玉米生長素應答因子ZmARF21基因及其應用
【專利摘要】本發明公開了玉米生長應答因子ZmARF21基因及其應用。本發明首先提供了從玉米兩個自交系Ye478和Wu312中克隆得到的ZmARF21基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本發明進一步將上述ZmARF21基因轉入到擬南芥中進行功能驗證，結果表明，超表達ZmARF21基因能調控轉基因擬南芥主根生長，其中，Ye478?ZmARF21基因能顯著提高擬南芥在低氮脅迫下根生長的能力。本發明分離的ZmARF21基因是調控根系發育的QTL，可提高植物抗低氮脅迫的能力，在培育抗低氮脅迫的轉基因植物新品種等方面有重要應用前景。
【專利說明】
玉米生長素應答因子ZmARF21基因及其應用
技術領域
[0001] 本發明涉及玉米生長素應答因子ZmARF21基因，尤其涉及玉米生長素應答因子 ZmARF21基因編碼序列，進一步涉及它們在低氮脅迫下提高植物根生長能力的應用，屬于生 長素應答因子基因及其應用領域。
【背景技術】
[0002] 氮是植物生長所必需的大量營養元素之一，是植物體內含量最豐富的礦質元素， 是生物體內多種有機分子的組成元素。植物對氮素的缺乏可導致植物生長緩慢，產量和品 質下降。玉米是高需氮作物，氮的吸收利用效率與玉米的產量直接相關。發達的根系是植物 高效吸收水分以及營養元素的重要生理基礎之一，因此，在影響玉米氮效率的諸多因素中， 根系性狀與玉米的吸氮能力密切相關。
[0003] 氮對于根系生長的影響可能與根中生長素有關。生長素是一種重要的促進側根 (LR)形成的植物激素，Aux/IAAs和ARFs作為介導生長素信號的轉錄因子家族，是側根(LR) 形成所必需的。生長素應答因子(Auxin response factor，ARF)，在生長素信號傳導途徑中 起著重要的作用，影響植物生長的多個過程，包括細胞伸長、頂端優勢、衰老以及調控植物 根系的生長發育等。正反向遺傳學分析已經證明側根的形成需要ARF基因，例如在擬南芥 中，ARF7和ARF19作為轉錄激活子對靶基因激活對側根的起始發育是必要的，miR160靶向導 入ARF10、ARF16和ARF17負調控側根的形成。因此，研究生長素應答因子家族基因是否在硝 酸鹽介導的調控根系生長途徑中發揮作用，并應用于調控植物氮脅迫下根的生長能力具有 重要的科學意義。
【發明內容】
[0004] 本發明目的之一是提供玉米生長素應答因子ZmARF21基因的編碼序列及其所編碼 的蛋白；
[0005] 本發明目的之二是提供含有上述ZmARF21基因的重組植物表達載體以及含有該表 達載體的宿主細胞。
[0006] 本發明目的之三是將所述ZmARF21基因應用于提高或改善植物在低氮脅迫下根生 長能力的轉基因植物新品種。
[0007] 本發明為達到以上目的，所采取的技術方案為：
[0008] 本發明通過設計相應引物，從兩個玉米自交系Ye478和Wu312中克隆ARF21基因 DNA 和RNA序列，序列進行比對結果顯示：ZmARF21在兩個玉米自交系中存在插入缺失變異，與 B73(其核苷酸序列為SEQ ID如.3所示）相比41^21基因序列在￥6478和111312中存在5個 SNP位點和2段插入缺失突變；與Ye478-ZmARF21(其核苷酸序列為SEQ ID N0.1所示）相比， Wu312-ZmARF21(其核苷酸序列為SEQ ID腸.2所示）在762-773處缺失12&口堿基序列； Ye478-ZmARF21 相對于 Wu312-ZmARF21 在 1916-1921 處缺失 6bp 堿基序列。進一步對 ZmARF21 基因在兩個玉米自交系中進行不同濃度的NOf處理，結果顯示：在根系發達的Ye478根中， ZmARF21被0.04mmol/L、0.4mmol/L低氮濃度顯著抑制，但在Wu312中對低氮無應答。
[0009] 本發明進一步提高了所述本發明玉米生長素應答因子ZmARF21基因所編碼的蛋 白，其氨基酸序列為SEQ ID N0.4或SEQ ID N0.5所示。
[0010] 本發明還提供了含有所述玉米生長素應答因子ZmARF21基因的重組植物表達載體 以及含有該重組植物表達載體的宿主細胞。
[0011]本發明為研究ZmARF21基因是否在玉米根系應答到硝酸鹽途徑中發揮作用，以野 生型為對照，分析在正常生長條件下轉Wu312-ZmARF21與Ye478-ZmARF21基因擬南芥根系指 標差異顯示:轉Ye478-ZmARF21擬南芥主根長與野生型相比存在極顯著差異(卩〈0.01)，轉 Wu312-ZmARF21擬南芥與野生型相比存在顯著差異(P〈0.05)，推測超表達ZmARF21基因調控 轉基因擬南芥主根生長，來自不同自交系的ZmARF21基因存在功能上的差異；另外，分析生 長兩周后的轉ZmARF21基因擬南芥在不同濃度勵 3_處理下主根長差異顯示:Wu312-ZmARF21 轉基因擬南芥在不同氮濃度下主根長變化與野生型一致，而Ye478-ZmARF21基因提高轉基 因擬南芥在低氮脅迫下根生長能力。
[0012]鑒于來自兩個不同于米自交系中ZmARF21基因存在功能上的差異，利用分子遺傳 學方法進一步分析ZmARF21基因是否是與根系性狀相關的QTL。首先確定了 ZmARF21落在6號 染色體的與玉米根系(包括節根、側根和主根)生長發育相關的umc100 6標記區域。進一步對 ZmARF21基因是否是調控根系發育的QTL進行鑒定，結果顯示ZmARF21在Ye478中是一個與根 系性狀、氣應答相關的QTL。
[0013]由此，本發明提供了一種低氮脅迫下提高植物根生長能力的方法，包括:將本發明 ZmARF21基因引入到目標植物或植物細胞中，能夠有效提高低氮脅迫下目標植物根生長能 力。
[0014] 本發明還提供了一種培育低氮脅迫下提高根生長能力的轉基因植物新品種的方 法，其特征在于，包括：（1)構建含有所述ZmARF21基因的重組植物表達載體；（2)將所構建的 重組植物表達載體轉化到植物組織或植物細胞中；（3)培育篩選得到低氮脅迫下根生長能 力提尚的轉基因植物新品種。
[0015] 本發明技術方案與現有技術相比具有以下有益效果：
[0016] 本發明克隆的Ye478-ZmARF21和Wu312-ZmARF21基因可調控植物根生長能力，其中 Ye478-ZmARF21基因可顯著提高轉基因擬南芥在低氮脅迫下根生長能力，對于提高低氮脅 迫下植物主根生長以及培育在低氮脅迫下根生長能力提高的轉基因植物新品種有重要意 義。
[0017] 本發明所涉及的術語定義
[0018] 除非另外定義，否則本文所用的所有技術及科學術語都具有與本發明所屬領域的 普通技術人員通常所了解相同的含義。
[0019] 術語"生長素應答因子"意指調節生長素響應基因表達的一類轉錄因子。
[0020] 術語"重組宿主細胞"或"宿主細胞"意指包括外源性多核苷酸的細胞，而不管使用 何種方法進行插入以產生重組宿主細胞，例如直接攝取、轉導、f配對或所屬領域中已知的 其他方法。外源性多核苷酸可保持為例如質粒的非整合載體或者可整合入宿主基因組中。
[0021] 術語"多核苷酸"或"核苷酸"意指單股或雙股形式的脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖核 苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否則所述術語涵蓋含有天然核苷酸 的已知類似物的核酸，所述類似物具有類似于參考核酸的結合特性并以類似于天然產生的 核苷酸的方式進行代謝。除非另外特定限制，否則所述術語也意指寡核苷酸類似物，其包括 PNA(肽核酸）、在反義技術中所用的DNA類似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等）。除非另外指 定，否則特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變異體(包括(但不限于)簡并密碼子取 代)和互補序列以及明確指定的序列。特定而言，可通過產生其中一個或一個以上所選(或 所有）密碼子的第3位經混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來實現簡并密碼子取代 (Batzer等人，Nucleic Acid Res · 19:5081 (1991) ;Ohtsuka等人，J.Biol ·Chem. 260: 2605-2608( 1985);和Cassol等人，（1992) ;Rossolini等人，Mol Cell.Probes8:91-98( 1994))。
[0022] 術語"表達"指外源基因在宿主細胞中的轉錄和/或翻譯。
[0023] 術語"轉化"指將外源基因引入到宿主細胞中的方法。
[0024] 術語"外源基因"指對特定的宿主細胞而言，該基因序列是屬于外來的來源，或是 來自相同的來源但其原始序列進行了修飾或改造。
【附圖說明】
[0025] 圖 1 B73、Ye478-ZmARF21 和 Wu312-ZmARF21 基因序列比對結果；
[0026]圖2不同N(V離子濃度下ZmARFs家族基因在兩個玉米自交系根中的表達；
[0027] 圖3不同時間轉Ye478-ZmARF21和Wu312-ZmARF21擬南芥主根生長變化；
[0028] 圖4不同氮處理下轉Ye478-ZmARF21和Wu312-ZmARF21擬南芥主根生長變化；
[0029] 圖5低氮處理下轉基因 Ye478-ZmARF21擬南芥主根生長變化；
[0030] 圖6 Ye478XWu312RIL群體構建分子標記圖譜；
[0031] 圖7 Ye478XWu312RIL群體中ZmARF21插入缺失帶型。
【具體實施方式】
[0032]下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但是應理解所述實施例僅是范例性的，不對本發明的范圍構成任何限制。本領域 技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和 形式進行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發明的保護范圍。
[0033]試驗例lZmARF21的分離及鑒定 [0034] 1、試驗方法
[0035] l.lZmARF21 的分離鑒定
[0036] 設計相應引物，從兩個玉米自交系Ye478和Wu312中克隆ARF21基因 DNA和RNA序列， 進行序列對比分析。引物序列如下：
[0037] 正向：5，ATGATTACTTTCGTGGACTCGGC 3，
[0038] 反向：5，CTACCTCGCGTCCGTTTGTATG 3，
[0039] 1 · 2ZmARF21基因表達分析
[0040] 用不同濃度的 N〇3-(0.04mmol/L、0.4mmol/L、4mmol/L、10mmol/L)處理玉米自交系 Ye478和Wu312,測定不同N(V離子濃度下ZmARFs家族基因在兩個玉米自交系根中的表達情 況。
[0041 ] 2、試驗結果
[0042] 2.1ZmARF21 的分離鑒定
[0043] 基因測序結果如圖1所示，從圖中可以看出：ZmARF21在兩個玉米自交系中存在插 入缺失變異，ARF21基因序列在Ye478和Wu312中存在5個SNP位點和2段插入缺失突變；與 Ye478-ZmARF21 相比，Wu312-ZmARF21 在 762-773 處缺失 12bp 堿基序列；Ye478-ZmARF21 相對 于Wu312-ZmARF21在1916-1921處缺失6bp堿基序列。
[0044] 2.2ZmARF21基因表達分析
[0045] ZmARF21基因在兩個玉米自交系中對不同N〇3_處理應答如圖2所示，結果表明 ZmARF21基因在兩個玉米自交系中對不同N〇3_處理應答顯著不同。在根系發達的Ye478根中， ZmARF21被0.04mmol/L、0.4mmol/L低氮濃度顯著抑制，但在Wu312中對低氮無應答。
[0046] 試驗例2ZmARF21基因的功能鑒定試驗
[0047]為研究ZmARF21基因是否在玉米根系應答到硝酸鹽途徑中發揮作用，首先通過轉 基因擬南芥的分析鑒定其功能。
[0048] (1)轉基因擬南芥陽性株的篩選
[0049] 提取經過測序的ZmARF21-pCMABIA1304載體的質粒，液氮凍融法轉入農桿菌 GV3101中。調整農桿菌菌液濃度0D至0.8，浸花法轉化擬南芥，收獲T1種子后，在含有潮霉素 ZmARF21的1/2MS培養基上篩選陽性植株。轉基因陽性植株含有抗生素基因，能夠在含有抗 生素的培養基上長出真葉和主根后移栽到土壤中收獲種子。
[0050] (2)超表達ZmARF21基因調控轉基因擬南芥根生長
[00511以純合T2代轉基因擬南芥為材料，分析來自Ye478和Wu312這兩個玉米自交系中的 ZmARF21基因在調控根系生長中的功能。將T2代轉基因種子與野生型擬南芥(Arabidopsis thaliana Columbia)種子同時種于1/2MS培養基中培養，分別進行不同的處理，分析轉基因 擬南芥在正常生長條件下、在不同濃度處理下以及在低氮條件下根系指標的變化。 [0052] (3)超表達ZmARF21基因調控轉基因擬南芥主根生長
[0053] 以野生型為對照，分析在正常生長條件下轉Wu312-ZmARF21與Ye478-ZmARF21基因 擬南芥根系指標差異。在測定轉基因和野生型擬南芥的總根長、主根長、側根數、平均側根 長等指標顯示，〇E_ZmARF21轉基因擬南芥的主根長與野生型相比存在差異。同一平板放置5 株轉基因實驗株和3株野生對照株，在分別培養7(1、10(1、13(1、16(1、20(1、25(1時取樣測定結果 如圖3所示表明：轉Ye478-ZmARF21擬南芥主根長與野生型相比存在極顯著差異(P〈0.01)， 轉Wu312-ZmARF21擬南芥與野生型相比存在顯著差異(P〈0.05)，推測ZmARF21在擬南芥中參 與調控主根生長，并且來自不同自交系的ZmARF21基因存在功能上的差異。
[0054] (4)轉基因擬南芥耐低氮脅迫處理
[0055]以野生型為對照，分析生長兩周后的轉ZmARF21基因擬南芥在不同濃度NOf處理下 主根長差異。轉Wu312-ZmARF21與Ye478-ZmARF21基因和野生型擬南芥分別在0.04mM， 0.4mM，4mM和10mM N(V的平板中生長一周后主根長變化，結果見圖4,從圖中可以看出：與正 常氮(4mM)相比，低氮(0.04mM，0.4mM)和高氮(10mM)均抑制野生型擬南芥主根生長，同樣也 抑制了轉Wu312-ZmARF21擬南芥主根長生長。但在低氮條件下，轉Ye478-ZmARF21基因擬南 芥主根長顯著增加，高氮條件下顯著降低，指示Ye478-ZmARF21基因在轉基因擬南芥在氮脅 迫條件下調控主根生長。
[0056]進一步分析轉Ye478-ZmARF21基因擬南芥在低氮(0.04mM)條件下主根長的變化， 結果見圖5,從圖中可以看出：隨著培養時間的延長，雖然野生型和轉基因擬南芥主根長均 在增加，但是野生型擬南芥在低氮條件下培養10天后主根長有顯著增加，隨后隨著時間的 延長主根生長逐漸緩慢;轉基因擬南芥在低氮條件下生長了 16d-25d之后，主根長仍有顯著 變化，指示Ye478-ZmARF21基因提高轉基因擬南芥在低氮脅迫下根生長能力。
[0057] 試驗例3ZmARF21基因的定位試驗
[0058] 利用Ye478和Wu312直接的序列差異設計分子標記(Marker)，把這些Marker整合到 基于Ye478XWu312RIL群體構建分子標記圖譜，結果如圖6所示，確定ZmARF21落在6號染色 體的umc100 6標記區域，而此標記與玉米根系(包括節根、側根和主根)生長發育相關。
[0059]試驗例4鑒定ZmARF21基因是調控根系發育的QTL試驗 [0060] 1 · lYe478 XWu312RIL群體中ZmARF21差異片段多態性
[0061 ] 玉米Ye478和Wu312的ZmARF21序列在762-775位置上有12bp大小的差異，根據此差 異序列設計引物，擴增其在Ye478XWu312RIL群體中差異片段多態性。結果如圖7所示，擴增 特異性目的片段(大小約200bp)，獲得A、B、AB、N/A四種條帶，表明在Ye478 X Wu312的重組自 交系群體中存在A(Ye478)、B(Wu312)和AB(Ye478和Wu312)三種帶型。統計四種條帶數目分 別為:A 64，B 80，AB 37，N/A 27,在Ye478XWu312208個群體樣本中A帶型占比30·8%、Β帶 型占比38.5%、ΑΒ帶型占比17.8%。
[0062] 1.2基于ZmARF21基因與Ye478XWu312RIL群體表型關聯分析
[0063] ZmARF21在Ye478XWu312的重組自交系群體(RIL群體樣本208)中存在A(Ye478)、B (Wu312)和AB(Ye478和Wu312)三種帶型。分析A、B和AB三種帶型與兩個氮濃度下RIL群體根 系表型數據(見表1)顯示:A、B和AB三種帶型對應的種子根數、主胚根長、種子總根長、節根 數和側根數5個根系表型數據在兩個氮濃度下沒有顯著差異，表明這些序列差異的存在沒 有顯著影響以上5種根部表型的變化。但節根長數據顯示，三種帶型所對應的節根長有一致 性的變化規律，即在4.0mM N〇3^下的節根長度均顯著短于0.04mM N〇3^處理的節根長度，且 三年的數據均有一致性規律，表明這些差異序列的存在顯著影響玉米在不同氮濃度下節根 長。
[0064] 表1玉米Ye478XWu312RIL群體根系表型與ZmARF21基因帶型統計
[0067] 注：同年不同處理下表型存在顯著差異用不同字母標注(P〈0.05).
[0068] 表2玉米Ye478XWu312RIL群體根系表型與ZmARF21基因帶型統計
[0069]
[0070]關聯分析表明，ZmARF21基因三種差異帶型對節根長的貢獻率不同，分年度分析見 表2，結果顯示，A型對節根長的貢獻率分別為3.15 %、2.87 %和3.21 %，B型對節根長的貢獻 率分別為0.45%、0.76%和0.53%，AB型對節根長的貢獻率分別為1 .15%、1.28%和 1.07 %。比較分析，A型對節根長的貢獻率最大，B型對節根長的貢獻率很低，AB型對節根長 的貢獻率介于兩者之間，而A型是根系發達的Ye478玉米獨有基因帶型有關，B為Wu312玉米 (根系不發達)獨有基因帶型。基于這些實驗結果，推測ZmARF21基因與玉米根系表型存在相 關性。
【主權項】
1. 玉米生長素應答因子ZmARF21基因，其特征在于:其核苷酸序列為SEQ ID N0.1或SEQ ID NO.2所示。2. 權利要求1所述玉米生長素應答因子ZmARF21基因所編碼的蛋白，其特征在于：其氨 基酸序列分別為SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。3. 含有權利要求1所述玉米生長素應答因子ZmARF21基因的重組表達載體。4. 根據權利要求3所述的重組表達載體，其特征在于:所述重組表達載體是重組植物表 達載體。5. 含有權利要求3或4所述重組表達載體的重組宿主細胞。6. 權利要求1所述的玉米生長素應答因子ZmARF21基因或權利要求2所述的蛋白在調控 植物根系發育中的應用。7. 權利要求1所述的玉米生長素應答因子ZmARF21基因或權利要求2所述的蛋白在提高 抗低氮脅迫能力中的應用。8. 按照權利要求7所述的應用，其特征在于:所述的抗低氮脅迫是在低氮脅迫下促進主 根生長。9. 按照權利要求6或7所述的應用，其特征在于，包括：（1)構建含有權利要求1所述玉米 生長素應答因子ZmARF21基因的重組植物表達載體；（2)將所構建的重組植物表達載體轉化 到植物組織或植物細胞中；（3)培育篩選得到低氮脅迫下根生長能力提高的轉基因植物。10. -種培育低氮脅迫下根生長能力提高的轉基因植物新品種的方法，其特征在于，包 括：（1)構建含有權利要求1所述玉米生長素應答因子ZmARF21基因的重組植物表達載體； (2)將所構建的重組植物表達載體轉化到植物組織或植物細胞中；（3)培育篩選得到低氮脅 迫下根生長能力提尚的轉基因植物新品種。
【文檔編號】A01H5/00GK105936908SQ201610461477
【公開日】2016年9月14日
【申請日】2016年6月22日
【發明人】王俊英, 陳范駿
【申請人】中國農業科學院生物技術研究所