培養，次日，以菌液 為模板擴增tcpS基因，PCR反應體系為（25yL):ddH2〇 16.25yL，dNTP 2yL，10XPCR buffer2 · 5yL，tcpS-F lyL，tcpS-R lyL，模板（菌液）2yL，rTaq酶0 · 25yL jCR程序為94°C 5min;94°C 45s，59°C 45s，72°C lmin，30個循環；72°C lOmiruPCR產物進行 1%瓊脂糖凝膠 電泳，可擴增出tcpS目的條帶的細菌則為腸炎沙門菌、雞白痢/傷寒沙門菌或者都柏林沙門 菌這三種血清型之一。結果顯示128株沙門菌中共有21株含tcpS基因，分別是3、4、5、13、14、 15、26、27、41、43、47、48、51、52、55、56、73、75、76、113和119(圖4)，這些沙門菌為腸炎沙門 菌、雞白痢/傷寒沙門菌或者都柏林沙門菌這三種血清型之一。
[0055] 3)沙門菌的傳統血清型鑒定
[0056]本次試驗分離的128株沙門菌的血清型鑒定參考現有技術中已建立方法(Li Y，et al .Food Control，2016;Cai Y，et al.Int J Food Microbiol ,2016)，血清型鑒定結果表 明128株沙門菌中共有21株腸炎沙門菌，分別為3、4、5、13、14、15、26、27、41、43、47、48、51、 52、55、56、73、75、76、113和119，？0?檢測結果與血清型鑒定結果完全一致。
[0057]在本實施例中，采用血清型鑒定的方法，將128株沙門菌中的屬于腸炎沙門菌、雞 白痢/傷寒沙門菌或者都柏林沙門菌這三種血清型之一的沙門菌篩選出來，需要至少2天的 時間。而采用本發明實施例2的檢測試劑盒，僅需3個小時，即可將128株沙門菌中的屬于腸 炎沙門菌、雞白痢/傷寒沙門菌或者都柏林沙門菌這三種血清型之一的沙門菌準確篩選出 來，且正確率為100%。
[0058]實施例5試劑盒在雞場的應用
[0059]采用實施例2中試劑盒，檢測22株沙門菌，可快速準確地檢測出腸炎沙門菌、雞白 痢/傷寒沙門菌和都柏林沙門菌這三種血清型。具體步驟如下：
[0060] 1)沙門菌的分離
[0061] 本試驗中樣品采自江蘇某雞場，樣品的采集、增菌及沙門菌的分離和生理生化鑒 定參考現有技術中已建立方法（Li Y，et al.Food Control，2016;Cai Y，et al.Int J Food Microbiol ,2016)，本次試驗共分離鑒定了22株沙門菌。
[0062 ] 2) PCR方法檢測樣本中腸炎沙門菌、雞白痢/傷寒沙門菌和都柏林沙門菌
[0063]將22株沙門菌分別接種到LB液體培養基中，37°C 180rpm過夜培養，次日，以菌液 為模板擴增tcpS基因，PCR反應體系為（25yL):ddH20 16.25yL，dNTP 2yL，10XPCR buffer2 · 5yL，tcpS-F lyL，tcpS-R lyL，模板（菌液）2yL，rTaq酶0 · 25yL jCR程序為94°C 5min;94°C 45s，59°C 45s，72°C lmin，30個循環；72°C lOmiruPCR產物進行 1%瓊脂糖凝膠 電泳，可擴增出tcpS目的條帶的細菌則為腸炎沙門菌、雞白痢/傷寒沙門菌或者都柏林沙門 菌這三種血清型之一。結果顯示22株沙門菌中共有12株含tcpS基因，分別是2、3、4、7、8、11、 12、14、16、17、18和20 (圖5 )，這些沙門菌為腸炎沙門菌、雞白痢/傷寒沙門菌或者都柏林沙 門菌這三種血清型之一。
[0064] 3)沙門菌的傳統血清型鑒定
[0065]本次試驗分離的22株沙門菌的血清型鑒定參考現有技術中已建立方法(Li Y，et al.Food Control，2016;Cai Y，et al.Int J Food Microbiol ,2016)，血清型鑒定結果表 明22株沙門菌中共有12株雞白痢沙門菌，分別為2、3、4、7、8、11、12、14、16、17、18和20，卩〇? 檢測結果與血清型鑒定結果完全一致。
[0066] 在本實施例中，采用血清型鑒定的方法，將22株沙門菌中的屬于腸炎沙門菌、雞白 痢/傷寒沙門菌或者都柏林沙門菌這三種血清型之一的沙門菌篩選出來，需要至少2天的時 間。而采用本發明實施例2的檢測試劑盒，僅需3個小時，即可將22株沙門菌中的屬于腸炎沙 門菌、雞白痢/傷寒沙門菌或者都柏林沙門菌這三種血清型之一的沙門菌準確篩選出來，且 正確率為100%。
[0067] 實施例6試劑盒在牛場的應用
[0068] 采用實施例2中試劑盒，檢測11株沙門菌，可快速準確地檢測出腸炎沙門菌、雞白 痢/傷寒沙門菌和都柏林沙門菌這三種血清型。具體步驟如下：
[0069] 1)沙門菌的分離
[0070]本試驗中樣品采自江蘇某牛場，樣品的采集、增菌及沙門菌的分離和生理生化鑒 定參考現有技術中已建立方法（Li Y，et al.Food Control，2016;Cai Y，et al.Int J Food Microbiol ,2016)，本次試驗共分離鑒定了11株沙門菌。
[0071 ] 2) PCR方法檢測樣本中腸炎沙門菌、雞白痢/傷寒沙門菌和都柏林沙門菌
[0072]將11株沙門菌分別接種到LB液體培養基中，37°C 180rpm過夜培養，次日，以菌液 為模板擴增tcpS基因，PCR反應體系為（25yL):ddH20 16.25yL，dNTP 2yL，10XPCR buffer 2.5yL，tcpS-F lyL，tcpS-R lyL，模板（菌液）2yL，rTaq酶0·25μΙ^ΡΟ?程序為94°C 5min;94 °C 45s，59°C 45s，72°C lmin，30個循環;72°C lOmiruPCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，可 擴增出tcpS目的條帶的細菌則為腸炎沙門菌、雞白痢/傷寒沙門菌或者都柏林沙門菌這三 種血清型之一。結果顯示11株沙門菌中僅8號樣品含tcpS基因（圖6)，該沙門菌為腸炎沙門 菌、雞白痢/傷寒沙門菌或者都柏林沙門菌這三種血清型之一。
[0073] 3)沙門菌的傳統血清型鑒定
[0074]本次試驗分離的11株沙門菌的血清型鑒定參考現有技術中已建立方法(Li Y，et al.Food Control，2016;Cai Y，et al.Int J Food Microbiol ,2016)，血清型鑒定結果表 明11株沙門菌中共有1株都柏林沙門菌，為8號分離菌，PCR檢測結果與血清型鑒定結果完全 一致。
[0075] 在本實施例中，采用血清型鑒定的方法，將11株沙門菌中的屬于腸炎沙門菌、雞白 痢/傷寒沙門菌或者都柏林沙門菌這三種血清型之一的沙門菌篩選出來，需要至少2天的時 間。而采用本發明實施例2的檢測試劑盒，僅需3個小時，即可將11株沙門菌中的屬于腸炎沙 門菌、雞白痢/傷寒沙門菌或者都柏林沙門菌這三種血清型之一的沙門菌準確篩選出來，且 正確率為100%。
[0076] 綜上所述，本發明試劑盒相較于傳統血清型鑒定方法的優勢：
[0077] 傳統血清型鑒定需購買特定的沙門菌血清型鑒定試劑盒，價格昂貴，步驟繁瑣，尤 其在大樣本中分離特定的血清型沙門菌(如腸炎沙門菌、雞白痢/傷寒沙門菌或者都柏林沙 門菌)時，需耗費大量時間（至少兩天），且工作量龐大，其結果是由肉眼進行判斷，因而可能 存在人為誤差;而本發明試劑盒的檢測方法操作簡單，成本非常低，且對細菌的存在形式沒 有要求(單菌落、凍存菌液或新鮮菌液均可），整個鑒定過程在三小時內即可完成(包含PCR 和瓊脂糖凝膠電泳），且準確率達到1〇〇%。
[0078] 因此，本發明的一種快速鑒定特定血清型沙門菌的PCR檢測試劑盒，有利于簡化沙 門菌血清型鑒定的傳統步驟，為在大量樣本中篩選腸炎、雞白痢/傷寒和都柏林血清型沙門 菌提供了一種快速鑒定的新方法。
[0079]上述實施例僅例示性說明本發明的原理及其功效，而非用于限制本發明。任何熟 悉此技術的人士皆可在不違背本發明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因 此，舉凡所屬技術領域中具有通常知識者在未脫離本發明所揭示的精神與技術思想下所完 成的一切等效修飾或改變，仍應由本發明的權利要求所涵蓋。
【主權項】
1. 一種快速鑒定特定血清型沙門菌的PCR檢測試劑盒，所述試劑盒中包括tcpS基因檢 測引物，所述tcpS基因檢測引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的正向引物和核苷酸 序列如SEQ ID NO. 2所示的反向引物。2. 根據權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還含有無菌水、dNTP、 PCR buffer、rTaq酶、樣品基因組DNA提取試劑中的一種或多種。3. 根據權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還含有陽性對照或陰性 對照中的一種或多種。4. 根據權利要求3所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述陽性對照為含有tcpS基因表達 的DNA樣本。5. 根據權利要求3所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述陰性對照可為無 tcpS基因表達 的DNA樣本。6. 如權利要求1~5任一權利要求所述的檢測試劑盒的使用方法，包括如下步驟： (1) 提取樣品基因組DNA; (2) 加樣:將樣品基因組DNA、陽性對照或陰性對照分別加入裝有PCR反應體系的PCR管 中，獲得對應的樣品反應管、陽性反應管或陰性反應管，所述PCR反應體系中含有權利要求1 中所述的tcpS基因檢測引物； (3) PCR反應:反應管置于PCR儀上，設置循環參數，進行PCR反應； (4) PCR反應結束后，分析結果。7. 根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法為非疾病診斷目的的方法。8. 根據權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，PCR反應的條件設置為：（a)94 1€511^11 ;(13)941€458;(。）591€458;((1)72。(：111^11，步驟(&)~（(1)循環30次，（6)72。(：1〇11^11。9. 如權利要求1~5任一權利要求所述的檢測試劑盒在制備tcpS基因檢測產品中的用 途。10. 根據權利要求9所述的用途，其特征在于，所述檢測產品用于檢測和篩選屬于腸炎 沙門菌、雞白痢/傷寒沙門菌或者都柏林沙門菌之任一的沙門菌。
【文檔編號】C12Q1/10GK105936935SQ201610459944
【公開日】2016年9月14日
【申請日】2016年6月22日
【發明人】焦新安, 潘志明, 熊丹, 宋麗, 焦揚, 孫林, 陳祥, 耿士忠, 黃金林, 殷月蘭
【申請人】揚州大學