一種提取落葉松總rna的方法
【專利摘要】本發明屬于植物生物技術領域，具體涉及落葉松高質量總RNA的快速提取方法，配制l RNA提取液；往RNase-free離心管中加入的RNA提取液，同時加入PVP、M/ml DTT、β-巰基乙醇和蛋白酶K；取植物材料于液氮中研磨成粉末，震蕩混勻；孵育；加入氯仿/異戊醇，渦旋振蕩；加入無水乙醇，冰上放置以上；再用75％酒精清洗一次再次離心5min，加入TE；去除總RNA中的DNA；分別用等體積的酚/氯仿/異戊醇和氯仿/異戊醇抽提；抽提后的溶液加入1/10體積NaAc和2倍體積無水乙醇，沉淀用75％乙醇清洗；吸出剩余乙醇；加入適量RNase-free水溶解，得到落葉松總RNA；本發明方法具有較大的實際應用價值。
【專利說明】
一種提取落葉松總RNA的方法
技術領域
[0001] 本發明屬于植物生物技術領域，具體涉及從落葉松組織材料中提取總RNA的方 法，特別涉及一種利用新的提取液配方快速、簡便地從落葉松的葉、根、莖、花、種子中提取 總RNA的新方法。 技術背景
[0002] RNA提取是現代分子生物學試驗中非常重要的一個環節，RNA質量的好壞直接影 響到后續試驗的成敗，如RT-PCR，cDNA文庫構建等。為了獲得高質量的RNA，很多學者做了 大量研究，并不斷有獲得高質量RNA方法的報道，如：異硫氰酸胍法，熱酚法，CTAB-PVP法 等。但是，不同植物所含有糖份、酚類和次生代謝物均不同，因此，針對不同植物RNA提取， 要采用不同提取液配方，才能有效的提取高質量RNA。落葉松富含多糖、多酚和次生物質，其 RNA提取十分困難，尤其是多年生材料。因此，找到一種十分適合落葉松RNA提取的方法，其 特點是所得RNA質量高，成本低且操作簡便具有重要意義。
【發明內容】
[0003] 本發明所要解決的技術問題是針對上述現有技術的不足，提供落葉松高質量總 RNA的快速提取方法。
[0004] 本發明的目的是通過以下技術方案來實現的。
[0005] -種落葉松總RNA提取方法，落葉松為落葉松根、莖、葉、花或種子中的任何一種 原料，其步驟為：
[0006] (1)配制lOOmlRNA提取液：其中包含：于無 RNA酶的水溶液中含終濃度lOOmM Tris-HCl(pH = 8.0)、2% (w/v)十六烷基三甲基溴化銨（CTAB)、30mM EDTA、2M NaCl、 0. 3% -0. 8% (w/v)亞精胺，磁力攪拌器上攪勻，高壓滅菌后待用；
[0007] (2)在離心管中加入RNA提取液500 μ 1，同時加入終濃度2% (w/v)PVP (聚乙烯吡 咯烷酮）、10 μ 1的200mM/ml DTT (二硫蘇糖醇）、終濃度2 % (v/v) β -巰基乙醇和20mg/ml 蛋白酶K至終濃度1. 8-2. 2mg/ml，將離心管放入恒溫孵育器中以41-43°C孵育lOmin ;
[0008] (3)取200-300mg落葉松原料，液氮研磨至粉末狀；
[0009] (4)將研磨好的落葉松原料加入上述孵育的離心管中，振蕩器上2500-3000rpm/ min 渦旋振蕩 25-30s 后，42°C孵育 80-100min ;
[0010] (5)于離心管中加入步驟（4)得到的溶液的1倍體積氯仿/異戊醇（體積比為 24:1)，振蕩器上 2500-3000rpm/min 渦旋振蕩 20-30s，4°C，13000rpm 離心 15-20min ;
[0011] (6)轉移離心管中上層水相至第二支離心管中，加入轉移水相等體積的氯仿/異 戊醇（體積比為24:1)，禍旋振蕩，4°C，13000rpm離心15min ;
[0012] (7)轉移第二支離心管中上層水相至第三支離心管中，加入轉移水相等體積4M LiCl和轉移水相1/2體積的無水乙醇，冰上放置2. 5-3h以上；
[0013] (8)禍旋振蕩，4°C，13000rpm離心15_20min，棄去上清，得到固態總RNA ;
[0014] (9)將固態總RNA添加800 μ 1 2M LiCl清洗，渦旋振蕩，4°C，13000rpm離心5min 后還棄上層清液；再用5001111毫升體積濃度75%酒精清洗一次，4°(：，13000印111離心51^11;
[0015] (10)棄去上清，加入30 μ 1 0. 1 X TE緩沖液；得到含有DNA的總RNA ;
[0016] (11)去除總RNA中的DNA，具體如下：
[0017]
[0018] 以上混合溶液在37 °C水浴30min降解DNA ;
[0019] (12)分別用等體積的酚/氯仿/異戊醇和氯仿/異戊醇抽提：轉移上層水相至 另一支新離心管中，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇（三者體積比為25:24:1)，渦旋振蕩， 4°C，13000rpm離心15min ;轉移上層水相至另一支新離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇 (體積比為24:1)，禍旋振蕩，4°C，13000rpm離心15min ;
[0020] (13)于抽提后的水相溶液中加入其1/10體積的3M NaAc和2倍體積無水乙醇，混 均后在一20°C 下沉淀 30min，4°C，13000rpm 離心 20min ;
[0021 ] (14)去除上清液，沉淀用體積濃度75%乙醇清洗2次；
[0022] (15)去除上清液，沉淀在空氣中干燥5min，加入RNase-free水溶解后得到的所述 總 RNA〇
[0023] 步驟（7)中，無水乙醇沉淀選擇在_20°C冰箱中靜置半小時。
[0024] 本發明技術方案與現有技術相比較，具有以下有益效果：
[0025] (1)采用蛋白酶K，并且在42°C孵育90min，有效的去除落葉松組織中的RNase。另 外，使用酚/氯仿抽提會對poly (A) +-RNA有損害，由于蛋白酶K的使用，省略了酚/氯仿抽 提步驟，有利于獲得高質量poly㈧+_RNA。
[0026] (2) β -巰基乙醇可以去除多糖多酚類物質因氧化而對RNA分離產生的干擾和破 壞作用，與PVP結合的多糖多酚類物質，可以直接通過離心去除掉，或在氯仿/異戊醇抽提 時除去。
[0027] (3)無 RNase的DNase I處理RNA溶液，可以有效去除RNA中的基因組DNA的污 染，得到高純度RNA。
[0028] 本發明有效的克服了多糖多酚類次生代謝物質含量高對落葉松總RNA提取所帶 來的不利影響，能從其中提取得到高質量的總RNA，得到的總RNA純度高，有效去除了蛋白、 鹽類以及多糖和多酚類次生代謝物質的污染。因此，本發明方法具有較大的實際應用價值。
【附圖說明】
[0029] 圖1為落葉松不同組織中總RNA瓊脂糖電泳圖；
[0030] 圖中，上樣量為3 μ 1 ;1泳道為嫩莖；2泳道為老根；3泳道為韌皮部；4泳道為老 莖；5、6泳道為嫩葉。
【具體實施方式】
[0031] 下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行 實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程。
[0032] 實施例1
[0033] 本實施例為落葉松嫩莖總RNA提取方法，包括以下步驟：
[0034] (1)配制lOOmlRNA提取液：其中包含：于無 RNA酶的水溶液中含終濃度lOOmM Tris-HCl(pH 8·0)、2% (w/v)CTAB、30mM EDTA、2M NaCl、0.5% (w/v)亞精胺，磁力攪拌器上 攪勻，高壓滅菌；
[0035] (2)在1. 5ml離心管中加入提取緩沖液500 μ 1，同時加入終濃度2% PVP、10 μ 1 的200mM/ml DTT、終濃度2% (v/v) β -巰基乙醇和20mg/ml蛋白酶Κ至終濃度2. Omg/ml， 42°C孵育 lOmin ;
[0036] (3)取200mg材料，液氮中充分研磨至粉末狀；
[0037] (4)將研磨好的材料加入上述孵育的離心管中，振蕩器上2500-3000rpm/min渦旋 振蕩 25-30s 后，42°C孵育 90min ;
[0038] (5)于離心管中加入步驟（4)得到的溶液的1倍體積氯仿/異戊醇（體積比為 24:1)，渦旋振蕩，4°C，2500-3000r pm 離心 15min ;
[0039] (6)轉移離心管中上層水相至另一支離心管中，加入轉移水相等體積的氯仿/異 戊醇（體積比為24:1)，禍旋振蕩，4°C，13000rpm離心15min ;
[0040] (7)轉移第二支離心管中上層水相至另一支離心管中，加入轉移水相等體積4M LiCl和轉移水相1/2體積的無水乙醇，冰上放置3h以上，其中的無水乙醇在-20°C冰箱中 靜置半小時后使用；
[0041 ] (8) 4°C，13000rpm 離心 15min，棄去上清；
[0042] (9)將固態總RNA添加800 μ 1 2M LiCl清洗，渦旋振蕩，4°C，13000rpm離心5min 后還棄上層清液；再用5001111毫升體積濃度75%酒精清洗一次，4°(：，13000印111離心51^11;
[0043] 800 μ1 2M LiCl 清洗，4°C，13000rpm 離心 5min ;再用 75%酒精清洗一次，4°(：， 13000rpm 離心 5min ;
[0044] (10)棄去上清，加入 30μ1 0· 1XTE ;
[0045] (11)去除總RNA中的DNA。具體如下：
[0046]
[0047] 以上混合溶液在37 °C水浴30min降解DNA ;
[0048] (12)分別用等體積的酚/氯仿/異戊醇和氯仿/異戊醇抽提，轉移上層水相至另 一支新離心管中，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇（三者體積比為25:24:1)，渦旋振蕩， 4°C，13000rpm離心15min ;轉移上層水相至另一支新離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇 (體積比為24:1)，禍旋振蕩，4°C，13000rpm離心15min ;
[0049] (13)于抽提后的水相溶液中加入其1/10體積的3M NaAc和2倍體積無水乙醇，混 均后一20°C 沉淀 30min，4°C，13000rpm 離心 20min ;
[0050] (14)去除上清液，沉淀用體積濃度75%乙醇清洗2次；
[0051] (15)去除上清液，沉淀在空氣中干燥5min，加入適量（20-50 μ l)RNase_free (無 RNA酶）水溶解后得到的所述總RNA。
[0052] 以上提取方法中所用到的試劑和實驗器材均不含核酸酶，提取獲得的RNA電泳結 果如圖1所示。
[0053] 實施例2
[0054] 本實施例為落葉松老根的總RNA提取方法，取落葉松老根200mg，剪碎，其它步驟 同實施例1，提取獲得的總RNA電泳結果如圖1所示。
[0055] 實施例3
[0056] 本實施例為落葉松韌皮部的總RNA提取方法，取落葉松韌皮部200mg，其它步驟同 實施例1，提取獲得的總RNA電泳結果如圖1所示。
[0057] 實施例4
[0058] 本實施例為落葉松老莖的總RNA提取方法，取落葉松老莖200mg，剪碎，其它步驟 同實施例1，提取獲得的總RNA電泳結果如圖1所示。
[0059] 實施例5
[0060] 本實施例為落葉松嫩葉的總RNA提取方法，取落葉松嫩葉200mg，剪碎，其它步驟 同實施例1，重復2次，提取獲得的總RNA電泳結果如圖1所示。
[0061 ] 通過核酸定量儀檢測實施例1~5提取的落葉松總RNA的A260/280值和RNA提 取率，結果如下表1所示：
[0062] 表1 :落葉松總RNA的A260/280值和提取率的測定結果
[0063]
[0064] 檢測結果表明，所有樣品的D2M/D2S。值均在1. 8~2. 1 (表1)，表明總RNA樣品含 酚類物質和蛋白質等雜質少，該方法所提取的RNA樣品純度均較好。
[0065] 上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種落葉松總RNA提取方法，其特征在于：將經過液氮研磨后的落葉松原料加入經 解育后的RNA提取液，經過解育、抽提、沉淀后得到含有DNA的總RNA，再經過DNA去除，抽 提，沉淀和溶解后，得到高純度總RNA。2. 根據權利要求1所述的落葉松總RNA提取方法，其特征在于：具體操作步驟為： (1) 配制RNA提取液：于無 RNA酶的水溶液中含終濃度lOOmM Tris-肥1 (抑=8. 0)、2% (w/v)十六烷基Ξ甲基漠化錠（CTAB)、30mM邸TA、2M化C1、0. 3% -0. 8% (w/v)亞精胺，磁 力攬拌器上攬勻，高壓滅菌后待用； (2) 在離屯、管中加入RNA提取液500 μ1，同時加入終濃度2% (w/v)PVP(聚乙締化咯燒 酬）、10 μ 1的200mM/ml DTT (二硫蘇糖醇）、終濃度2 % (v/v) 0 -琉基乙醇和20mg/ml蛋 白酶K至終濃度1. 8-2. 2mg/ml，將離屯、管放入恒溫解育器中W 41-43Γ解育lOmin ; (3) 取200-300mg落葉松原料，液氮研磨至粉末狀； (4) 將研磨好的落葉松原料加入上述解育的離屯、管中，振蕩器上2500-300化pm/min滿 旋振蕩 25-30S 后，42°C解育 80-100min ; (5) 于離屯、管中加入步驟（4)得到的溶液的1倍體積氯仿/異戊醇（體積比為24:1)， 振蕩器上 2500-3000巧m/min 滿旋振蕩 20-30s，4°C，13000巧m 離屯、15-20min ; (6) 轉移離屯、管中上層水相至第二支離屯、管中，加入轉移水相等體積的氯仿/異戊醇 (體積比為24:1)，滿旋振蕩，4°C，13000巧m離屯、15min ; (7) 轉移第二支離屯、管中上層水相至第Ξ支離屯、管中，加入轉移水相等體積4MLiCl和 轉移水相1/2體積的無水乙醇，冰上放置2. 5-化W上； (8) 滿旋振蕩，4°C，13000巧m離屯、15-20min，棄去上清，得到固態總RNA ; (9) 將固態總RNA添加800 μ 1 2M LiCl清洗，滿旋振蕩，4°C，13000巧m離屯、5min后還 棄上層清液；再用500ml毫升體積濃度75%酒精清洗一次，4°C，13000巧m離屯、5min ; (10) 棄去上清，加入30 μ 1 0. 1 X TE緩沖液；得到含有DM的總RNA ; (11) 去除總RNA中的DNA，具體如下： RNA 洛液 250μ1 Dnasc. I.(民Nase I'rcc、 2.5μ1 EiulTcr 35μ1 RNasin Ι.5μ! DEPC 水 61 μ! Total 330μ! W上混合溶液在37°C水浴30min降解DNA ; (12) 分別用等體積的酪/氯仿/異戊醇和氯仿/異戊醇抽提：轉移上層水相至另一 支新離屯、管中，加入等體積的酪/氯仿/異戊醇（Ξ者體積比為25:24:1)，滿旋振蕩，4°C， 13000rpm離屯、15min ;轉移上層水相至另一支新離屯、管中，加入等體積的氯仿/異戊醇（體 積比為24:1)，滿旋振蕩，4°C，13000巧m離屯、15min ; (13) 于抽提后的水相溶液中加入其1/10體積的3M NaAc和2倍體積無水乙醇，混均后 在一20°C 下沉淀 30min，4°C，13000巧m 離屯、20min ; (14) 去除上清液，沉淀用體積濃度75%乙醇清洗2次； (15) 去除上清液，沉淀在空氣中干燥5min，加入RNase-化ee水溶解后得到的所述總 RNAo3. 根據權利要求2所述的落葉松總RNA提取方法，其特征在于：步驟（7)中，無水乙醇 在-20°C冰箱中靜置半小時后使用。4. 根據權利要求1所述的落葉松總RNA提取方法，其特征在于： 所述落葉松原料為落葉松根、莖、葉、花或種子中的任何一種。
【文檔編號】C12N15/10GK105936902SQ201511023641
【公開日】2016年9月14日
【申請日】2015年12月31日
【發明人】馮健, 張守攻, 齊力旺, 孫曉梅
【申請人】遼寧省林業科學研究院