一種茶樹紫芽相關蛋白CsGST及其編碼基因和應用
【專利摘要】一種茶樹紫芽相關蛋白CsGST及其編碼基因和應用，屬于植物基因工程技術領域。該茶樹紫芽相關蛋白CsGST的氨基酸序列為：1）SEQ ID No.2 所示的氨基酸序列；或 2）SEQ ID No.2 所示的氨基酸序列經替換、缺失和/或添加一個或幾個氨基酸殘基形成的具有同等功能的氨基酸序列；編碼該蛋白的基因核苷酸序列為：1）SEQ ID No.1 所示的核苷酸；或2）SEQ ID No.1 所示的核苷酸序列經取代一個或幾個核苷酸，得到編碼 CsGST的核苷酸序列。本發明驗證了CsGST基因具有提高植物花青素含量的功能，為定向培育紫芽茶樹品種提供候選基因。
【專利說明】
一種茶樹紫芽相關蛋白CsGST及其編碼基因和應用
技術領域
[0001 ]本發明屬于植物基因工程技術領域，具體涉及一種茶樹紫芽相關蛋白CsGST及其編碼基因和應用。
【背景技術】
[0002]紫芽茶樹是一種重要的特色茶樹資源。自本世紀以來我國育成的紫芽茶樹品種主要有紫娟茶和紫燕茶。這些紫芽茶主要與其花青素含量較高有關。與普通茶葉相比，紫芽茶具有更多藥用保健價值，例如紫芽茶對癌細胞增殖具有更強的抑制效果。對心血管疾病、神經性疾病具有更好的預防作用。對眼科疾病、循環系統紊亂等也具有很好的療效。同時紫芽茶還可以作為一種綠色安全的天然色素應用于食品工業。因此對紫芽茶的開發和利用越來越受到人們的重視。
[0003]對于紫芽茶的成色機理，過去一直缺乏深入研究。在模式植物擬南芥中，與花青素累積相關的基因主要涉及類黃酮合成、花青素轉運及轉錄因子調控。在茶樹中究竟哪一步是限制性因子，目前尚不得而知，從而也還沒有一種可靠的定向培育紫芽茶樹品種的方法。
【發明內容】
[0004]針對現有技術存在的問題，本發明的目的在于設計提供一種茶樹紫芽相關蛋白CsGST及其編碼基因和應用的技術方案。
[0005]所述的一種茶樹紫芽相關蛋白CsGST，其特征在于其氨基酸序列為:
DSEQ ID N0.2所示的氨基酸序列；或
2)SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列經替換、缺失和/或添加一個或幾個氨基酸殘基形成的具有同等功能的氣基酸序列。
[0006]所述的編碼蛋白的基因，其特征在于其核苷酸序列為:
DSEQ ID N0.1所示的核苷酸;或
2)SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列經取代一個或幾個核苷酸，得到編碼CsGST的核苷酸序列。
[0007]所述的含有編碼基因的重組載體。
[0008]所述的編碼基因在調控茶樹芽葉花青素含量中的應用。
[0009]所述的編碼基因在提高茶樹芽葉花青素含量中的應用。
[0010]所述的一種制備花青素含量提高的轉基因植物的方法，其特征在于包括如下步驟:將所述的編碼基因導入出發植物中，得到轉基因植物;與出發植物相比，轉基因植物的花青素含量提高。
[0011 ]本發明的實驗證明，本發明在茶樹中發現蛋白CsGST，將該蛋白對應的基因在擬南芥中過表達，轉基因植物的葉花青素含量高于野生型對照，驗證了該基因具有提高植物花青素含量的功能，為定向培育紫芽茶樹品種提供候選基因。
【附圖說明】
[0012]圖1紫娟茶與龍井43不同葉位(一芽一葉、第二葉、第三葉、第四葉、第五葉、第六葉)表型；
圖2為花青素累積緊密相關的CsGSTl基因序列；
圖3紫娟茶與龍井43不同葉位花青素含量；
圖4紫娟茶與龍井43不同葉位CsGST I基因qPCR相對定量結果；
圖5擬南芥ttl9突變體轉基因前后花青素含量測定結果。
【具體實施方式】
[0013]以下結合實施例來進一步說明本發明。
實施例
[0014](I)茶樣制備:在夏茶季節取生長于中國農業科學院茶葉研究所試驗場生長期一致的紫芽品種紫娟茶及綠芽品種龍井43—芽一葉，用液氮速凍后暫存在-80°C冰箱中，用于提取總RNA。每組試驗樣品兩個生物學重復。如圖1所示紫娟茶與龍井43不同葉位(一芽一葉、第二葉、第三葉、第四葉、第五葉、第六葉)表型。
[0015](2)測序及轉錄組分析:茶樣用液氮研磨后用Qiagen公司的RNA提取試劑提取總RNAt3IiiRNA用Illumina公司的Truseq RNA Sample Prep試劑盒進行純化。RNA完整性及分布由B1analyzer 2100 (Agilent technologies , Palo Alto, CA,美國)測定。之后mRNA被切割為小片段，以這些片段為模板，使用隨機六聚體引物合成cDNA第一鏈。利用dNTPs、DNA聚合酶I和緩沖液等合成cDNA第二鏈。采用TAKARA的PCR試劑盒提取純化的短片段(TakaraB1，大津，日本)。測序適配器分別連接到短片段并經瓊脂糖凝膠電泳分辨。選擇適當的片段，并純化，隨后PCR擴增，以創建最終的cDNA文庫。
[0016]然后，CDNA序列通過IlluminaHiSeq 2500系統(Illumina, San Diego , CA,美國)進行測序(150 bp雙向測序)。通過對讀取的原始序列進行篩選，刪除適配器序列，空序列和低質量序列以提高序列質量。產生的序列進行BLAST搜索和注釋，參考的數據庫包括NCBI數據庫中的Nr數據庫、Pf am數據庫、KEGG數據庫和GO數據庫，比較的E值必須小于10一5。
[0017](3)差異基因篩選:基因的表達水平采用FPKM(每百萬測序堿基中每千個轉錄子測序堿基中所包含的測序片斷數)進行比較。采用cuffdiff軟件用確定差異表達(FDRS0.01)的基因。對其中與花青素合成、轉運相關的差異基因進行分析，獲得一條與花青素累積緊密相關的CsGSTl基因序列。該基因序列長為1179bp，其閱讀框長為642bp，編碼蛋白包含213個氨基酸，具體序列如圖2所示。
[0018]該編碼蛋白與山葡萄中與花青素累積相關的GST(ACN38271.1)相似度達到80%，與模式植物擬南芥中GSTF12(TT19)的相似度達到58%，因此它們是高度同源的基因。
[0019](4)實時熒光定量分析:為驗證CsGSTl基因，測定龍井43及紫娟茶不同葉位(一芽一葉、第二葉、第三葉、第四葉、第五葉和第六葉)花青素含量及CsGST I基因相對表達量。花青素含量測定采用分光光度計法，CsGSTl基因相對表達量測定采用實時熒光定量PCR分析。
[0020]熒光定量PCR采用ABI7500實時PCR系統(Applied B1systems)，以SYBR Green染料進行標記。內參基因選擇茶樹GAPDH基因(GE651107)。采用的引物為CsGSTl-F: 5’-TATTCATGTTGATCTTGACTCTGGA-3’；CsGSTl-R: 5’-CTTCCAGAGTGGTTCCTAGTAGGTT-3’；GAPDH-F: 5 ’ -TTGGCATCGTTGAGGGTCT-3 ’ 及 GAPDH-R: 5 ’ -CAGTGGGAACACGGAAAGC-3 ’。反應體系為25μ1，包含0.5yL LATaq,5yL PCR緩沖液，2yL dNTP(2.5 mM)，0.5yL引物(10 Μ)，1μL cDNA(40 ng)和 15.5yL CldH2O0 反應條件為:94°C，3分鐘；95°C，30秒；60°C，30秒；72°C，I分鐘;30個循環。72 °C，1分鐘;4 °C保存。每組樣品3個重復。
[0021 ]花青素提取取不同葉位鮮樣0.1 g，放入2mL離心管，用自動研磨機研磨成粉后加入1.5mL 0.1 mol.L—1鹽酸乙醇溶液，在60 °C水浴中浸提30分鐘，4°C3000g離心10 min,取上清液用于花青素測定，每組樣品3個重復。花青素測定采用UV-160型日本島津紫外分光光度計，測定提取液在530nm、620nm和650nm波長下的吸光值，并進行換算。試驗結果表明紫鵑茶與龍井43各個葉位花青素含量與CsGSTl基因表達水平呈極顯著正相關。如圖3所示，紫娟茶與龍井43不同葉位花青素含量。如圖4所示，紫娟茶與龍井43不同葉位CsGSTl基因qPCR相對定量結果。
[0022] (5)轉基因驗證:將茶樹CsGSTl全長cDNA克隆到含有35S啟動子的植物表達載體P B I I 2 I上。具體步驟包括:設計特異引物:C s G S T 1- F 2: 5 ’ -TCTAGAATGGTTGTTAAAGTGTATGGTC-3’； CsGSTl_R2: 5’-GGATCCCTAGTCCATGAGATTCATGAC-3’。以紫娟茶cDNA為模板，獲得CsGSTl的cDNA序列。通過PCR在該序列兩側引入FBamH /位點，并通過瓊脂糖凝膠電泳對目標片段切膠回收。將回收純化后的PCR產物與PMD19-T載體連接。通過熱擊法轉化大腸桿菌DH5a。菌液涂于含氨芐青霉素(Amp)的LB培養基上，37°C培養16h。測序正確的帶有CsGSTl基因的序列雙酶切后連入pBI121質粒，構建過表達載體P35S::CsGSTl。再通過電擊法轉入農桿菌GV3101，后侵染擬南芥ttl9-8突變體(salk_105779擬南芥突變體)。該突變體突變基因為擬南芥中CsGSTl的同源基因TT19。該TT19敲除突變體幾乎沒有花青素積累。采用花序侵染法將CsGSTl轉入ttl9-8突變體。轉基因株系篩選到T2代純系后進行表型性狀觀察及花青素測定。試驗結果表明，轉基因株系ttl9-8-0El與ttl9-8-0E2在2%糖處理條件下子葉和莖呈紫色，而ttl9-8突變體子葉和莖呈黃綠色。花青素測定表明轉基因株系花青素含量提高了 10倍左右，如圖5所示，擬南芥ttl9突變體轉基因前后花青素含量測定結果。
【主權項】
1.一種茶樹紫芽相關蛋白CsGST，其特征在于其氨基酸序列為: DSEQ ID N0.2所示的氨基酸序列；或 2)SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列經替換、缺失和/或添加一個或幾個氨基酸殘基形成的具有同等功能的氣基酸序列。2.編碼權利要求1所述蛋白的基因，其特征在于其核苷酸序列為: 1)SEQID N0.1所示的核苷酸;或 2)SEQID N0.1所示的核苷酸序列經取代一個或幾個核苷酸，得到編碼CsGST的核苷酸序列。3.含有如權利要求1所述編碼基因的重組載體。4.如權利要求2所述的編碼基因在調控茶樹芽葉花青素含量中的應用。5.如權利要求2所述的編碼基因在提高茶樹芽葉花青素含量中的應用。6.—種制備花青素含量提高的轉基因植物的方法，其特征在于包括如下步驟:將權利要求2所述的編碼基因導入出發植物中，得到轉基因植物;與出發植物相比，轉基因植物的花青素含量提高。
【文檔編號】C12N15/82GK105936898SQ201610572400
【公開日】2016年9月14日
【申請日】2016年7月20日
【發明人】韋康, 成浩, 王麗鴛, 阮麗, 李海琳, 吳立赟
【申請人】中國農業科學院茶葉研究所