嵌合抗原受體及其基因和重組表達載體、car133-nkt細胞及其制備方法和應用

嵌合抗原受體及其基因和重組表達載體、car133-nkt細胞及其制備方法和應用
【專利摘要】本發明屬于腫瘤生物制品領域，公開了一種嵌合抗原受體及其基因和重組表達載體、CAR133?NKT細胞及其制備方法和應用，所述嵌合抗原受體為CD133ScFv?CD8?CD137?CD3ζ，包括串聯的大鼠生長激素信號肽、CD133ScFv、CD8的鉸鏈區和跨膜區、CD137的胞內信號結構域和CD3ζ的胞內信號結構域。采用本發明的CAR133?NKT細胞與CD133陽性的上皮腫瘤細胞共培養時，對CD133陽性上皮腫瘤細胞具有很好的特異殺傷活性。
【專利說明】
嵌合抗原受體及其基因和重組表達載體、CAR133-NKT細胞及 其制備方法和應用
技術領域
[0001 ]本發明屬于腫瘤生物制品領域，具體地，涉及過繼免疫治療中的一種嵌合抗原受 體CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G及其基因和重組表達載體、工程化CD133靶向性的NKT細胞 (CAR133-NKT細胞)及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 自然殺傷細胞(NKT)是一種特殊類型的T淋巴細胞亞群，具有T細胞和NK細胞細胞 兩重性質。NKT細胞能表達T細胞的TCR與NK細胞的NKR-P1兩種受體，在TCR和NKR介導下，NKT 細胞能夠產生大量的IL-4及INF γ，對腫瘤細胞發揮細胞殺傷作用。NKT細胞通過自身表面 的CD16與特異性抗體的Fc段結合，發揮抗體依賴性的細胞介導的細胞毒作用（ADCC， antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)。但在抗體依賴的細胞介導的殺傷作 用過程中，由于抗體能與靶細胞上的相應抗原表位特異性結合，NKT細胞可殺傷任何已與抗 體結合的靶細胞，因此抗體與靶細胞上的抗原結合是特異性的，但NKT細胞對靶細胞的殺傷 作用是非特異性的。另外，通常情況下，輸注的NKT細胞在患者體內半衰期為2周左右，有效 期短暫，需要反復多次輸注。而且，NKT細胞本身缺少特異性抗體，不足以在腫瘤周圍或者瘤 巢中富集，制約了NKT細胞對惡性腫瘤的靶向治療。再者，研究表明，NKT細胞并不是對所有 的腫瘤都有殺傷效果，且對部分腫瘤的殺傷作用比較弱，特異殺傷活性有待提高，NKT細胞 對腫瘤干細胞的免疫監視目前仍然存在爭議。
[0003] 腫瘤干細胞是一類特殊的腫瘤細胞，其占腫瘤細胞的比率較低，但具有自我更新， 并分化為其他不同腫瘤細胞的潛能。大量研究指出，腫瘤干細胞與腫瘤的復發及遠端轉移 具有很大的相關性，并且可能是腫瘤對放化療產生抵抗的緣由。CD133是細胞表面的糖蛋 白，可作為分離腫瘤組織中腫瘤干細胞的標記。另外，CD133在多種腫瘤細胞表面呈現高表 達，如結直腸癌、肝癌、膽管癌、胰腺癌、食管癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺 癌、子宮內膜癌、腦腫瘤、黑色素瘤或神經膠質瘤等。研究發現腫瘤起始細胞群里含有大量 的⑶133陽性的細胞，同時，⑶133的高表達與腫瘤治療差的預后有關，由于以上特性，⑶133 抗原成為以抗體為基礎治療的理想靶點，但目前仍沒有一種對腫瘤特異殺傷活性較高的制 劑。

【發明內容】

[0004] 本發明的目的是為了克服現有技術中NKT細胞對腫瘤的殺傷作用比較弱、特異殺 傷活性有待提高的缺陷，充分利用CD133治療腫瘤的理想靶點的作用，提供一種嵌合抗原受 體CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G及其基因和重組表達載體、工程化CD133靶向性的NKT細胞 (CAR133-NKT細胞)及其制備方法和應用。
[0005] 本發明的發明人在研究中意外發現，采用本發明的嵌合抗原受體⑶133ScFv_⑶8-CD137-CD3G修飾的NKT細胞與CD133陽性的上皮腫瘤細胞共培養時，對腫瘤細胞具有很好的 特異殺傷活性。
[0006] 因此，為了實現上述目的，第一方面，本發明提供了一種嵌合抗原受體，所述嵌合 抗原受體為CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G，包括串聯的大鼠生長激素信號肽、CD133ScFv、CD8 的鉸鏈區(hinge區）和跨膜區、CD137的胞內信號結構域和CD3G的胞內信號結構域。
[0007] 第二方面，本發明提供了編碼上述嵌合抗原受體的基因。
[0008] 第三方面，本發明提供了含有上述基因的重組表達載體。
[0009] 第四方面，本發明提供了 一種工程化⑶133靶向性的NKT細胞，所述NKT細胞是上述 嵌合抗原受體CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G修飾的NKT細胞。
[0010] 第五方面，本發明提供了一種工程化⑶133靶向性的NKT細胞的制備方法，所述方 法包括:包裝攜帶pWPXL-CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G的慢病毒，得到病毒濃縮液;利用得到 的病毒濃縮液感染NKT細胞，使NKT細胞表達嵌合抗原受體CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G。
[0011] 第六方面，本發明提供了上述方法制備得到的工程化CD133靶向性的NKT細胞。 [0012]第七方面，本發明提供了上述工程化CD133靶向性的NKT細胞在制備用于治療腫瘤 的制劑中的應用。
[0013] 第八方面，本發明提供了一種治療CD133陽性的上皮腫瘤和/或抑制腫瘤復發與轉 移的方法，該方法包括：向CD 133陽性的上皮腫瘤患者體內回輸本發明的工程化CD 133靶向 性的NKT細胞。
[0014] 在與CD133陽性的上皮腫瘤細胞共培養時，本發明的嵌合抗原受體CD133ScFv-⑶8-⑶137-⑶3ζ修飾的NKT細胞，即工程化⑶133靶向性的NKT細胞能夠特異性結合⑶133抗 原，增強免疫細胞靶向識別癌細胞表面CD 133抗原的能力，加強對CD 133陽性靶細胞的特異 殺傷活性。本發明的工程化CD133靶向性的NKT細胞為治療CD133陽性的腫瘤及阻遏腫瘤轉 移與復發提供了一種新的選擇，具有良好的產業應用前景。
[0015] 本發明的其它特征和優點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細說明。
【附圖說明】
[0016] 圖1為流式細胞術對分離培養的NKT細胞表型分析的結果。
[0017] 圖2為本發明的慢病毒表達載體pWPXL-CD8-CDl 37-〇)3ζ的限制性內切酶Mlul/ Ndel雙酶切片段的電泳鑒定圖。
[0018] 圖3為本發明的慢病毒表達載體pWPXL-CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G的限制性內切 酶BamHI/Ndel雙酶切片段的電泳鑒定圖。
[0019] 圖4為本發明的慢病毒表達載體pWPXL-CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G的結構示意 圖，其中，逆時針序列為正向基因片度，順時針為反向基因片段。
[0020] 圖5為流式細胞術檢測含有嵌合抗原受體CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G的病毒濃縮 液對NKT細胞的感染效率。
[0021] 圖6為流式細胞術檢測嵌合抗原受體CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G修飾的NKT細胞 (CAR133-NKT細胞)表型鑒定的結果。
[0022] 圖7(A)-圖7(C)為本發明的實施例4中不同CD133表達水平的上皮腫瘤細胞的 ⑶133表達水平分析圖。
[0023]圖8為本發明的實施例4中CAR133-NKT細胞對不同⑶133表達水平的上皮腫瘤細胞 的殺傷作用分析圖（4小時）。
[0024]圖9為本發明的實施例4中CAR133-NKT細胞對不同⑶133表達水平的上皮腫瘤細胞 的殺傷作用分析圖（8小時）。
[0025] 圖10為本發明的實施例5中SW620和HT29的CD133表達水平分析圖。
[0026] 圖11為本發明的實施例5中注射生理鹽水、NKT細胞、Mock細胞、CAR133-NKT細胞后 的腫瘤組織體積圖。
[0027]圖12為本發明的實施例6中CAR133-NKT細胞對造血系統的功能影響分析圖。
[0028]圖13(A)-圖13(D)為本發明的實施例7中CAR133-NKT細胞對肝癌患者治療的毒副 反應的分析圖，分別顯示了不同細胞回輸后天數時血紅蛋白（Hgb )、白細胞(WBC)、血小板 (PLT)和網織紅蛋白（Ret)的變化趨勢。
[0029]圖14為本發明的實施例7中CAR133-NKT細胞拷貝數與肝癌患者CD133陽性細胞數 的變化曲線圖。
[0030]圖15為本發明的實施例7中肝癌患者的治療效果的分析圖。
[0031 ]圖16為本發明的實施例8中CAR133-NKT細胞對胰腺癌患者的治療效果圖。
【具體實施方式】
[0032] 以下對本發明的【具體實施方式】進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體 實施方式僅用于說明和解釋本發明，并不用于限制本發明。
[0033] 本發明提供了一種嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體為⑶133ScFv_⑶8-⑶137-⑶3ζ，包括串聯的大鼠生長激素信號肽、⑶133單鏈抗體⑶133ScFv、⑶8的鉸鏈區和跨膜區、 CD137的胞內信號結構域和CD3G的胞內信號結構域。
[0034]優選情況下，嵌合抗原受體CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G由大鼠生長激素信號肽、 CD133ScFv、CD8的鉸鏈區和跨膜區、CD137的胞內信號結構域和CD3G的胞內信號結構域串聯 構成。進一步優選地，嵌合抗原受體具有如SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列，更進一步優選 地，嵌合抗原受體的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0035] 本發明提供了編碼上述嵌合抗原受體的基因。優選情況下，所述基因具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，進一步優選地，編碼上述嵌合抗原受體的基因的核苷酸序列如 SEQIDN0.2**。
[0036] 本發明提供了含有上述基因的重組表達載體。優選情況下，重組表達載體為慢病 毒表達載體。對于慢病毒表達載體沒有特別的限定，只要能夠與輔助載體共轉染包裝細胞 如293T包裝細胞，獲得病毒濃縮液及嵌合抗原受體CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G修飾的NKT 細胞即可，優選情況下，慢病毒表達載體為pWPXL-CDl 33ScFv-CD8-CDl 37-〇)3ζ。
[0037] 對于慢病毒表達載體pWPXL-CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G的制備方法沒有特別的 限定，可以為本領域技術人員能夠想到的各種方法，優選情況下，慢病毒表達載體口1?父1^-CD133ScFv-CD8-CDl 37-〇)3ζ的制備方法包括以下步驟：
[0038] (1)從ΝΚΤ細胞cDNA中分別擴增CD8的hinge區和跨膜區、CD137的胞內信號結構域 和〇)3ζ的胞內信號結構域，并克隆至載體pWPXL-GFP中，構建得到pWPXL-CD8-CDl37-〇)3ζ; [0039] (2)合成編碼大鼠生長激素信號肽和⑶133ScFv的核苷酸序列，并克隆至pWPXL- CD8-CD137-CD3G 中，經測序驗證后得到序列正確的 pWPXL-CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G。
[0040] 步驟（1)中，對于從NKT細胞cDNA中分別擴增CD8的hinge區和跨膜區、CD137的胞內 信號結構域和CD3G的胞內信號結構域的方法沒有特別的限定，可以為本領域常用的各種方 法，例如可以為RT-PCR法。其中，NKT細胞可以通過分離人靜脈血中的單個核細胞，然后進行 培養獲得。
[0041 ] 具體地，得到pWPXL-CD8-CD137-CD3G的方法可以包括:提取NKT細胞的總RNA，逆轉 錄獲得NKT細胞cDNA，以得到的NKT細胞cDNA為模板，利用引物PI (SEQID NO. 11)和P2(SEQID N0.12)進行PCR擴增獲得CD8基因的hinge區和跨膜區（SEQIDN0.3);利用引物P3(SEQID N0.13)和P4(SEQIDN0.14)進行PCR擴增獲得CD137基因的胞內信號結構域(SEQIDN0.4) ; 利用引物P5(SEQID N0.15)和P6(SEQID N0.16)進行PCR擴增獲得0)3ζ基因的胞內信號結構 域(SEQID勵.5)，將獲得的？0?產物分別進行雙酶切，然后與組111/制61雙酶切后的慢病毒 表達載體pWPXL-GFP連接。
[0042]步驟(2)中，對于合成編碼大鼠生長激素信號肽和⑶133ScFv的核苷酸序列的方法 沒有特別的限定，可以為本領域常用的各種方法，例如可以通過全基因合成技術合成。 [0043] 具體地，得到序列正確的pWPXL-CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G的方法可以包括:通 過全基因合成技術合成編碼大鼠生長激素信號肽和CD133ScFv融合基因的核苷酸序列 (SEQID N0· 8)，克隆至載體pGSI 中，得到pGSI-CD133ScFv;然后將pGSI-CD133ScFv進行 BamHI/MluI雙酶切，與用BamHI/MluI雙酶切后的步驟（1)得到的重組質粒pWPXL-CD8-CD137-〇)3ζ連接，經測序鑒定，得到序列正確的pWPXL-CD 133ScFv-CD8-CD 137-〇)3ζ。其中， 大鼠生長激素信號肽的核苷酸序列如SEQID NO. 6所示，CD133ScFv核苷酸序列如SEQID NO. 7所示。
[0044] 本發明還提供了 一種工程化⑶133靶向性的NKT細胞，所述NKT細胞是由上述嵌合 抗原受體 CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G 修飾的 NKT 細胞(即 CAR133-NKT 細胞）。
[0045] 本發明還提供了 一種工程化⑶133靶向性的NKT細胞的制備方法，該方法包括:包 裝攜帶pWPXL-CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G的慢病毒，得到病毒濃縮液;利用得到的病毒濃 縮液感染NKT細胞，使NKT細胞表達嵌合抗原受體CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G。
[0046] 對于包裝攜帶pWPXL-CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G的慢病毒的方法沒有特別的限 定，可以為本領域技術人員常用的各種方法，優選情況下，將慢病毒表達載體PWPXL-CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G 與輔助質粒(如 psPAX2、pMD2.G)共轉染293T 包裝細胞，轉染 48-72h時收集病毒上清，離心、過濾，在濾液中添加5 X PEG6000-NaCl進行混勻，離心后棄上清， 沉淀用0-4 °C預冷的無菌PBS溶解，獲得病毒濃縮液。
[0047]本發明的方法中，還包括通過如下方法制備NKT細胞：
[0048] (1)在CD3單克隆抗體、白介素-2和白介素-15存在下，將單個核細胞進行第一階段 培養；
[0049] (2)在白介素-2存在下，將所述第一階段培養的細胞進行第二階段培養。
[0050] 優選情況下，所述第一階段培養的實施方式包括:將單個核細胞培養于第一 NKT細 胞培養液中，所述第一NKT細胞培養液含有NKT細胞培養基、CD3單克隆抗體、白介素-2和白 介素-15;進一步優選地，第一NKT細胞培養液中，所述⑶3單克隆抗體的濃度為30-70ng/mL， 和/或所述白介素-2的濃度為300-700U/mL，和/或所述白介素-15的濃度為30-70ng/mL。
[0051] 優選情況下，所述第二階段培養的實施方式包括:將所述第一階段培養的細胞培 養于第二NKT細胞培養液中，所述第二NKT細胞培養液中含有NKT細胞培養基和白介素-2;進 一步優選地，第二NKT細胞培養液中，所述白介素-2的濃度為300-700U/mL。
[0052]對于NKT細胞培養基沒有特別的限定，可以為本領域常用的各種用于培養NKT細胞 的培養基，例如可以為GT-T551培養基。
[0053]在制備NKT細胞時，對于第一階段培養和第二階段培養的條件沒有特別的限定，可 以為本領域常用的各種條件，例如可以在30-37Γ、飽和濕度為3-6%的C02培養箱中進行培 養。本領域技術人員可以對培養的時間進行適應性調整，此為本領域技術人員所公知，在此 不再贅述。
[0054] 本發明制備得到的NKT細胞中，CD3+細胞平均比率>90%，⑶3+⑶8+細胞占總⑶3+細 胞的平均比率>70%;⑶3+CD56+細胞占總⑶3+細胞的平均比率>15%。
[0055]對于感染NKT細胞的方法沒有特別限定，可以為本領域常用的各種方法，優選情況 下，該方法包括：
[0056] (1)在病毒濃縮液、魚精蛋白和白介素_2存在下，將NKT細胞進行第一階段感染培 養；
[0057] (2)在CD3單克隆抗體、白介素-2和白介素-15存在下，將所述第一階段感染培養的 細胞進行第二階段感染培養。
[0058]優選地，所述第一階段感染培養的實施方式包括:將NKT細胞培養于第三NKT細胞 培養液中，所述第三NKT細胞培養液含有NKT細胞培養基、病毒濃縮液、魚精蛋白和白介素-2;進一步優選地，第三NKT細胞培養液中，所述白介素-2的濃度為300-700U/mL。
[0059] 優選地，所述第二階段感染培養的實施方式包括:將所述第一階段感染培養的細 胞培養于所述第一NKT細胞培養液中。第一NKT細胞培養液的具體組成可參見前述相應內 容，在此不再贅述。
[0060] 在感染NKT細胞時，對于第一階段感染培養和第二階段感染培養的條件沒有特別 的限定，可以為本領域常用的各種條件，例如可以在30-37 °C、飽和濕度為3-6 %的⑶2培養 箱中進行培養。本領域技術人員可以對培養的時間進行適應性調整，此為本領域技術人員 所公知，在此不再贅述。
[0061 ]具體地，感染NKT細胞的方法包括:取1 X 107-5X 107個NKT細胞，棄掉舊的培養液， 加入2-4mL新鮮GT-T551培養液，再加入200-400yL病毒濃縮液、2-4yL 1 X 10-6mg/mL魚精蛋 白和終濃度為300-700U/mL的IL-2,置于30-37°C、飽和濕度為3-6%的C0 2培養箱中感染12-16h后，棄培養液，將細胞轉至未包被的培養瓶中，加入20-50mL的GT-T551培養基，再加入終 濃度為300-700U/mL的IL-2、終濃度為30-70ng/ml的CD3單克隆抗體和終濃度為30-70ng/mL 的白細胞介素15，于30-37°C、飽和濕度為3-6 %的⑶2培養箱中培養12-18h，獲得嵌合抗原 受體 CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G 修飾的 NKT 細胞。
[0062]進一步優選地，感染NKT細胞的方法還包括：
[0063] (3)先在白介素-2存在下，將所述第二階段感染培養的細胞進行體外誘導，待細胞 的密度為80-90 %時，再在CD3單克隆抗體、白介素-2和白介素-15存在下，將細胞進行擴增 培養。
[0064]優選情況下，所述體外誘導的實施方式包括:將所述第二階段感染培養的細胞培 養于所述第二NKT細胞培養液中，所述擴增培養的實施方式包括:將細胞培養于所述第一 NKT細胞培養液中。第一NKT細胞培養液和第二NKT細胞培養液的具體組成可參見前述相應 內容，在此不再贅述。
[0065]具體地，感染NKT細胞的方法還包括:將第二階段感染培養后獲得的慢病毒感染的 NKT細胞用IL-2的終濃度為300-700U/mL的GT-T551培養液進行體外誘導，待細胞的密度為 80-90%時將細胞轉入細胞培養袋中，隔1.5-2.5天加入IL-2的終濃度為300-700U/mL、CD3 單克隆抗體的終濃度為30_70ng/ml、白細胞介素 -15的終濃度為30-70ng/mL的新鮮GT-T551 培養液進行擴增培養并將細胞擴增至總量為IX 109-2X 109個細胞。經過本發明的慢病毒對 靶向CD133抗原的嵌合抗原受體進行NKT細胞感染，其感染效率高達30%-60%，而獲得的 CAR133-NKT細胞，其⑶3+CD56+細胞占總⑶3+細胞的比率在15 % -40 %范圍之內。
[0066] 嵌合抗原受體CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G修飾的NKT細胞表達的嵌合抗原受體的 蛋白氨基酸序列如SEQID NO. 1所示。其中，本領域技術人員應該理解的是，嵌合抗原受體前 體蛋白由大鼠生長激素信號肽、⑶133ScFv、⑶8的hinge區和跨膜區、⑶137的胞內信號結構 域和CD3G的胞內信號結構域串聯構成，蛋白質翻譯后在細胞內粗面型內質網切除信號肽后 成為成熟嵌合抗原受體蛋白，分泌輸出后并定位于NKT細胞的細胞膜上。該嵌合抗原受體的 蛋白氨基酸序列對應的基因編碼序列如SEQID N0.2所示。該嵌合抗原受體以基因 CD8的 hinge區和跨膜區及CD137和CD3G的胞內信號結構域串聯而成的結構為信號傳導結構域，其 氨基酸序列如SEQIDN0.9所示，對應的基因編碼序列如SEQIDN0.10所示。
[0067]本發明還提供了上述方法制備得到的工程化⑶133靶向性的NKT細胞。
[0068]本發明還提供了工程化CD133靶向性的NKT細胞在制備用于治療腫瘤的制劑中的 應用。優選情況下，腫瘤是CD133陽性的上皮腫瘤，進一步優選地，所述上皮腫瘤為結直腸 癌、肝癌、膽管癌、胰腺癌、食管癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、子宮內膜 癌、腦腫瘤、黑色素瘤或神經膠質瘤等。
[0069] 本發明的應用中，對于用于治療CD133陽性的腫瘤的制劑的組成沒有特別的限定， 只要含有本發明所述CAR133-NKT細胞或是由CAR133-NKT細胞制備而成即可，制劑的具體組 成和制備方法為本領域技術人員所熟知，在此不再贅述。
[0070] 本領域技術人員應該理解的是，上皮腫瘤為結直腸癌、肝癌、膽管癌、胰腺癌、食管 癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、子宮內膜癌、腦腫瘤、黑色素瘤或神經膠 質瘤等時，本發明的CAR133-NKT細胞能夠識別CD133陽性的細胞，包括腫瘤起始細胞、腫瘤 干細胞、上皮祖細胞及腫瘤細胞，并發揮靶向殺傷活性，從而對前述不同種類的CD133陽性 上皮瘤均有殺傷作用，不僅能夠清除原位腫瘤并且可抑制腫瘤細胞的轉移，還可能減少腫 瘤的復發。
[0071] 本發明還提供了一種治療CD133陽性的上皮腫瘤和/或抑制腫瘤復發與轉移的方 法，該方法包括：向⑶133陽性的上皮腫瘤患者體內回輸本發明的工程化⑶133靶向性的NKT 細胞。優選地，所述上皮腫瘤為結直腸癌、肝癌、膽管癌、胰腺癌、食管癌、胃癌、卵巢癌、肺 癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、子宮內膜癌、腦腫瘤、黑色素瘤或神經膠質瘤。
[0072]實施例
[0073] 以下的實施例將對本發明作進一步的說明，但并不因此限制本發明。
[0074] 以下實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為本領域常規方法。下述實施例中所 用的實驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到，其中：
[0075] NKT細胞培養基GT-T551購自TaKaRa公司。
[0076] 淋巴細胞分離液購自TBD公司。
[0077] ⑶3單克隆抗體、重組纖維連接蛋白（retronectin)均購自TaKaRa公司。
[0078] 重組人蛋白干擾素_γ、重組人白介素2、重組人白介素15均購自protech公司。
[0079] 總RNA提取試劑盒RNAiso Reagent、高保真DNA聚合酶（primeSTARXHS DNA Polymerase)、T4 DNA連接酶購自 TaKaRa公司。
[0080] RevertAid? First Strand cDNA Synthesis Kit購自Fermentas公司。
[0081] Bgl Π 、EcoRI、MluI、BamHI、NdeI、EcoR V購自Fermentas公司。
[0082] 瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、普通DNA產物純化試劑盒、質粒小提試劑盒均購自天 根生化科技有限公司。
[0083] pWPXL-GFP、psPAX2、pMD2 · G均購自 Addgene 公司。
[0084] pGSI購自北京天一輝遠生物科技有限公司。
[0085] Transl-Tl Phage Resistant化學感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公 司。
[0086] Lipofectamine? 2000 Transfection Reagent轉染試劑購自 Invitrogen公司。
[0087] 293T包裝細胞購自美國ATCC。
[0088] PEG6000-NaCl中PEG6000終濃度為25.5質量％，NaCl終濃度為1.2M，PEG6000和 NaCl均購自上海索萊寶生物科技有限公司。
[0089] 胎牛血清購自德國PAA公司。
[0090] CD107a-PECy5抗體購自美國BD公司。
[0091] ⑶133陽性的結直腸癌細胞系HT29購自美國ATCC公司。
[0092] CD133陽性的人肝癌細胞Hep3B購自美國ATCC公司。
[0093] CD133陽性的人胰腺癌細胞SW1990購自美國ATCC公司。
[0094] ⑶133陽性的人結直腸癌細胞DLD1購自美國ATCC公司。
[0095] ⑶133陽性的人結直腸癌細胞SW620購自美國ATCC公司。
[0096] ⑶133陰性的人結直腸癌細胞L0V0購自美國ATCC公司。
[0097] CD133陰性的人肝癌細胞HepG2購自美國ATCC公司。
[0098] 5-羧基熒光素琥珀酰亞胺酯購自上海譜振生物科技有限公司。
[0099]膜聯蛋白V-RPE試劑盒購自美國BD公司。
[0100] MethoCult? H4434經典細胞培養基購自stem cell公司。
[0101] 所有引物均由北京天一輝遠生物科技有限公司合成。
[0102] 實施例1 NKT細胞的制備
[0103] (1)取人靜脈血于含肝素的真空管中。采用淋巴細胞分離液，通過密度梯度離心方 法分離獲得單個核細胞(PBMCs)。
[0104] (2)PBMCs洗三次后，采用含有0.6體積％的人自體血清的NKT細胞培養基GT-T551 調整細胞終濃度為2X 106個細胞/mL;將細胞接種于預先經過終濃度為10yg/mL的 retronectin包被的75cm2細胞培養瓶中。然后在培養基里加入終濃度為500U/mL的重組人 白介素2、50ng/ml CD3單克隆抗體和50ng/mL的重組人白介素-15,在37°C、飽和濕度為5% 的C02培養箱中培養。
[0105] (3)培養第4天，將細胞轉移至未包被的培養瓶中，每2天按照細胞生長數量加入 NKT細胞培養基GT-T551，控制細胞濃度為1 X 108個細胞/mL，并加入終濃度為500U/ml的重 組人白介素2;培養至第12天，得到NKT細胞，流式細胞術對NKT細胞表型進行分析。結果見圖 1，其中 CD3+: 95 · 04 % ; CD3+CD8+: 90 · 99 % ; CD3+CD56+: 24 · 12 % ; CD8+CD56+: 24 · 63 %。
[0106] 實施例2慢病毒表達載體pWPXL-CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G的構建
[0107] (l)NKT 細胞 cDNA 的制備
[0108] 離心沉淀實施例1培養得到的NKT細胞，用總RNA提取試劑盒RNAiso Reagent提取 細胞的總RNA，-80°C保存備用。提取的總RNA用逆轉錄試劑盒RevertAid? First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉錄得NKT細胞cDNA，-20°C保存備用。
[0109] (2)慢病毒質粒 pWPXL-CD8-CD137-CD3G 的制備
[0110] 設計并合成如下引物序列(其中，下劃線標記為保護堿基，方框為酶切位點）：
[0113] 以步驟（1)中NKT細胞cDNA為模板，用引物P1和P2進行PCR擴增，得到長287bp的⑶8 的hinge區和跨膜區，核苷酸序列如SEQID勵.3所示，兩端分別含有組111和88111酶切位點 和保護堿基；用引物P3和P4進行PCR擴增，得到長146bp的CD137胞內信號結構域，核苷酸序 列如SEQID N0.4所示，兩端分別含有Bgl Π 和EcoR頂每切位點及保護堿基；用引物P5和?6進 行PCR擴增，得到長359bp的⑶3ζ的胞內信號結構域，核苷酸序列如SEQIDN0.5所示，兩端分 另IJ含有EcoRI和Ndel酶切位點及保護堿基。各步PCR擴增反應體系相同，以擴增CD137胞內信 號結構域為例，進行PCR擴增，PCR反應條件參照p rimeSTAR?HS DNA Polymerase的說明 書，反應體系(50yL)如下：
[0114] 雙蒸水：32.5yL
[0115] 5X 反應 buffer:10yL
[0116] dNTP 混合物(每種 2.5mM):4yL
[0117] P3(10mM):lyL
[0118] P4(10mM):lyL
[0119] NKT 細胞 cDNA(200ng/ul):lyL
[0120] PrimeSTAR?HS DNA Polymerase：0.5yL
[0121] 將上述PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠進行分離，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行 DNA片段回收。得到片段后分別進行雙酶切反應，酶切產物用普通DNA產物純化試劑盒回收 備用。
[0122] 慢病毒表達載體pWPXL-GFP用Mlul/Ndel雙酶切，酶切產物經1%的瓊脂糖凝膠進 行分離，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收大的載體片段，然后與之前回收的CD8、CD137、 0)3ζ片段通過T4 DNA連接酶連接，連接產物轉化Transl-Tl Phage Resistant化學感受態 細胞，37°C培養16h后挑取單克隆，37°C，250rpm培養12h后用質粒小提試劑盒提取質粒。提 取的質粒經限制性內切酶Mlul和Nde I雙酶切鑒定，鑒定電泳圖見圖2,其中，Ml: DNA分子量 標記D15000;l泳道：質粒pWPXL-CD8-CD137-CD3G的未酶切片段；2泳道：質粒pWPXL-CD8-CD137-CD3G的酶切片段(751bp);M2:DNA分子量標記D2000。將鑒定正確的質粒送北京天一 輝遠生物科技有限公司對插入的融合基因片段進行測序。將測序結果正確的重組質粒命名 為pWPXL-CD8-CD137-CD3ζ，其中，CD8的hinge區和跨膜區的核苷酸序列如SEQIDN0.3所示， CD137的胞內信號結構域的核苷酸序列如SEQID腸.4所示，003(的胞內信號結構域的核苷 酸序列如SEQIDN0.5所示。
[0123] (3)慢病毒質粒 pWPXL-CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G 的制備
[0124] 全基因合成編碼大鼠生長激素信號肽和⑶133ScFv融合基因的核苷酸序列，序列 如SEQID如.8所示，由北京天一輝遠生物科技有限公司合成，其5'端含有8 &111!11、1?)似1^序 列，3'端含有Mlul酶切位點，將前述融合基因克隆在質粒pGSI中，命名為pGSI-CD133ScFv。 質粒經BamHI/MluI雙酶切，酶切產物經1 %瓊脂糖凝膠進行分離，用瓊脂糖凝膠DNA回收試 劑盒回收目的片段備用。
[0125] pWPXL-CD8-CD137-CD3G質粒經限制性內切酶BamHI/MluI酶切，酶切產物經1%瓊 脂糖凝膠進行分離，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收載體片段備用。然后與回收的含有大 鼠生長激素信號肽和CD133ScFv的DNA片段通過T4 DNA連接酶進行連接，具體方法見說明 書。將連接產物轉化Transl-Tl Phage Resistant化學感受態細胞，37°C培養16h后挑取單 克隆，37°C，250rpm培養12h后，用質粒小提試劑盒提取質粒。提取的質粒經限制性內切酶 BamHI/Ndel雙酶切鑒定，鑒定結果如圖3所示，其中，其中，M1:DNA分子量標記D15000;l泳 道：質粒pWPXL-CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G未酶切片段（11281p) ;2泳道：質粒pWPXL-CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G 的酶切片段（65(^口，956匕口）；]?2:0嫩分子量標記02000。將鑒定 正確的質粒送北京天一輝遠生物科技有限公司對插入的融合基因片段進行測序。將測序結 果正確的重組質粒命名為pWPXL-⑶133ScFv-⑶8-⑶137-⑶3ζ，其結構示意圖如圖4所示，其 中包括大鼠生長激素信號肽(核苷酸序列如SEQID Ν0.6所示）、抗⑶133單鏈抗體(核苷酸序 列如SEQID N0.7所示）、⑶8的hinge區和跨膜區及⑶137的胞內信號結構域和⑶3ζ的胞內信 號結構域，其中，該嵌合抗原受體以基因 CD8的hinge區和跨膜區及CD137和CD3G的胞內信號 結構域串聯而成的結構為信號傳導結構域，其氨基酸序列如SEQID N0.9所示，對應的基因 編碼序列如SEQIDN0.10所示。
[0126] 實施例3嵌合抗原受體CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G修飾的NKT細胞的制備
[0127] (1)慢病毒的包裝和濃縮
[0128] 用分光光度計分別測定慢病毒表達質粒pWPXL-CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G和輔 助質粒psPAX2、pMD2.G的濃度，三種質粒以4:2:1的質量比用Lipofectamine? 2000 Transfection Reagent轉染試劑共轉染293T包裝細胞。分別在轉染48h、72h時收集病毒上 清于50mL EP管中，4°C，2000g離心10min，轉移兩次得到的上清至新EP管中，用4.5μπι濾器過 濾病毒上清;過濾的病毒上清與5 X PEG6000-NaCl按照4:1的體積比混勻，4°C靜置2h，然后4 °C，10000g離心20min，棄上清，沉淀用lmL的4°C預冷的無菌PBS溶解，即得嵌合抗原受體的 病毒濃縮液，按每管l〇〇yL進行分裝，-80 °C保存備用。
[0129] 按照上述方法，利用慢病毒表達質粒pWPXL-GFP和輔助質粒psPAX2、pMD2.G共轉染 293T包裝細胞，收集病毒上清，濃縮，獲得表達GFP綠色熒光蛋白的慢病毒濃縮液。
[0130] (2)慢病毒感染NKT細胞及感染后細胞的擴增培養
[0131] 取實施例1的在75cm2培養瓶中培養的1 X 107個NKT細胞，棄掉舊的培養液，加入2mL 新鮮NKT細胞培養基GT-T551、200yL步驟（1)得到的病毒濃縮液、2yL 1 X 10-6mg/mL魚精蛋 白，終濃度為500U/mL的重組人白介素2,置于37°C、飽和濕度為5%的C0 2培養箱中感染12小 時后，棄培養液。同時用表達GFP綠色熒光蛋白的慢病毒濃縮液對NKT細胞進行同步感染(得 到的NKT細胞稱為CART-GFP細胞），用于計算該病毒的感染效率。將感染后的細胞轉至未經 CD3和retronectin包被的75cm2培養瓶中，加入20mL的NKT細胞培養基GT-T551，再加入終濃 度為500U/mL的重組人白介素2、終濃度為50ng/ml的⑶3單克隆抗體和終濃度為50ng/mL的 重組人白介素15，于37 °C、飽和濕度為5 %的C02培養箱中培養18h，得到的NKT細胞稱為 CAR133-NKT細胞。按照CN 105384823 A中公開的方法制備CAR33-NKT細胞作為Mock細胞。用 流式細胞術檢測該病毒的感染效率，結果如圖5所示，CAR133-NKT細胞的感染效率為 36.32%〇
[0132] (3)體外誘導擴增CAR133-NKT細胞群
[0133] 將上述培養后的NKT細胞用重組人白介素2的終濃度為500U/mL的NKT細胞培養基 GT-T551進行體外誘導，待細胞的密度為85%時將細胞轉入細胞培養袋中，隔2天加入重組 人白介素2的終濃度為500U/mL、⑶3單克隆抗體的終濃度為50ng/ml、重組人白介素15的終 濃度為50ng/mL的新鮮NKT細胞培養基GT-T551進行擴增培養，待細胞擴增到總量為1.5 X 1〇9個細胞左右后，采用流式細胞儀對感染的細胞群體進行鑒定，細胞表型一般達到CD3陽 性細胞比例>90% ;CD3⑶8雙陽性細胞比例>70% ;CD3⑶56雙陽性細胞比例>15%，結果見 圖 6，CD3+: 94 · 09 % ; CD3+CD4+: 8 · 79 % ; CD3+CD8+: 79 · 95 % ; CD3+CD56+: 27 · 68 % ; CD8+CD56+: 奴.41%〇
[0134] 實施例4 CAR133-NKT細胞對不同⑶133表達水平的上皮腫瘤細胞殺傷作用分析
[0135] 分別取實施例3中制備的CAR133-NKT細胞、CAR33-NKT細胞和實施例1中培養的NKT 細胞接種于96孔板，與不同CD133表達水平的上皮腫瘤細胞(高水平表達CD133的癌細胞系： Hep3B、SW1990;中等水平表達CD133的癌細胞系：HT29、DLD1;及不表達CD133的癌細胞系 L0V0、HepG2)以效靶比（殺傷細胞:祀細胞)20:1的比率進行共培養，經過4小時的共培養后， 加入莫能菌素，終濃度為2μπι 〇 1 /L，孵育2小時，然后用PE標記的⑶107a抗體孵育15分鐘，用 PBS緩沖液洗滌3次后，流式分析⑶107a的表達水平。
[0136] 分別取實施例3中制備的CAR133-NKT細胞、CAR33-NKT細胞和實施例1中培養的NKT 細胞接種于96孔板，用5-羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(CFSE)進行染色，與不同⑶133表達水平 的上皮腫瘤細胞(高水平表達⑶133的癌細胞系:Hep3B、SW1990;中等水平表達⑶133的癌細 胞系:HT29、DLD1;及不表達CD133的癌細胞系L0V0、HepG2)以效靶比（殺傷細胞:靶細胞)20: 1的比率進行共培養，經過8小時的共培養后，將細胞用膜聯蛋白V-RPE試劑盒染色，同時設 置對照組分別為未加入免疫細胞殺傷處理的各不同CD133表達水平的上皮腫瘤細胞，并將 細胞用膜聯蛋白V-RPE試劑盒染色。流式細胞術對細胞凋亡進行檢測，細胞凋亡的量根據下 面的公式計算:凋亡率=(對照-樣品)/對照X 100%，對照為未加免疫細胞殺傷處理的細胞 存活數目；樣品為加入相對應的效靶比（殺傷細胞:靶細胞）的免疫細胞殺傷處理的細胞存 活數目。
[0137] 其中，不同⑶133表達水平的上皮腫瘤細胞的⑶133表達水平分析圖見圖7(A)-圖7 (C)，CAR133-NKT細胞對不同CD133表達水平的上皮腫瘤細胞的殺傷作用分析圖（4小時）見 圖8，CAR133-NKT細胞對不同CD133表達水平的上皮腫瘤細胞的殺傷作用分析圖（8小時）見 圖9。由圖7-9可知，嵌合抗原受體CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G修飾的NKT細胞對高水平表達 和中等水平表達的CD133癌細胞均具有較高的特異殺傷活性，而對不表達CD133的細胞系無 殺傷活性，且CAR133-NKT細胞的特異殺傷活性明顯優于NKT細胞和Mock細胞(CAR33-NKT細 胞)。
[0138] 實施例5動物實驗水平分析CAR133-NKT細胞對結直腸癌小鼠模型治療效果
[0139] 分別采用培養至對數生長期的⑶133陽性表達的人結直腸癌細胞SW620和HT29(數 量均為5\106個，其中〇)133的表達率分別為99.43%和66.67%，其中，31620和則'29的 ⑶133表達水平分析圖見圖10)，稀釋到100μΙ生理鹽水中，注射到裸鼠皮下。經15天，皮下形 成結直腸癌小鼠模型。
[0140] 在結直腸癌小鼠模型中通過腹腔分別給予生理鹽水、ΝΚΤ細胞、Mock細胞、CAR133-NKT細胞(細胞數量均為2 X107)進行治療，每天注射一次，連續注射2天，于40天處死小鼠， 去除腫瘤組織，測量腫瘤組織體積大小，結果見圖11。由圖11可知，注射CAR133-NKT細胞的 結直腸癌小鼠模型的瘤體明顯縮小，說明在動物實驗水平上本發明的CAR133-NKT細胞能夠 發揮靶向殺傷腫瘤細胞的功能。
[0141] 實施例6本發明的CAR133-NKT細胞對造血系統的功能影響
[0142] 取臍帶血采用Ficoll單核分離液分離原始祖細胞，分別與CAR133-NKT細胞、NKT細 胞、生理鹽水和Mock細胞(CAR33-NKT細胞）以1:20的比例混勻，接種于MethoCult? H4434經 典細胞培養基，于37°C，5%C02的孵箱培養2周，然后分別對克隆進行計數。
[0143] CAR13 3-NKT細胞對造血系統的功能影響分析圖見圖12，該圖示出了造血細胞的克 隆數，其中，BFU-E為紅細胞爆裂型集落形成單位(burst forming unit:early erythroid progenitor cell)，CFU_GM為粒細胞-巨細胞集落形成單位（colony forming unit: granulocyte and macrophage)，CFU_GEMM為粒細胞、紅細胞、單核細胞和巨核細胞集落形 成單位（colony forming unit: granulocyte , erythrocyte ,monocyte and megakaryocyte)，CFU_E為早期紅細胞祖細胞集落形成單位（colony forming unit:early erythroid progenitor cell)。如圖12所示，本發明的CAR133-NKT細胞對造血系統無明顯 不良影響。造血干細胞也表達⑶133，因此，排除了對造血系統的影響，保證了CAR133-NKT細 胞治療的安全性。
[0144] 實施例7本發明的CAR133-NKT細胞對⑶133陽性的上皮腫瘤（以肝癌為代表)患者 治療效果
[0145] 取CAR133-NKT細胞，經過100ml生理鹽水稀釋后，連續三天以劑量遞增的形式靜脈 回輸到CD133陽性的肝癌患者(在利用本發明的CAR133-NKT細胞進行靶向免疫治療前，已經 過多次治療（如放療、化療及其他藥物對癥治療等），但均無明顯療效)體內，其中患者1、患 者2、患者3經過了安全性劑量輸注，連續三天的輸注劑量總量分別為:0.03 X 107/kg、0.06 X 107/kg和0.03 X 107/kg;患者1、患者2、患者3、患者4進行了發揮治療效果的最低劑量輸 注，連續三天的輸注劑量總量分別為:0.39 X 107/kg、0.25 X 107/kg、0.4 X 107/kg和0.33 X l〇7/kg;患者5、患者6、患者7、患者8進行了發揮臨床療效的有效劑量輸注，連續三天的輸注 劑量總量分別為:0.5 X 107/kg、0.5 X 107/kg、0.5 X 107/kg和0.79 X 107/kg;回輸后對患者 的治療狀況進行評估。
[0146] 治療患者輸注CAR133-NKT細胞的劑量分為三個梯度：1)安全性劑量輸注，細胞回 輸量為〇. 〇 1 -〇. 06( X 10Vkg)，2)發揮治療效果的最低劑量輸注，細胞回輸量為0.1 -0.5( X l〇7/kg)，3)發揮臨床療效的有效劑量輸注，細胞回輸量為0.5-1.0( X 107/kg)。
[0147] 圖13(A)-圖13(D)為CAR133-NKT細胞治療肝癌患者的毒副反應分析圖，分別顯示 了不同細胞回輸后天數時血紅蛋白（Hgb)、白細胞(WBC)、血小板(PLT)和網織紅蛋白（Ret) 的變化趨勢。如圖13(A)-圖13(D)所示，血液系統的毒副反應主要為輕微的血紅蛋白和血小 板水平的降低，毒副反應較低，患者可耐受;其他毒副反應如回輸相關的寒顫、高熱、頭疼、 頭暈、乏力、惡心、嘔吐等，患者耐受性良好，通過給予解熱鎮痛制劑得以緩解。回輸后毒副 反應如皮疹、腹水、膽紅素升高等，給予對癥治療后均可以緩解。其他毒性結果如表1所示。
[0148] 表1
[0150] 圖14為CAR133-NKT細胞拷貝數與肝癌患者CD133陽性細胞數的變化曲線圖，其中， CAR133-NKT細胞拷貝數與⑶133陽性細胞的百分比呈現負相關，表明CAR133-NKT能夠殺傷 ⑶133陽性的靶細胞。
[0151] 圖15為8例肝癌患者的治療反應圖，其中，一位患者治療第一周期后疾病進展，第 二周期后疾病穩定;剩余七位患者治療第一周期后疾病穩定。說明CAR133-NKT細胞對肝癌 患者有一定的治療效果。
[0152] 實施例8本發明的CAR133-NKT細胞對⑶133陽性的上皮腫瘤（以胰腺癌為代表)患 者治療效果
[0153] 取CAR133-NKT細胞，經過100ml生理鹽水稀釋后，連續三天以劑量遞增的方式靜脈 回輸到CD 133陽性的胰腺癌患者(在利用本發明的CAR133-NKT細胞進行靶向免疫治療前，已 經過多次治療（如放療、化療及其他藥物對癥治療等），但均無明顯療效)體內，連續三天細 胞回輸總量為〇.8X107/kg，回輸后對患者的治療狀況進行評估。
[0154] 圖16為CAR133-NKT細胞對胰腺癌患者的治療效果圖，由圖16可知，胰腺癌患者經 過4周治療后瘤灶縮小，經過10周治療后腫瘤縮小更加明顯。說明CAR133-NKT細胞對胰腺癌 患者有一定的治療效果。
[0155] 以上詳細描述了本發明的優選實施方式，但是，本發明并不限于上述實施方式中 的具體細節，在本發明的技術構思范圍內，可以對本發明的技術方案進行多種簡單變型，這 些簡單變型均屬于本發明的保護范圍。
[0156] 另外需要說明的是，在上述【具體實施方式】中所描述的各個具體技術特征，在不矛 盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合，為了避免不必要的重復，本發明對各種可 能的組合方式不再另行說明。
[0157] 此外，本發明的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本 發明的思想，其同樣應當視為本發明所公開的內容。
【主權項】
1. 一種嵌合抗原受體，其特征在于，所述嵌合抗原受體為⑶133ScFV-⑶8-⑶137-⑶3ζ， 包括串聯的大鼠生長激素信號肽、⑶13 3 ScFv、⑶8的鉸鏈區和跨膜區、CD 13 7的胞內信號結 構域和CD3G的胞內信號結構域;優選地，所述嵌合抗原受體具有如SEQ ID NO. 1所示的氨基 酸序列，進一步優選地，所述嵌合抗原受體的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。2. 編碼權利要求1所述的嵌合抗原受體的基因，優選地，所述基因具有如SEQ ID NO.2 所示的核苷酸序列，進一步優選地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。3. 含有權利要求2所述的基因的重組表達載體，優選地，所述重組表達載體為慢病毒表 達載體，進一步優選地，所述慢病毒表達載體為pWPXL-CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G。4. 一種工程化CD133靶向性的NKT細胞，其特征在于，所述NKT細胞是由權利要求1所述 的嵌合抗原受體修飾的NKT細胞。5. -種工程化⑶133靶向性的NKT細胞的制備方法，其特征在于，所述方法包括： 包裝攜帶pWPXL-CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G的慢病毒，得到病毒濃縮液;利用得到的 病毒濃縮液感染NKT細胞，使NKT細胞表達嵌合抗原受體CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G。6. 根據權利要求5所述的方法，其中，所述方法還包括通過如下方法制備NKT細胞： (1) 在CD3單克隆抗體、白介素-2和白介素-15存在下，將單個核細胞進行第一階段培 養;優選地，所述第一階段培養的實施方式包括:將單個核細胞培養于第一 NKT細胞培養液 中，所述第一NKT細胞培養液含有NKT細胞培養基、CD3單克隆抗體、白介素-2和白介素-15; 進一步優選地，第一NKT細胞培養液中，所述CD3單克隆抗體的濃度為30-70ng/mL，和/或所 述白介素-2的濃度為300-700U/mL，和/或所述白介素-15的濃度為30-70ng/mL; (2) 在白介素-2存在下，將所述第一階段培養的細胞進行第二階段培養;優選地，所述 第二階段培養的實施方式包括:將所述第一階段培養的細胞培養于第二NKT細胞培養液中， 所述第二NKT細胞培養液中含有NKT細胞培養基和白介素-2;進一步優選地，第二NKT細胞培 養液中，所述白介素-2的濃度為300-700U/mL。7. 根據權利要求6所述的方法，其中，所述感染NKT細胞的方法包括： (1) 在病毒濃縮液、魚精蛋白和白介素-2存在下，將NKT細胞進行第一階段感染培養;優 選地，所述第一階段感染培養的實施方式包括:將NKT細胞培養于第三NKT細胞培養液中，所 述第三NKT細胞培養液含有NKT細胞培養基、病毒濃縮液、魚精蛋白和白介素-2;進一步優選 地，第三NKT細胞培養液中，所述白介素-2的濃度為300-700U/mL; (2) 在CD3單克隆抗體、白介素-2和白介素-15存在下，將所述第一階段感染培養的細胞 進行第二階段感染培養;優選地，所述第二階段感染培養的實施方式包括:將所述第一階段 感染培養的細胞培養于所述第一 NKT細胞培養液中。8. 根據權利要求7所述的方法，其中，所述感染NKT細胞的方法還包括： (3) 先在白介素-2存在下，將所述第二階段感染培養的細胞進行體外誘導，待細胞的密 度為80-90 %時，再在CD3單克隆抗體、白介素-2和白介素-15存在下，將細胞進行擴增培養； 優選地，所述體外誘導的實施方式包括:將所述第二階段感染培養的細胞培養于所述第二 NKT細胞培養液中，所述擴增培養的實施方式包括:將細胞培養于所述第一NKT細胞培養液 中。9. 權利要求5-8中任意一項所述方法制備得到的工程化CD 133靶向性的NKT細胞。10. 權利要求4或9所述的工程化CD133靶向性的NKT細胞在制備用于治療腫瘤的制劑中 的應用，優選地，所述腫瘤是CD133陽性的上皮腫瘤，進一步優選地，所述上皮腫瘤為結直腸 癌、肝癌、膽管癌、胰腺癌、食管癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、子宮內膜 癌、腦腫瘤、黑色素瘤或神經膠質瘤。
【文檔編號】A61P35/00GK105936649SQ201610248750
【公開日】2016年9月14日
【申請日】2016年4月20日
【發明人】韓為東, 伍志強, 王曉慧, 呂海燕, 王瑤, 羅燦, 黃建華, 陳美霞
【申請人】中國人民解放軍總醫院