一種基于在線監控堿液消耗率的乳酸菌高細胞密度培養方法
【專利摘要】本發明具體公開了一種基于在線監控堿液消耗率的乳酸菌高細胞密度培養方法。包括如下步驟：S1.采用裝有pH傳感器和堿液流加系統的發酵罐進行乳酸菌高細胞密度培養；S2.在培養過程中通過pH傳感器和堿液流加系統保持培養過程中pH穩定；S3.在步驟S2的培養過程中，每隔0.5h～1.0h計算堿液消耗率，判斷乳酸菌在培養過程中的增殖情況、補料時間和放罐時間。該方法可以及時、準確地判斷培養過程中補料和放罐時間點；避免在線取樣易染菌、活菌計數結果滯后、光密度測定對培養基澄清度要求高的問題，節省人力，因此具有更準確、更客觀、更實時、更便捷的優點，可在乳酸菌高細胞密度培養中應用。
【專利說明】
一種基于在線監控堿液消耗率的乳酸菌高細胞密度培養方法
技術領域
[0001] 本發明涉及生物過程控制和優化工程領域，具體涉及一種基于在線監控堿液消耗 率的乳酸菌高細胞密度培養方法。
【背景技術】
[0002] 乳酸菌的高密度培養目前普遍采用培養過程補料和分批培養相結合的發酵方法， 該方法的關鍵點在準確的掌握補料的時間以及發酵終止時間。這些關鍵點的控制主要是依 靠預設參數的反饋控制。預設的參數包括光密度(0D值）、細胞計數和活菌數測定等。這些參 數的測定都需要離線檢測，需要不斷通過取樣口取樣測定，不僅操作復雜，而且由于罐內氣 壓平衡才能出料，就必需向罐中通入空氣，這容易導致雜菌隨之侵入造成污染，污染的風險 隨著取樣頻次的增加而增加。如進行乳酸菌活菌計數法，即為平板計數法，雖然準確性高， 但耗時太長，需要48_72h才能獲得計數結果。光密度法有時也可實現生物量的在線監測，但 是受到培養基濁度、焚光性、粘度、阻抗、溫度等影響和限制，從而影響測量的及時性、準確 性和可靠性。
【發明內容】
[0003] 本發明針對上述現有技術的不足，提供一種基于在線監控堿液消耗率的乳酸菌高 細胞密度培養方法。
[0004] 本發明的上述目的是通過以下技術方案予以實現的。
[0005] -種基于在線監控堿液消耗率的乳酸菌高細胞密度培養方法，具體包括如下步 驟： 51. 采用裝有pH傳感器和堿液流加系統的生物反應器進行乳酸菌高細胞密度培養； 52. 培養過程中通過pH傳感器和堿液流加系統保持發酵罐中乳酸菌培養液的pH穩定； 53. 在步驟S2的培養過程中，每隔0.5h~1. Oh記錄堿液變化情況； 54. 根據S3所得的堿液消耗率的變化趨勢來判斷乳酸菌高細胞密度培養過程中乳酸菌 增殖情況，進而控制分批補料時間、過種時間和放罐時間。
[0006] 優選地，所述步驟S1中堿液為25~28%(w/w)氨水溶液、20~25%(w/w) NaOH溶液、 2〇~25%(w/w) Na2C03溶液或2〇~25%(w/w) (NH4)2C〇3溶液。
[0007] 優選地，所述的乳酸菌菌株為鼠李糖乳桿菌rAa/zmosus)、植物乳 ^fMXLactobacillusplantarumH：^)]^\M&ffMXBifidobacteriumanimalis') 〇
[0008] 優選地，所述步驟S3中堿液消耗率的計算公式為：
Vi:計時起始時堿液體積(mL) ;mi:計時起始時堿液質量(g); V2:計時結束時堿液體積(mL) ;m2:計時結束時堿液質量(g); t:計時時長(min);堿液消耗率:mL/min或g/min。
[0009] 優選地，步驟S3所述根據堿液消耗率的變化趨勢來判斷乳酸菌增殖情況是指：當 菌株增殖處于遲滯期時，堿液消耗率數值很小且變化不大；當罐內菌株生長處于對數期時， 堿液消耗率數值不斷增大。
[0010] 優選地，步驟S3所述根據所述堿液消耗率來判斷分批補料時間、過種時間和放罐 時間是指:對數期時，堿液消耗率突然將至很低，即為分批補料時間；補料后，堿液消耗率突 增，此時為后對數期;分批補料結束后，堿液消耗率突然再次突降，即為移種或放罐時間。
[0011] 本發明提供的一種基于在線監控堿液消耗率的乳酸菌高細胞密度培養方法，是基 于這樣的構思:菌株在調整期時，增殖緩慢，代謝速率低，利用培養基中的碳源分泌乳酸少 且慢，中和這些乳酸維持培養基中pH穩定所需的堿液量少;在對數期時，菌株迅速增長，代 謝旺盛，迅速地利用培養基中的碳源和氮源進行分裂增殖，乳酸分泌量多，堿液補充量也隨 之增快增多；在穩定期時，菌株細胞數量穩定，總體的代謝速率、產酸速率以及堿液消耗速 率穩定;在衰亡期時，菌株活性及數量急劇下降，菌株代謝能力減弱，產酸能力下降，堿液補 充量也隨之變少。因此，將堿液消耗量與時間參數相結合，不需要任何控制手段，僅需要計 算出某個時間段培養液添加中和堿液的變化率，即堿液消耗速率，反映出菌株的增殖情況 和代謝活力。而且堿液的消耗量測定，無論是體積變化還是質量變化，均可以直接肉眼觀察 讀取數值。
[0012] 與現有技術相比，本發明具有以下有益效果： (i )直觀實時:①相比于活菌計數法需要48_72h，采用堿液變化率的計算和監控，可以 在線實時地反映乳酸菌高細胞密度培養過程中乳酸菌菌株的增殖情況;②可以準確、即時 判斷補料時間、過種時間和放罐時間等主要工藝參數，避免因碳源不足引起菌株發生衰退， 菌株活力和活菌量下降;③有效縮短培養時間，避免造成操作滯后帶來時耗和能耗，節約生 廣成本，提尚生廣效率。
[0013] (2)穩定可靠:①通過直接觀察記錄堿液的變化量可以不受培養基溫度、濁度、粘 度、測定設備等因數對結果的影響，適用范圍廣;②該方法反映的是活菌的代謝情況，不受 已衰亡菌細胞的影響，可靠性高。
[0014] (3)便捷安全:①采用堿液變化率的計算和監控，跳過了以往監控的取樣環節，可 以大大降低發酵過程中因取樣造成污染的風險；②同時也節約人力，減少操作難度、復雜 性，更為便捷。
【附圖說明】
[0015] 圖1為20L種子罐培養階段NaOH消耗率。
[0016] 圖2為200L發酵罐培養階段NaOH消耗率圖。
[0017] 圖3為20L發酵罐培養階段NaOH消耗率。
[0018] 圖4為100L發酵罐培養階段氨水消耗率。
【具體實施方式】
[0019] 下面結合說明書附圖和具體實施例對本發明作出進一步地詳細闡述，所述實施例 只用于解釋本發明，并非用于限定本發明的范圍。下述實施例中所使用的試驗方法如無特 殊說明，均為常規方法;所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業途徑得到的試劑 和材料。
[0020] 實施例1 第一步采用裝有pH傳感器和25%Na0H自動流加系統的20L種子罐和200L放大發酵罐進 行鼠李糖乳桿菌(lacioAaciDus rAa/zmost/s)高細胞密度培養，將裝有30%Na0H試劑瓶放于 天平上記重； 第二步培養過程中通過pH傳感器和氨水自動流加系統保持發酵罐中植物乳桿菌培養 液的pH穩定在5.7; 第三步在第二步的培養過程中，每隔30min記錄試劑瓶中NaOH溶液的質量； 第四步將第三步所得的堿液體積按照如下公式計算的堿液消耗率(g/min)。
mi:計時起始時堿液質量(g) m2:計時結束時堿液質量(g) t:計時時長(min) 采用NaOH溶液質量變化率的變化趨勢來判斷植物乳桿菌高細胞密度培養過程中菌株 增殖情況，進而判斷分批補料時間、過種時間和放罐時間。最終所得的消耗堿液質量變化率 變化趨勢如圖1和圖2所示。
[0022]本次培養，共耗時18.5小時，最終活菌數2.3 X 101()Cfu/mL，達到了高密度培養的要 求。
[0023] 實施例2 第一步采用裝有pH傳感器和20%Na0H自動流加系統的20L放大發酵罐進行植物乳桿菌 (ZaciohciDtAs 高細胞密度培養，將20%Na0H裝于帶有體積刻度的試劑瓶或量 筒中； 第二步將1L搖瓶種子接入發酵罐中，培養過程中通過pH傳感器和20%Na0H自動流加系 統保持發酵罐中植物乳桿菌培養液的pH穩定在5.5; 第三步在第二步的培養過程中，每隔30min記錄試劑瓶或量筒中NaOH溶液的體積； 第四步將第三步所得的堿液質量按照如下公式計算的堿液消耗率(mL/min)。
Vi:計時起始時堿液體積(mL) V2:計時結束時堿液體積(mL) t:計時時長(min) 采用NaOH溶液體積變化率的變化趨勢來判斷植物乳桿菌高細胞密度培養過程中菌株 增殖情況，進而判斷分批補料時間和放罐時間。最終所得的消耗堿液體積變化率變化趨勢 如圖3所示。
[0025] 本次培養，共耗時9小時，最終活菌數1.2X101()Cfu/mL，達到了高密度培養的要求。
[0026] 實施例3 第一步采用裝有pH傳感器和25%氨水手動流加系統的100L厭氧發酵罐進行動物雙歧 桿菌(/? c/o c i eri a/3 i?a i s)高細胞密度培養，將裝有2 5 %氨水的試劑瓶放于天平上 記重； 第二步培養過程中通過pH傳感器和25%氨水手動流加保持發酵罐中動物雙歧桿菌培 養液的pH穩定在6.0; 第三步在第二步的培養過程中，每隔30min記錄氨水(含試劑瓶)的質量； 第四步將第三步所得的堿液體積按照如下公式計算的堿液消耗率(g/min)。
mi:計時起始時堿液質量(g) m2:計時結束時堿液質量(g) t:計時時長(min) 采用氨水溶液質量變化率的變化趨勢來判斷植物乳桿菌高細胞密度培養過程中菌株 增殖情況，進而判斷移種時間、分批補料時間和放罐時間。最終所得的消耗氨水質量變化率 變化趨勢如圖4。
[0028]本次培養，共耗時12小時，最終活菌數9.4 X 109cfu/mL，達到了高密度培養的要 求。
【主權項】
1. 一種基于在線監控堿液消耗率的乳酸菌高細胞密度培養方法，其特征在于，包括如 下步驟：51. 采用裝有pH傳感器和堿液流加系統的發酵罐進行乳酸菌高細胞密度培養；52. 培養過程中通過pH傳感器和堿液流加系統保持發酵罐中乳酸菌培養液的pH穩定；53. 在步驟S2的培養過程中，每隔0.化~1.化記錄堿液變化情況；54. 根據S3所得的堿液消耗率的變化趨勢來判斷乳酸菌高細胞密度培養過程中乳酸菌 增殖情況，進而控制分批補料時間、過種時間和放罐時間。2. 根據權利要求1所述的培養方法，其特征在于，所述堿液為25~28%(w/w)氨水溶液、 20~25%(w/w) NaOH溶液、20~25%(w/w) Na2C〇3溶液或20~25%(w/w)(畑4)2〇)3溶液。3. 根據權利要求1所述的培養方法，其特征在于，所述步驟S2中的pH穩定范圍是5.5~ 6.0。4. 據權利要求1所述的培養方法，其特征在于，所述的乳酸菌菌株為鼠李糖乳桿菌、植 物乳桿菌或動物雙歧桿菌。5. 據權利要求1所述的培養方法，其特征在于，步驟S3中堿液消耗率的計算公式為：Vi:計時起始時堿液體積(mL) ;mi:計時起始時堿液質量(g); V2:計時結束時堿液體積(mL) ; m2:計時結束時堿液質量(g); t:計時時長(min);堿液消耗率:mL/min或g/min。6. 據權利要求1所述的培養方法，其特征在于，所述步驟S3中根據堿液消耗率的變化趨 勢來判斷乳酸菌增殖情況是指：當菌株增殖處于遲滯期時，堿液消耗率數值很小且變化不 大;當罐內菌株生長處于對數期時，堿液消耗率數值不斷增大。7. 據權利要求1所述的培養方法，其特征在于，所述步驟S3中根據所述堿液消耗率來判 斷分批補料時間、過種時間和放罐時間是指:對數期時，堿液消耗率突然將至很低，即為分 批補料時間；補料后，堿液消耗率突增，此時為后對數期;分批補料結束后，堿液消耗率突然 再次突降，即為移種或放罐時間。
【文檔編號】C12R1/25GK105936885SQ201610543200
【公開日】2016年9月14日
【申請日】2016年7月8日
【發明人】鮑志寧, 林偉鋒, 夏楓耿
【申請人】廣州市微生物研究所, 華南理工大學