一種殺蟲蛋白及其核苷酸序列和應用
【專利摘要】本發明涉及一種殺蟲蛋白，特別涉及一種對蚊類有殺蟲活性的殺蟲蛋白。其氨基酸序列為如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。本發明還提供了能夠翻譯為如本發明的殺蟲蛋白的核苷酸序列，以及包括該核苷酸序列的轉基因微生物和/或轉基因植物。
【專利說明】
一種殺蟲蛋白及其核苷酸序列和應用
技術領域
[0001 ]本發明涉及一種殺蟲蛋白，特別涉及一種對蚊類有殺蟲活性的殺蟲蛋白。
【背景技術】
[0002] 蚊類屬于昆蟲綱、雙翅目，蚊總科。其主要分為衛生害蟲和農業害蟲，例如，重要的 衛生害蟲蚊類有按蚊(Anopheles)、庫蚊(Culex)、伊蚊(Aedes);重要的農業害蟲蚊類有眼 蕈蚊(Sciaridae)，其在全國各地均有分布。
[0003] 衛生害蟲可傳播疾病的病原體以及傳播鼠疫、傷寒、瘧疾等流行病，嚴重威脅人們 的生命安全，因此其對人類危害毋庸置疑。
[0004] 而農業害蟲也深刻影響著人類的生活，以韭菜遲眼蕈蚊(Bradysia odoriphaga) 為例，其又名韭蛆、黃腳蕈蚊，屬雙翅目，眼蕈蚊科，主要危害韭菜、大蔥、洋蔥、小蔥、大蒜等 百合科蔬菜，偶爾也危害萵苣、青菜、芹菜等，是蔥蒜類蔬菜的主要害蟲之一，在全國各地均 有分布。韭菜遲眼蕈蚊的幼蟲生活在土壤表層，群集在韭菜地下部的鱗莖和柔嫩的莖部蛀 食為害。初孵幼蟲先為害韭菜葉鞘基部和鱗莖的上端;春、秋季主要為害嫩莖，導致根莖腐 爛。受害韭菜地上部分生長細弱，葉片發黃萎蔫下垂，最后韭葉枯黃死亡。夏季氣溫高時，幼 蟲向下移動，為害韭菜鱗莖，致使整個鱗莖腐爛，嚴重時整墩韭菜枯死。對于韭菜遲眼蕈蚊 的防治方法主要有物理防治(糖醋液、臭氧等)和化學防治。由于物理防治存在操作繁瑣、防 治效果受環境影響大等缺點，生產上主要采用農藥灌根等化學手段進行防治，但是由于韭 蛆繁殖快、隱蔽性強、防治難度大，導致菜農不規范或過量、甚至違規使用禁用的高毒農藥 進行防治，導致農藥殘留超標、污染環境、危害人類健康以及殺害有益鳥類等問題。另一方 面，長期大量使用化學農藥增強害蟲抗藥性、污染環境、殺傷鳥類、造成害蟲再度猖獗的惡 性循環，不能達到對害蟲種群的有效控制，同時造成韭菜農殘超標，使消費者健康受到威 脅。近年來毒韭菜事件頻發，如：2004年"香河毒韭菜事件"、2010年"青島毒韭菜"和2011年 河南南陽"毒韭菜事件"，連續的毒韭菜曝光事件，使得消費者"談韭色變"，嚴重影響了菜農 的經濟利益和消費者的食品安全。
[0005] 為了減少化學農藥對環境的污染及對人民健康的威脅，篩選對雙翅目害蟲，特別 是蚊類有高致病性的生防微生物是防治該類害蟲的有效方法和重要措施。
【發明內容】
[0006] 本發明之一提供了一種殺蟲蛋白，其氨基酸序列為如SEQ ID No.2所示的氨基酸 序列。
[0007]本發明之^提供了一種殺蟲蛋白，其氣基酸序列為與如SEQ ID No . 2所不的氣基 酸序列的一致性在78%以上，且與如SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基 酸序列;優選其氨基酸序列為與如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的一致性在95%以上，且 與如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列；特別優選其氨基酸序列 為與如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的一致性在99%以上，且與如SEQ ID No.2所示的氨 基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。
[0008] 本發明之三提供了一種核苷酸序列，所述核苷酸序列為能夠翻譯為如本發明之一 和/或本發明之二所述的殺蟲蛋白的核苷酸序列。
[0009] 在一個具體實施例中，所述核苷酸序列為如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
[0010] 本發明之四提供了一種組合物，其包括本發明之一和/或本發明之二所述的殺蟲 蛋白。在本發明中，所述組合物可以不包括保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中心，保藏編號為CGMCC No.9763的野生菌株。
[0011] 在一個具體實施例中，能夠翻譯為如所述組合物中的本發明之一的殺蟲蛋白的核 苷酸序列為如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
[0012] 本發明之五提供了一種含有本發明之三的核苷酸序列，且能產生本發明之一和/ 或本發明之二的殺蟲蛋白的轉基因微生物。例如所述殺蟲蛋白的氨基酸序列為如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。或所述殺蟲蛋白氨基酸序列為與如SEQ ID No.2所示的氨基酸序 列的一致性在78%以上，且與如SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序 列;優選其氨基酸序列為與如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的一致性在95%以上，且與如 SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列；特別優選其氨基酸序列為與 如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的一致性在99%以上，且與如SEQ ID No. 2所示的氨基酸 序列具有相同功能的氨基酸序列。
[0013] 在一個具體實施例中，所述轉基因微生物包括芽孢桿菌（Bacillus)、假單胞菌 (Pseudomonas)、腸桿菌(Escherichia)和酵母(Saccharomyces)中的至少一種。
[0014]在一個優選的具體實施例中，所述芽孢桿菌包括蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis)、枯草芽抱桿菌（Bacillus subtilis)、萎縮芽抱桿菌（Bacillus atrophaeus)和錯樣芽孢桿菌(Baci 1 lus cereus)中的至少一種;所述假單胞菌包括焚光假 單胞桿菌(Pseudomonas fluorescens);所述腸桿菌包括大腸桿菌(Escherichia coli)。
[0015] 本發明之六提供了根據本發明之三的核苷酸序列在制備轉基因植物中的應用，其 中，所述轉基因植物能夠產生根據本發明如上的殺蟲蛋白。例如其氨基酸序列為如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。或其氨基酸序列為與如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的一致性 在78%以上，且與如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列;優選其氨 基酸序列為與如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的一致性在95%以上，且與如SEQ ID No.2 所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列；特別優選其氨基酸序列為與如SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列的一致性在99 %以上，且與如SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列具有 相同功能的氨基酸序列。
[0016] 在一個優選的具體實施例中，所述轉基因植物包括百合科（Liliaceae)、姜科 (Zingiberaceae)、菊科（Compositae)、萌蘆科（Cucurbitaceae)和傘形科（Umbel 1 iferae) 中的至少一種。
[0017] 在一個優選的具體實施例中，所述百合科植物包括蔥屬(A11 ium);更優選包括韭 菜（Allium tuberosum)、大蔥（Allium fistulosum)、小香蔥（Allium ascalonicum)、洋蔥 (Allium cepa)和大蒜（Allium sativum)中的至少一種。
[0018] 在一個優選的具體實施例中，所述姜科包括姜屬(Zingiber)、山姜屬(Alpinia)、 豆蔻屬（Amomum)、大豆蔻屬（Hornstedtia)、偏穗姜屬（Plagiostachys)、直唇姜屬 (Pommereschea)、卩彖花姜屬（Rhynchanthus)和茴香砂仁屬（Achasma);更優選包括姜 (Zingiber officinale)和/或山姜（Alpinia japonica Miq) 〇
[0019]在一個優選的具體實施例中，所述菊科包括萬苣屬(Lactuca);優選包括結球生菜 (Lactuca sativa L. var .capitata L)、直立生菜（Lactuca sativa var. c romanaHort)和 萬苣（Lactuca sativa)中的至少一種。
[0020]在一個優選的具體實施例中，所述萌蘆科包括萌蘆屬（Lagenaria)、黃瓜屬 (Cucumis)、冬瓜屬(Benincasa)、南瓜屬(Cucurbita)、絲瓜屬(Luffa)、西瓜屬(Citrullus) 和甜瓜屬（Cucumis)中的至少一種；優選包括萌蘆（Lagenaria siceraria)、黃瓜（Cucumis sativus L. var · sativus)、冬瓜（Benincasa hispida)、南瓜（Cucurbita moschata)、絲瓜 (Luffa cylindrica)、西瓜（Citrullus lanatus)和甜瓜（Cucumis melo)中的至少一種； [0021]在一個優選的具體實施例中，所述傘形科包括序屬(Apium)，優選包括歐序(Apium petroselinum)和/或香序（Apium graveolens) 〇
[0022] 本發明之七提供了一種制備本發明之一和/或本發明之二所述的殺蟲蛋白的方 法，其包括利用本發明之五的轉基因微生物，和/或利用本發明之六所述的應用中的轉基因 植物來生產所述殺蟲蛋白；優選還包括在利用所述轉基因微生物和/或轉基因植物生產所 述殺蟲蛋白后，純化所述殺蟲蛋白使所述殺蟲蛋白的純度達到80%以上，更優選使所述殺 蟲蛋白的純度達到90 %以上，甚至是使所述殺蟲蛋白的純度達到99 %以上。
[0023] 本發明之八提供了本發明之一和/或本發明之二所述的殺蟲蛋白，本發明之四的 組合物，本發明之五的轉基因微生物，以及本發明之六中的轉基因植物中的至少一種在防 治雙翅目害蟲;優選防治蚊類害蟲;特別優選防治眼蕈蚊(Sciaridae)中的應用。
【具體實施方式】
[0024]從河北省南宮市韭菜遲眼蕈蚊害蟲嚴重的韭菜田中采集韭菜遲眼蕈蚊，其飼養方 法的參照文獻為："慕衛，劉峰，賈忠明，何茂華，相冠鋒;韭菜遲眼蕈蚊簡便人工飼養技術， 華東昆蟲學報，2003，12(2) :87-89"。
[0025] 蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis)，菌株JQD117于2014年10月14日保藏 于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址:北京市朝陽區北辰西路1號 院3號中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 9763。
[0026] 基因的克隆與表達：
[0027] 以JQD117菌株基因組DNA為模板，利用引物cry39AF: AACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAATTCATACGAGAATAAAAA,cry39AR： TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTAATTGGTAAACAGATCGTTCA，進行 PCR 擴增，94 °C 預變性 5min，94°C lmin，54°C lmin，72°C 2min，30個循環，72°C，10min 1CR產物純化，克隆cry39A型 (SEQ ID No.l)基因至pET21b載體，命名pET21cry39A。并最后將該重組質粒轉化之大腸桿 菌Rosetta(DE3)。
[0028] 經測序分析，cry39A基因長度1986bp，其編碼蛋白為Cry39A，共661個氨基酸（SEQ ID No.2)，表達72.82KD蛋白。
[0029] 將上述基因在大腸桿菌Rosetta(DE3)中進行表達，SDS-PAGE電泳結果發現， cry39A基因在可溶和不可溶性組份中均表達;其中表達產物約75kDa左右蛋白，與預期結果 相符。陰性對照（即不含有cry39A基因的大腸桿菌Rosetta(DE3))在可溶和不可溶性組份中 都沒有相應蛋白的表達條帶。
[0030] LB固體培養基配方:胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，瓊脂粉15g，水1L， ρΗ7·2〇
[0031] LB液體培養基配方:胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，水1L，ρΗ7.2。
[0032]上述培養基菌在121°C的條件下滅菌20-30min后備用。
[0033] Cry39A殺蟲蛋白對韭蛆二齡幼蟲的活性測定
[0034] I.含有Cry39A蛋白的菌液制備
[0035]將攜帶cry39A基因基因的大腸桿菌Rosetta(DE3)菌株以1%的接種量接種于LB液 體培養基中，37°C培養至0D6qq值達到0.5-1.0之間時，加入誘導物50mM IPTG，在150rpm，20 °C低溫下誘導12h。然后在4°C下，8000rpm離心3min。離心收集菌體，加入50mM Tris · Cl(pH 8.0)懸浮;破碎菌體(利用超聲波常規完全破碎），將超聲破碎后的菌液在4°C下12，OOOrpm 離心15min;然后收集上清液。按照常規方法對所述上清液進行SDS-PAGE定量分析。具體參 照蛋白定量試劑盒(DC Protein Assay)的使用說明，以牛血清蛋白（BSA)為標準蛋白制作 蛋白濃度標準曲線，測定大腸桿菌Rosetta (DE3)重組菌株中總蛋白的濃度。結合 ImageMaster VDS軟件分析SDS-PAGE中目的蛋白所占比例，計算目的蛋白，即Cry39A的濃 度。
[0036] II.活性測定
[0037]采用浸漬法進行生測：將步驟I中制備的上清液配制成系列濃度300mg/L、150mg/ 1^、6〇11^凡、3〇11^凡、1511^凡，然后將21111至51]11^稀釋為上述系列濃度的上清液分別置于5個離 心管中，將韭菜莖剪成2cm小段放入其中震蕩浸泡3min，取出放入滅菌的上下均鋪有水瓊脂 和雙層濾紙的90mm培養皿中。以與超聲破碎后的Rosetta(DE3)上清液（即不含有Cry39A殺 蟲蛋白）作為陰性對照。每皿接入20頭2齡健康的韭菜遲眼蕈蚊(Bradysia odoriphaga)幼 蟲(俗稱韭蛆），于溫度為(24 ± 1) °C、濕度為75-85%、光周期為光照：黑暗=14:10的光照培 養箱中飼養，于接蟲后72h調查記錄韭蛆的死亡情況，測定不同菌液濃度下的韭蛆死亡率。 之后利用POLO Plus軟件算出Cry39A對2齡韭蛆的LC5Q，具體結果見表1。
[0038] 表lCry39A蛋白對韭菜遲眼蕈蚊幼蟲LC5Q測定
[0039]
【主權項】
1. 一種殺蟲蛋白，其氨基酸序列為如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。2. -種殺蟲蛋白，其氨基酸序列為與如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的一致性在 78%以上，且與如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列;優選其氨基 酸序列為與如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的一致性在95%以上，且與如SEQ ID No.2所 示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列;特別優選其氨基酸序列為與如SEQ ID No.2 所示的氨基酸序列的一致性在99%以上，且與如SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列具有相同 功能的氨基酸序列。3. -種核苷酸序列，所述核苷酸序列為能夠翻譯為如權利要求1或2所述的殺蟲蛋白的 核苷酸序列。4. 根據權利要求3所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列為如SEQ ID No.1 所示的核苷酸序列。5. -種組合物，其包括如權利要求1或2所述的殺蟲蛋白；優選能夠翻譯為所述殺蟲蛋 白的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。6. -種含有根據權利要求3或4所述的核苷酸序列，且能產生如權利要求1或2所述的殺 蟲蛋白的轉基因微生物。7. 根據權利要求6所述的轉基因微生物，其特征在于，所述轉基因微生物包括芽孢桿菌 (Bacillus)、假單胞菌(Pseudomonas)、腸桿菌(Escherichia)和酵母(Saccharomyces)中的 至少一種； 優選所述芽孢桿菌包括蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)、枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)、萎縮芽抱桿菌(Bacillus atrophaeus)和錯樣芽抱桿菌(Bacillus cereus)中的至少一種;所述假單胞菌包括焚光假單胞桿菌(Pseudomonas fluorescens); 所述腸桿菌包括大腸桿菌(Escherichia coli) D8. 根據權利要求3或4所述的核苷酸序列在制備轉基因植物中的應用，其中，所述轉基 因植物能夠產生根據權利要求1或2所述的殺蟲蛋白；所述轉基因植物包括百合科 (1^11&。6&6)、姜科（2；[邱；^6以。6&6)、菊科（〇3111卩08；^&6)、葫蘆科（〇1。111'13；^&。6&6)和傘形 科(Umbel 1 if erae)中的至少一種； 優選所述百合科包括蔥屬（Allium);更優選包括韭菜（Allium tuberosum)、大蔥 (Allium fistulosum)、小香蔥(Allium ascalonicum)、洋蔥(Allium cepa)和大蒜(Allium sativum)中的至少一種； 優選所述姜科包括姜屬（Zingiber)、山姜屬(Alpinia)、豆蔻屬(Amomum)、大豆蔻屬 (!1〇1'118七6(^1&)、偏穗姜屬（？1&8；!_08七&(31178)、直唇姜屬（？01111116^8(3116&)、卩彖花姜屬 (Rhynchanthus)、茴香砂仁屬(Achasma);更優選包括姜(Zingiber off icinale)和/或山姜 (Alpinia japonica Miq)； 優選所述菊科包括萬苣屬（Lactuca);更優選包括結球生菜（Lactuca sativa L · var · capitata L)、直立生菜（Lactuca sativa var. c romanaHort)和萬苣（Lactuca sat iva)中的至少一種； 優選所述葫蘆科包括葫蘆屬（Lagenaria)、黃瓜屬（Cucumis)、冬瓜屬（Benincasa)、南 瓜屬((^11(3111'13；^3)、絲瓜屬(1^^€3)、西瓜屬((^；^1'1111118)和甜瓜屬(〇1(31111118)中的至少一種； 更優選包括葫蘆（Lagenaria siceraria)、黃瓜（Cucumis sativus L. var · sativus)、冬瓜 (Benincasa hispida)、南瓜（Cucurbita moschata)、絲瓜（Luffa cylindrica)、西瓜 (Citrullus lanatus)和甜瓜（Cucumis melo)中的至少一種； 優選所述傘形科包括序屬(Apium)，更優選包括歐序(Apium petroselinum)和/或香序 (Apium graveolens)。9. 一種制備如權利要求1或2所述的殺蟲蛋白的方法，其包括利用根據權利要求6或7所 述的轉基因微生物，和/或利用根據權利要求8所述的應用中的轉基因植物來生產所述殺蟲 蛋白；優選還包括在利用所述轉基因微生物和/或轉基因植物生產所述殺蟲蛋白后，純化所 述殺蟲蛋白使所述殺蟲蛋白的純度達到80 %以上，更優選使所述殺蟲蛋白的純度達到90 % 以上，甚至是使所述殺蟲蛋白的純度達到99 %以上。10. 根據權利要求1或2所述的殺蟲蛋白，根據權利要求5所述的組合物，根據權利要求6 或7所述的轉基因微生物，以及根據權利要求8所述的應用中的轉基因植物中的至少一種在 防治雙翅目害蟲;優選防治蚊類害蟲;特別優選防治眼蕈蚊(Sciaridae)中的應用。
【文檔編號】A01N47/44GK105936644SQ201610537583
【公開日】2016年9月14日
【申請日】2016年7月9日
【發明人】杜立新, 宋健, 曹偉平, 王金耀, 馮書亮
【申請人】河北省農林科學院植物保護研究所