癌細胞的獲得方法
【專利摘要】本發明的目的在于，不論癌的種類均能在短時間內充分獲得在使用癌細胞的抗癌作用的評價方法的培養工序中可適當培養的細胞。本發明提供在評價藥物對癌細胞的抗癌作用的方法中所用的癌細胞的獲得方法，其特征在于，該獲得方法包括：(a)將經細切處理后的來自癌組織的試樣化學破碎的工序、(b)將由工序(a)所得的試樣物理破碎的工序、以及(c)將由工序(b)所得的試樣化學破碎的工序。
【專利說明】
癌細胞的獲得方法
技術領域
[0001] 本發明設及癌細胞的獲得方法。更具體而言，本發明設及在評價藥物對癌細胞的 抗癌作用的方法中所用的癌細胞的獲得方法。
【背景技術】
[0002] 抗癌劑雖然有時也作用于正常細胞而顯示出強副作用，但已知抗癌劑的有效率除 部分情況W外均小于50%，抗癌劑的效力情況根據不同患者而有很大差異。所W，要求避免 無效抗癌劑的不必要給藥，減輕患者身體上、經濟上的負擔，防止治療機會的錯失。因此，在 癌癥患者接受抗癌劑給藥的治療之前，評價預定給藥的抗癌劑對該癌癥患者是否有效的抗 癌劑敏感性試驗非常重要。
[0003] 抗癌劑敏感性試驗典型地是使利用手術等取出的癌組織在體外（in Wtro)增殖 后，施用各種抗癌劑，對癌細胞的生死進行評價。
[0004] 抗癌劑敏感性試驗可列舉出SDr法、HDRA法、CD-DST法、ATP法等。例如，CD-DST法記 載于專利文獻1~11等中，其顯示出較高技術，但對于W實用水平進行操作來說仍是不穩定 的技術。為了在運些抗癌劑敏感性試驗中進行準確評價，需要使癌細胞W良好的狀態進行 增殖。對于作為臨床檢查W實用水平進行的操作，要求確實地完成細胞培養、即便是腫瘤量 少的活檢也能確保進行抗癌劑敏感性試驗所需的細胞量、可同時對多檢體進行評價。
[0005] 現有技術文獻 專利文獻 專利文獻1:日本特許2879978號公報 專利文獻2:日本特開平3-285696號公報 專利文獻3:日本特開平7-31470號公報 專利文獻4:日本特開平7-241190號公報 專利文獻5:日本特開平10-115612號公報 專利文獻6:日本特開2003-9853號公報 專利文獻7:日本特開2008-11797號公報 專利文獻8:日本特開2005-95058號公報 專利文獻9:日本特開2010-227088號公報 專利文獻10:日本特開2011-115106號公報 專利文獻11:國際公開第2011/090068號。
【發明內容】
[0006] 發明要解決的問題 作為抗癌劑敏感性試驗之前的工序，需要從癌組織提取癌細胞的組織分散工序。此處， 癌組織通常由實質和間質構成，實質由增殖的癌細胞組成，間質由膠原纖維等細胞外基質、 產生運些細胞外基質的成纖維細胞、糖蛋白、黏多糖類等組成。癌組織的硬度多種多樣，若 富含膠原纖維等間質則變硬，若富含實質細胞則變軟。
[0007] 在W往的方法中，例如用剌刀等將組織切碎至成為糊狀后，進行酶處理將細胞外 基質消化，實施組織分散。但是，運種切碎處理不論間質的多少都會對細胞造成直接損傷， 而且也會造成由培養基枯竭引起的干燥等損傷。在間質多的試樣的情況下，由于達到糊狀 需要耗費時間，因此損傷變得嚴重。均有在之后的培養工序中無法對細胞進行適當培養的 情況。
[0008] 假如為了減輕對細胞造成的損傷而在短時間內結束切碎處理，則間質與細胞的分 離不充分，有在之后的培養工序中無法對細胞進行適當培養的情況。
[0009] 本發明的目的在于，提供不論癌的種類都能夠W比W往方法損傷少的狀態獲得在 抗癌劑敏感性試驗中所用的癌細胞的方法。
[0010] 用于解決問題的方案 W往的方法中，通過用剌刀等物理方式將癌組織切碎成糊狀，在將間質切斷而使細胞 露出的同時將組織片切小，提高下一工序中進行的利用酶的消化反應的效率。然而，有時在 后續工序中無法對腫瘤細胞進行適當培養。本發明人進行了深入研究，結果發現在W往的 方法中，該切碎處理對癌細胞本身造成的損傷、由于培養基的枯竭而對細胞造成的損傷、進 而來自受損傷的細胞的滲漏物對后續培養工序帶來的不良影響是無法進行適當培養的原 因。
[0011] 另外還發現，在間質多的試樣的情況下，用剌刀切碎癌組織需要比通常更多的時 間，因此對細胞造成的損傷很大。進而，即使用剌刀等進行切碎處理對組織的切斷也不夠， 有時適于培養的狀態的細胞的獲得量低。
[0012] 本發明人根據運些見解進一步進行了深入研究，結果發現與W往的方法不同，通 過進行化學破碎處理，接著進行物理組織破碎，再次進行化學破碎處理，從而不論癌的種 類，均可獲得損傷少的細胞。更詳細而言，本發明的方法通過包含W下處理的工序來進行破 碎：首先進行酶處理等化學處理，使間質分解一定程度，間質松弛后再次利用吸管吹打 (pipetting)等物理破碎處理將組織破碎，再次進行酶處理等化學處理。本發明的方法可W 不進行切碎處理，可在維持細胞團塊的狀態將其取出。另外，能夠在培養基內進行細切處理 后的所有處理，并能夠防止由培養基的枯竭引起的損傷。由此，認為可W在減輕損傷的同時 效率良好地提取癌細胞。
[0013] 目P，本發明的第一方式提供在評價藥物對癌細胞的抗癌作用的方法中所用的癌細 胞的獲得方法，其特征在于，該獲得方法包括： (a) 將經細切處理后的來自癌組織的試樣化學破碎的工序、 (b) 將由工序(a)所得的試樣物理破碎的工序、W及 (C)將由工序(b)所得的試樣化學破碎的工序。
[0014] 另外，本發明的第二方式提供第一方式所述的方法，其中，還包括將由工序(C)所 得的試樣物理破碎的工序作為工序(d)。
[0015] 另外，本發明的第=方式提供第一方式或第二方式的方法，其中，工序(a)中化學 破碎的來自癌組織的試樣是未經切碎(mince)處理的試樣。
[0016] 另外，本發明的第四方式提供第一方式至第=方式中任一方式所述的方法，其中， 工序(a)和工序(C)的化學破碎是由含酶組合物進行的處理。
[0017] 另外，本發明的第五方式提供第一方式至第四方式中任一方式所述的方法，其中， 工序(a)的化學破碎進行10分鐘~60分鐘。
[0018] 另外，本發明的第六方式提供第一方式至第五方式中任一方式所述的方法，其中， 工序(b)的物理破碎平穩地進行10秒~3分鐘。
[0019] 另外，本發明的第屯方式提供第一方式至第六方式中任一方式所述的方法，其中， 工序(C)的化學破碎進行10分鐘~60分鐘。
[0020] 另外，本發明的第八方式提供第一方式至第屯方式中任一方式所述的方法，其中， 還包括將由工序(C)或(d)所得的試樣在支持物上進行培養，獲得附著于支持物的細胞的工 序。
[0021] 另外，本發明的第九方式提供評價藥物對癌細胞的抗癌作用的方法，該方法包括 對采用第一方式至第八方式中任一方式所述的方法獲得的癌細胞進行培養，使藥物作用于 培養后的癌細胞的工序。
[0022] 另外，本發明的第十方式提供評價藥物對癌細胞的抗癌作用的方法，該方法包括 將采用第一方式至第八方式中任一方式所述的方法獲得的癌細胞包埋于滴塊狀(滴塊狀） 凝膠中進行培養，使藥物作用于培養后的癌細胞的工序。
[0023] 發明的效果 根據本發明的方法，在用于抗癌劑敏感性試驗的細胞的培養工序中，不論癌的種類均 能從來自癌組織的試樣中獲得可適當培養的細胞。此外，即使在可從癌癥患者獲得的癌組 織較少的情況下，也能W高概率提供可供于抗癌劑敏感性試驗的細胞。而且，還能夠將組織 分散處理所需時間縮短為少于現有技術，因此還可期待大量進行試驗時的時間縮短效果。
【附圖說明】
[0024] 圖1是表示比較例1、實施例1、2中預培養后的細胞的照片。照片上部的試樣編號對 應于表5所記載的試樣編號。
【具體實施方式】
[0025] 本發明提供癌細胞的獲得方法。所獲得的癌細胞用于藥物對癌細胞的敏感性試 驗。使用經本發明所得的細胞的敏感性試驗的種類沒有特別限定，優選為進行=維培養的 試驗。進行=維培養的試驗包括例如對包埋癌細胞的滴塊狀凝膠中癌細胞的培養結果進行 評價。更優選而言，敏感性試驗為CD-DST法。
[0026] 供于本發明的方法的癌組織的種類沒有特別限定。舉例而言，可列舉出消化系統 癌、頭頸癌、乳癌、肺癌、癌性胸/腹膜炎、子宮頸癌、子宮體癌、卵巢癌等實體癌。本發明的方 法特別適合于硬癌。作為來自癌組織的試樣，例如可列舉出手術材料的全部或一部分、活檢 試樣的全部或一部分等。作為手術材料，例如可W使用在進行W治療為目的的外科切除術 時取出的組織。另外，為了病理診斷、疾病的治療和經過預后的判定等目的，可W使用利用 微創采集法W試驗切除方式、試驗穿刺方式采集的組織。作為利用微創采集法采集的組織， 可列舉出各種活檢試樣、胸腔鏡下或腹腔鏡下材料、從腹水和胸水等得到的試樣等。試樣可 W是從機體采集后，進行了使用剪刀、綴子和剌刀等的細切處理等機械分離處理的試樣。另 夕h試樣還可W是用含有培養基成分、抗生素的洗涂液進行了洗涂的試樣。
[0027] 本發明的癌細胞的獲得方法，作為工序(a),包括將來自癌組織的試樣化學破碎的 工序。
[0028] 工序(a)中化學破碎的試樣優選為經細切處理后的試樣。通過在工序(a)中使用經 細切處理后的試樣，可提高所獲得的細胞的回收量。特別在硬癌中，在采用了細切處理的試 樣的情況下，細胞的回收率有顯著提高的趨勢。經細切處理后的來自癌組織的試樣，可在從 癌癥患者中采集后，使用剪刀、綴子和剌刀等切斷器具而獲得。對于經細切處理后的來自癌 組織的試樣而言，優選Imm~IOmm見方、更優選2mm~8mm見方、進一步優選3mm~5mm見方的細切 的組織在經細切處理后的來自癌組織的試樣中的含量優選為80重量％^上、更優選為90重 量％^上、進一步優選為95重量％W上。
[0029] 工序(a)中化學破碎的試樣優選為未進行切碎處理的試樣。通過使用未進行切碎 處理的試樣，可獲得損傷少、在后續培養工序中適當增殖的癌細胞。根據本發明的工序(a), 癌組織的間質組織被分解，組織整體的結合力松弛，可利用較小的物理力進行后續物理破 碎，因此即使在使用未進行切碎處理的試樣的情況下，不論癌組織的種類，均可獲得足夠量 的癌細胞。
[0030] 工序(a)可W不在培養基的存在下進行，也可W在培養基的存在下進行。通過在培 養基的存在下進行工序(a),可W防止由于培養基的枯竭造成的對癌細胞的損傷，故優選。 培養基只要是用于癌細胞的培養、增殖、保存的培養基則其狀態、種類沒有特別限定。優選 培養基為液體培養基。作為優選的培養基之例，可列舉出DF培養液(DF:1容量(容)DuAecco 的改良的化g 1 e (DME)培養液與1容量Ham ' S Fl 2培養液的混合培養液)等。
[0031] 由于能夠防止對癌細胞的損傷，因此工序(a)的時間沒有特別限定。可W花費比W 往方法更長的時間，也可W是更短的時間。作為優選的工序(a)的時間之例，可列舉出10分 鐘~120分鐘、10分鐘~60分鐘、10分鐘~30分鐘等。更優選工序(a)的時間為10分鐘~60分鐘。
[0032] 工序(a)的化學破碎是指將細胞間質化學分解，使癌細胞露出的處理。優選工序 (a)的化學破碎通過使用含酶組合物的處理來進行。
[0033] 作為組合物中所含的酶，可列舉出膠原酶、分散酶、彈性蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、膜 蛋白酶等蛋白酶、脫氧核糖核酸酶等溶核酶(核酸分解酵素）、透明質酸酶。運些酶可W單獨 也可W組合。優選組合物含有膠原酶。作為膠原酶，可W使用來自梭菌、來自放線菌等的任 意膠原酶。另外，膠原酶的純度可W采用任意純度，最好含有粗純化的膠原酶。酶活性可由 本領域技術人員考慮細胞的種類、處理所需時間等進行適當調整。
[0034] 由含酶組合物進行的處理時間沒有特別限定。作為優選的處理時間之例，可列舉 出10分鐘~120分鐘、10分鐘~60分鐘、10分鐘~30分鐘、15分鐘~30分鐘等。由含酶組合物進行 的處理的溫度可由本領域技術人員根據所用的酶適當調整。作為優選的處理溫度之例，可 列舉出30°C~40°C、32°C~38°C。通過由含酶組合物進行的處理，能夠使間質的結合松弛，之 后即使不成為糊狀也能從癌組織的試樣中有效地使癌細胞露出。因此，即使在目標癌為具 有硬的間質組織的硬癌的情況下，也無需為了成為糊狀而進行強力的物理處理，不論癌組 織的種類，均可獲得損傷少的癌細胞。
[0035] 本發明的方法，作為工序(b)，包括將由工序(a)所得的試樣物理破碎的工序。物理 破碎可W使用剌刀等刀具進行，也可W不用剌刀等刀具進行。例如，可W通過吸管吹打或使 用裝置的混合等進行。由吸管吹打進行的物理破碎可W使用一次性吸管等進行吸管吹打。 由吸管吹打進行的物理破碎，更具體而言，可W將試樣放入離屯、管等容器中，進行多次、例 如10~20次吸管吹打。另外，由混合進行的物理破碎可W使用自動分散裝置進行混合。由混 合進行的物理破碎，更具體而言，可W利用裝置的程序改變節奏，進行10秒~3分鐘、優選為 30秒~2分鐘。
[0036] 本發明的方法中，通過工序(a)的化學破碎，試樣的間質組織被分解，組織整體的 結合力松弛，因此工序(b)中使用的物理力可W相對較弱。通過減弱物理力，可W減輕對癌 細胞的損傷，提高后續培養工序中適當增殖的癌細胞的獲得效率。另外，本發明中，無需進 行切碎處理，物理力可W減弱，因此能夠在短時間內結束試樣的組織分散處理。進而，由于 W往的工序中必須進行切碎處理，因此必須用人工進行而無法自動化。本發明的工序(b)可 W用人工進行，但不用人工進行也能得到所需結果。因此，本發明的工序(b)可作為W大量 試樣為對象的自動處理來進行，還可期待進一步縮短處理時間。
[0037] 工序(b)的物理破碎可W在工序(a)的化學破碎所用的含酶組合物、培養基等的存 在下進行。在此情況下，工序(a)的處理和工序(b)的處理可W在同一反應容器內進行，可W 更加簡便且短時間地進行本發明的方法。
[0038] 本發明的方法，作為工序k)，包括將由工序(b)所得的試樣化學破碎的工序。工序 (C)的化學破碎可W是與上述工序(a)的處理相同的處理。具體的條件可與上述工序(a)相 同，也可W改變。
[0039] 通過工序（C)的化學破碎，可W將覆蓋細胞的間質分解，減弱試樣的組織間結合 力，有效地使癌細胞露出。本發明中，通過工序(a)的化學破碎W及之后的工序(b)的物理破 碎，從而工序(C)中破碎的試樣適度松弛，成為易露出癌細胞的試樣，因此工序k)的化學破 碎可在較短時間內結束。工序(C)的時間沒有特別限定。作為優選的工序k)的時間之例，可 列舉出10分鐘~120分鐘、10分鐘~60分鐘、10分鐘~30分鐘、15分鐘~30分鐘等。更優選工序 (C)的時間為10分鐘~60分鐘。在進行利用含酶組合物的處理時，處理溫度可由本領域技術 人員根據所用的酶適當調整。作為優選的處理溫度之例，可列舉出30°C~40°C、32°C~38°C。
[0040] 工序(C)的化學破碎可W在工序(a)的化學破碎所用的含酶組合物、培養基等的存 在下，在工序(b)的物理破碎所用的反應容器中直接進行。在此情況下，可W縮減重新追加 含酶組合物或培養基的時間、W及改變反應容器的時間，從而能夠更加簡便地實施本發明 的方法。另外，還可W縮短本發明方法的整體工序所需的時間，可W減少從試樣獲得的癌細 胞所受的損傷的總量，能夠提高后續培養工序中適當增殖的細胞的獲得效率。
[0041] 本發明的方法優選的是，作為工序(d)包括將由工序(C)所得的試樣物理破碎的工 序。工序(d)的物理破碎為與上述工序(b)的處理相同的處理。具體的條件可與上述工序(b) 相同，也可W改變。本發明的方法中，通過工序(d)的物理破碎，將結合力因工序(C)的化學 破碎而減弱的間質組織切斷，癌細胞露出。利用工序(d)的物理破碎來進行癌細胞的露出， 因此即使在工序(C)的化學破碎只進行了較短時間的情況下，也能從試樣中獲得大量癌細 胞。通過使工序(C)的化學破碎在較短時間內結束，可W降低對癌細胞的損傷，能夠提高后 續培養工序中適當增殖的細胞的獲得效率。由此，工序(d)可W起到縮短工序(C)的化學破 碎時間、提高所需細胞的獲得效率的作用。
[0042] 工序(d)的物理破碎可在工序(C)的化學破碎所用的含酶組合物、培養基等的存在 下進行。在此情況下，工序(d)的處理和工序(C)的處理可在同一反應容器內進行，能夠更加 簡便且短時間地進行本發明的方法。
[0043] 上述的工序(a)~(C)、W及根據需要的（d)可W連續進行，也可W在某工序結束后 間隔數分鐘~數天后再進行下一工序。因此，由本發明的方法進行的癌細胞的分散處理所花 費的時間沒有特別限定。在某實施方式中，通過本發明的方法，能夠使癌細胞的分散處理的 時間比W往的方法更短。作為由本發明進行的分散處理的時間之例，可列舉出20分鐘至6小 時、20分鐘至3小時、20分鐘至2小時、20分鐘至1小時30分鐘、20分鐘至1小時等。
[0044] 本發明中，將癌細胞從細切處理后至投入培養基的時間沒有特別限定。在某實施 方式中，通過本發明的方法，能夠使將癌細胞從細切處理后至投入培養基的時間比W往的 方法更短。本發明中，將癌細胞從細切處理后至投入培養基的時間沒有特別限定，例如可列 舉出小于6小時、小于3小時、小于1小時、小于30分鐘、小于15分鐘、小于10分鐘、小于5分鐘、 小于3分鐘、小于1分鐘等。
[0045] 通過進行W上的工序(a)~(C)、根據需要的工序(d)的本發明的方法，可W得到損 傷低于W往方法的癌細胞。可W對該癌細胞進行培養，得到用于抗癌劑敏感性試驗的癌細 胞。
[0046] 在【具體實施方式】中，通過將采用本發明的方法得到的細胞在支持物上進行培養， 獲得附著于支持物的細胞，從而能夠獲得在后續培養工序中適當增殖的細胞。通過在支持 物上進行培養時，獲得附著于支持物的細胞，可W將試樣中所含的間質細胞、死亡細胞、受 損傷而增殖性不好的細胞等除去，在后續培養中，能夠在適合于藥物敏感性試驗的狀態下 進行增殖，W高概率獲得含有可成功進行抗癌作用評價的癌細胞的組合物。培養癌細胞的 支持物可層狀涂布有細胞粘附因子。作為細胞粘附因子，可優選列舉出各種類型的膠原、纖 連蛋白、層粘連蛋白、玻連蛋白、巧黏著蛋白、明膠、膚、W及整聯蛋白等細胞外基質，運些細 胞粘附因子可W僅使用一種，也可W并用兩種W上，但從細胞粘附性、細胞伸展性進一步提 高的觀點出發，更優選使用各種膠原，在各種膠原中，特別優選使用I型膠原或IV型膠原。支 持物的表面所涂布的細胞粘附因子可與滴塊狀凝膠中的膠凝劑相同。
[0047] 粘附于支持物的細胞的獲得，例如可通過W下方式進行:將含有血細胞、無用細胞 成分等的培養液除去后，添加細胞的剝離劑，將粘附于支持物的細胞剝離。作為細胞的剝離 劑，例如可列舉出EDTA-膜蛋白酶等。在支持物上有涂布物的情況下，粘附于支持物的細胞 的剝離可通過添加涂布物的剝離劑來進行。在支持物的涂布物為膠原的情況下，涂布物的 剝離劑例如為膠原酶。通過添加膠原酶進行細胞剝離時，在作用于活細胞之前，會將活細胞 所粘附的膠原-凝膠層本身酶解，從而對活細胞的損傷較少。
[0048] 通過獲得附著于支持物的細胞而得到的、含有癌細胞的組合物即使不經過后續進 一步分離或純化，也能夠直接包埋于滴塊狀凝膠中培養，進行抗癌作用的敏感性試驗。由 此，若使用通過獲得附著于支持物的細胞而得到的組合物，則可用較少工序進行抗癌作用 的敏感性試驗，能夠從來自癌組織的試樣中獲得癌細胞，將到開始培養為止(開始培養之 前)的時間縮短，因此能夠進一步減輕細胞所受的損傷，不但可W提高抗癌作用的敏感性試 驗的成功概率，還可W評價大量試樣。
[0049] 本發明的另一方式還提供使用所得的癌細胞來評價藥物對癌細胞的抗癌作用的 方法。該方法包括對所得的癌細胞進行培養，還包括使目標藥物作用于培養后的癌細胞。優 選使藥物在體外（in W tro)作用。優選的實施方式中，該方法包括將所得的細胞包埋于滴 塊狀凝膠中進行培養的工序。
[0050] 在具體的實施方式中，使用由本發明的獲得方法得到的癌細胞的評價藥物對癌細 胞的抗癌作用的方法，可W通過包括W下工序的方法來進行： (A) 將獲得的癌細胞包埋于滴塊狀凝膠中的工序、 (B) 使由工序(A)所得的滴塊狀凝膠與含藥物的溶液接觸的工序、 (C) 在經過工序(B)后的滴塊狀凝膠中培養癌細胞的工序、W及 (D) 對工序(C)的培養結果進行評價的工序。
[0051] 作為上述工序(A)的滴塊狀凝膠，例如可列舉出在平面基材上顯示出凸表面的形 狀的凝膠。滴塊狀凝膠的體積之一例為3~30化L、3~15化L、5~10化L、15~5化L等。滴塊狀凝膠 的高度例如為2mmW下。作為滴塊狀凝膠，例如可列舉出對400nm的光顯示出透過率為1~95% 的透明度的滴塊狀凝膠。從兼顧操作的容易性和維持作為滴塊狀凝膠的形狀的觀點出發， 滴塊狀凝膠的粘度例如為50~2000厘泊、100~1000厘泊等。滴塊狀凝膠可含有膠凝劑。作為 膠凝劑，可列舉出I型膠原、基質膠(Matrigel)等細胞外基質、軟瓊脂等。從兼顧維持作為滴 塊狀凝膠的形狀的觀點出發，滴塊狀凝膠中膠原的含量例如為0.1~2.0重量％。進而，滴塊狀 凝膠可W含有多糖類及其他細胞外基質等高分子材料、血清培養基等培養基成分等。滴塊 狀凝膠可利用例如緩沖液等設定為例如pH 6.2~7.6、pH 6.8~7.4等。滴塊狀凝膠的鹽強度 (塩強度)或離子強度例如為100~ISOmmol、140~ieOmmol等。
[0052] 上述工序(A)中癌細胞的包埋例如可通過W下方式進行:將含有膠凝劑的溶液與 癌細胞等成分混合，對所得混合液進行冰冷卻，用吸管滴在基材上，在30~45°C下靜置30分 鐘~2小時。基材為具備可將滴塊狀凝膠固定的表面的基材。作為基材，例如可列舉出陪替氏 培養皿(petri dish)、多孔培養皿(multi-dish)等培養皿;玻瓶(flask)及其他常用培養容 器;玻璃或塑料制薄片狀蓋片或細胞盤(cell disk)等培養板等。從易于評價癌細胞的培養 結果的觀點出發，基材優選為光學透明的基材。包埋癌細胞的滴塊狀凝膠中癌細胞的濃度 例如為O7細胞/mL、優選為IO2~IO6細胞/mL。
[0053] 上述工序(B)中的藥物是待評價對癌細胞的抗癌作用的藥物。作為對癌的治療、預 防、或改善劑，除了直接作用于癌細胞的抗癌劑W外，還可列舉出不直接攻擊癌細胞，但通 過與機體內的免疫細胞或其他藥物的協作作用，發揮抑制癌細胞的增殖、減緩癌細胞的活 動、或者殺死癌細胞的功能的藥物。作為抗癌劑，例如可列舉出5-FU等代謝括抗劑;SN-38等 伊立替康系抗癌劑;多西他賽等微管解聚抑制劑;順銷、奧沙利銷等銷制劑等。此外，還可列 舉出對與細胞增殖有關的生長因子及其受體、W及與細胞增殖、細胞周期、細胞調亡及其信 號傳導有關的分子或酶等進行選擇性修飾，W獲得抗癌效果的分子祀向藥物。例如還有曲 妥珠單抗或西妥昔單抗、吉非替尼等作用于生長因子受體的藥物;伊馬替尼、克挫替尼等作 用于融合基因的信號傳導的藥物；貝伐珠單抗等抑制癌組織的血管新生的藥物等。作為其 他藥物，還可列舉出抗癌劑的前體藥物、調節與抗癌劑或其前體藥物的代謝相關的細胞內 代謝酶活性的藥物、免疫治療劑等。
[0054] 上述工序(B)中與含藥物的溶液接觸優選通過W下方式進行：例如在位于基材上 的滴塊狀凝膠上將含藥物的溶液多層重疊，用含藥物的溶液覆蓋整個滴塊狀凝膠，W使滴 塊狀凝膠不會干燥成為平坦的干燥物。所接觸的含藥物的溶液除了藥物W外，還可含有血 清培養基等培養基。溶液中藥物的濃度優選的是，W對細胞所源自的機體給藥時的該細胞 近旁的藥物濃度為基礎，根據目的任意設定。
[0055] 上述工序(C)中癌細胞的培養優選通過使包埋癌細胞的滴塊狀凝膠與液體培養基 接觸而進行。作為所接觸的液體培養基，從抑制混入的成纖維細胞的增殖的觀點出發，優選 為無血清培養基。與液體培養基的接觸優選通過W下方式進行：用液體培養基覆蓋整個滴 塊狀凝膠，W使滴塊狀凝膠不干燥。進行培養的時間例如為^lO天、優選為3~8天。接觸液體 培養基的滴塊狀凝膠可W在與含藥物的溶液接觸后，通過洗涂將藥物洗涂除去。
[0056] 上述工序(D)中培養結果的評價例如通過W下方式進行:對培養前后的存活癌細 胞數量進行比較、或者對添加藥物進行培養時的存活細胞數量與未添加藥物進行培養時的 存活細胞數量進行比較。存活癌細胞數量的計測可W通過用顯微鏡的目視觀察來進行。另 夕h存活癌細胞數量的計測還可W通過W下方式進行:采用對活細胞進行選擇性染色的染 色法，測定由染色所產生的顯色。作為對活細胞進行選擇性染色的染色法，可列舉出中性紅 染色法等利用細胞的吞隧作用的染色法;膠乳粒子染色法、二乙酸巧光素染色法等利用細 胞內的酶活性的染色法;使用其它巧光試劑的染色法等。染色后的癌細胞可通過福爾馬林 固定等進行固定。由此，能夠暫時防止染色劑的洗脫，進行靈敏度高的染色。染色后的滴塊 狀凝膠可進行干燥。由此，能夠防止變質、劣化。滴塊狀凝膠的干燥例如可通過風干、由10~ 50°C左右的加熱進行的強制干燥等來進行。由染色所產生的顯色的測定可W通過對染色后 的滴塊狀凝膠進行拍照，將拍攝的圖像數值化來進行評價。數值化后的評價可包括根據染 色的細胞圖像的形狀進行的數值校正。癌細胞具有為塊狀且形成深色圖像的趨勢，成纖維 細胞具有為細纖維狀且形成淺色圖像的趨勢，通過進行選擇塊狀染色圖像的數值的校正， 可W更準確且簡便地測定存活的癌細胞。
[0057] 實施例 W下，根據實施例對本發明進行更具體的說明，但本發明并不限于運些實施例的范圍。 [005引膠原酶活性測定方法 本說明書中的膠原酶活性按照W下FALGPA分解活性測定方法來測定。
[0059] FALGPA分解活性測定方法: W 下方法登載于Sigma-Aldrich公司的網站化ttp : //www . sigmaaIdrich . com/ technic曰l-documents/protocols/biology/enzym3tic-3ss3y-〇f-coll3gen3se-using-n- 3-2furyI曰cryIoyl-leu-gly-pr〇-曰I曰.html)O
[0060] (I)縮寫： 該1]
[0061 ] (2)原理： 對利用膠原酶的作用將FALGPA分解為FAL和Gl廠Pro-Ala時來源于FALGPA的345nm吸光 度(A345nm)的減少變量進行測定，計算出活性。
[0062] (3)方法： a.試劑： (日)試劑8 5〇111]\1^徑甲基甘氨酸（化1。1116)、1〇111]\10日(：12、40〇111]\1化(：1、口^.5(25°(：)緩 沖液： 將 S徑甲基甘氨酸（Sigma-Aldrich、T0377)0.896g、rfeCl(Sigma-Aldrich、S9888) 2.：34邑、〔曰(：12*2出0(51邑111曰-41壯1地、〔3881)0.147邑溶解于蒸饋水801111^，用1]\1化0扣容液 (Sigma-Al化ich、S2567)、或IM HCl溶液（Sigma-Al化ich、冊 162)調整至抑7.5(25°C)后，添 加蒸饋水至100mL^; (b)試劑C 1.OmM N-(3-[2-巧喃基]丙締酷基）-Leu-Gly-Pro-Ala(FALGPA): 將FALGPA(Sigma-Al化ich、F5135)9.6mg加入A的溶液20mL中，攬拌30分鐘W上使其完 全溶解； (C)試劑D蒸饋水： (d)試劑E酶溶液： 將酶溶解于蒸饋水，W達到使用時的5~10倍濃度。
[0063] b.條件： 反應液PH=7.5、反應溫度=25 °C、吸光度=A345nm、光程=1 cm C.反應液的試劑組成和操作： 「夫91
[0064] 將試劑B 2.9mL放入Icm光程的檢測池（cell)中，加熱至25°C。待A345nm穩定后加 入0.1 mL試劑C(空白試驗)或試劑D(本試驗），立刻混合并在25°C下將A345nm的降低情況記 錄5分鐘。
[0065] (4)活性單位的定義和計算方法 在上述條件下、pH7.5、25°C、巧離子的存在下，Wl分鐘內將1.0皿Ole的FALGPA水解的 酶量作為IFALGPA單位(unit) dFALGPA單位通過下式求出， FALGPA單位/mL= {(E1-E2) X 3/化 X 0.1)}/0.53 上式中的符號或數值如下所示。
[0066] [表3]
[0067] 參考例I: 在W往的方法中，按照W下I~7所示的步驟進行檢體的洗涂、組織的細切、組織的切碎 處理、組織分散、回收、預培養、W及細胞回收。
[006引1.檢體洗涂： 從癌癥患者的胃癌、大腸癌、膜腺癌等消化系統癌、乳癌、肺癌、頭頸癌、癌性胸/腹膜 炎、子宮頸癌、子宮體癌或卵巢癌等實體癌組織中取出檢體。如下所示，除去附著于檢體表 面的雜菌。首先，準備=個IOcm培養皿，每個培養皿中各加入20mL含有抗生素的培養基溶液 (檢體洗涂液）。將檢體放入第一個培養皿的檢體洗涂液中，對檢體表面進行充分洗涂。將檢 體移入第二個和第S個培養皿中，進行洗涂操作。所用的檢體洗涂液為：向DF培養液(DF: 1 容量Du化ecco改良的化gle(DME)培養液與1容量化m'sF12培養液的混合培養液）中，加入贓 拉西林（富山化學社制、PENTCILLIN注射用)使其相對于基礎培養基(base medium)終濃度 為Img/mL，加入卡那霉素(化calai Tesque公司制、硫酸卡那霉素試劑）使其相對于基礎培 養基濃度為0.5mg/mL，加入兩性霉素B (和光純藥公司制)使其終濃度為2.化g/mL。
[0069] 2.組織的細切處理： 將洗涂后的檢體移入新培養皿中，用剪刀和綴子在培養皿上敏捷地進行細切，將癌組 織切成3~5mm見方左右。
[0070] 3.組織的切碎處理： 用夾在持針器上的剌刀刃在培養皿上將細切后的檢體切碎至成為糊狀。應予說明，在 處理多個檢體時，將剪刀、綴子、持針器用70%乙醇洗涂并用燃燒器烘烤反復使用。向切碎的 癌組織中加入20血DF培養液，將組織與DF培養液一起回收到50血離屯、管中。進而加入IOmL DF培養液，對附著于培養皿的組織進行充分回收。用桌上型離屯、機在400Xg下進行3分鐘離 屯、。
[0071] 4.組織分散： 離屯、后，利用抽吸(aspiration)除去上清。向離屯、后的沉淀中添加9mL DF培養液，搖晃 離屯、管進行混合將組織片充分解開。添加ImL調整為處方濃度的10倍濃度的組織分散酶組 合物，調整處方濃度的組織分散溶液。可W根據酶組合物添加10%FBS(FBS為胎牛血清）。使 用桌上型振蕩器，在37°C恒溫器內進行2小時左右攬拌振蕩。典型而言，所添加的組織分散 酶的組成調整為:調整后的酶活性值達到膠原酶活性0.0 l~1抓/mU優選為0.03~lOU/mL。
[0072] 5.回收： 加入10血DF培養液使總量達到20血，W400 Xg進行3分鐘離屯、，將上清除去。除去上清 后，輕輕搖晃離屯、管將細胞解開，添加IOmL培養基后，進行強吸管吹打，物理地解開細胞團 塊。使用孔徑300WI1的尼龍篩，對含有細胞的懸浮液進行過濾。加入IOmL DF培養液，將離屯、 管和尼龍篩充分共洗涂。
[0073] 6.預培養： 將回收處理中所得的細胞離屯、回收，吸引除去上清。用Primaster Kit (倉敷紡織株式 會社制）的預培養培養基(PCM-I)SmL使離屯、后的細胞沉淀懸浮。將懸浮有細胞的PCM-I培養 液接種于膠原/凝膠/玻瓶內。靜置于C〇2培養箱內培養一夜。培養一夜后，將含有血細胞或 無用細胞成分等的培養液吸引除去。觀察腫瘤細胞在膠原/凝膠/玻瓶上的植活 (engraf tment)情況。
[0074] 7.細胞回收： 將膠原/凝膠/玻瓶內的培養液吸引除去，加入5mL DF培養液進行洗涂后，加入2mL DF 培養液。進而，添加0.2mL調整為處方濃度的10倍濃度的組織分散用酶組合物，調整處方濃 度的酶溶液。37°C下振蕩15~30分鐘，使玻瓶內的膠原/凝膠溶解。將從膠原/凝膠/玻瓶剝離 的細胞回收至50mL離屯、管中。應予說明，在確認細胞對玻瓶的粘附時，加入3mL EDTA-膜蛋 白酶振蕩5分鐘。確認細胞剝離后，加入10%血清培養基5mL，將玻瓶內充分共洗(共洗L )，回 收至50mL離屯、管中。加入IOmL DF培養液定容后，對細胞進行離屯、回收。
[0075] 實施例1:由手工操作進行的組織分散 檢體洗涂/細切處理 將非小細胞肺癌、胃癌和大腸癌的癌組織作為檢體分別取出，按照上述參考例1的步驟 1進行檢體洗涂。按照上述參考例1的步驟2將洗涂后的檢體細切成3~5mm見方。
[0076] 組織分散處理 細切后立刻向0.3g組織片中加入5血反應溶液(4.5mL DF培養基和0.5血酶液混合而成 的混合液），放入15mL容量離屯、管中，37°C下酶消化30分鐘。酶液配制成膠原酶活性0.31U/ ITlL O
[0077] 酶消化后，通過將內容物用5mL-次性吸管進行吸管吹打10~20次來進行攬拌。攬 拌后，再次在37°C下酶消化30分鐘，反復攬拌。
[0078] 添加邸TA溶液，使酶反應停止。然后通過離屯、分離使細胞塊沉降，除去酶液。
[0079] 回收/預培養/細胞回收 按照上述參考例1的步驟5~7，對細胞進行回收。
[0080] 實施例2:使用裝置的組織分散 檢體洗涂/細切處理 將非小細胞肺癌、胃癌和大腸癌的癌組織作為檢體分別取出，按照上述參考例1的步驟 1進行檢體洗涂。按照上述參考例1的步驟2將洗涂后的檢體細切成3~5mm見方。
[0081 ] 組織分散處理 對于各癌組織，除了使用gentleMACS DissociatoH美天旋(Miltenyi Biotec)公司 審IJ)進行組織分散處理W外，采用與實施例1同樣的方式，對細胞進行回收。利用 "gentleMACS Dissociator"的組織分散處理的詳細情況如下所示。
[0082]細切后立刻向0.3g組織片中加入5mL與實施例1同樣的反應溶液，回收至專用試劑 盒的C 1:ube中，37°C下酶處理30分鐘。處理后，將C tube置于gentleMACS Dissociator上， 混合30秒。由此，消化一定程度后的組織被解開，露出未消化的組織。混合后，進一步在37°C 下酶處理30分鐘。處理后，進而將C tube置于gentIeMACS Dissociator上，混合30秒。添加 邸TA溶液，使酶反應停止。然后通過離屯、分離使細胞塊沉降，除去酶液。
[0083] 回收/預培養/細胞回收 按照上述參考例1的步驟5~7，對細胞進行回收。
[0084] 比較例1: 將非小細胞肺癌、胃癌和大腸癌的癌組織分別用作檢體，按照參考例1的步驟1~7的方 法對細胞進行回收。
[00化]所需時間的比較 比較例1和實施例1、2中，到檢體的洗涂、組織的細切、組織的切碎處理、組織分散、回收 為止所需時間示于下表4中。
[0086] [表 4]
[0087] 如表4的A所示，實施例中，到放入培養基中為止不需要時間（no time),因此對細 胞的損傷減少。另外，如表4的B所示，實施例中，通過反復有效的分散處理而縮短了酶處理 時間，由酶對細胞帶來的損傷減少。
[008引由此，根據本發明的方法，能夠根據需要在短時間內獲得損傷少的細胞。
[0089] 細胞回收量的比較 使用非小細胞肺癌、胃癌和大腸癌的癌組織，比較例1和實施例1、2中的細胞回收量示 于下表5中。將采用參考例1的1~2記載的方法進行組織的細切處理后的3~5mm見方的組織片 分為兩組，進行比較例1所述的組織分散處理、W及實施例1、2所述的組織分散處理。分散處 理后，按照參考例1的5記載的方法對癌細胞進行回收，按照參考例1的6記載的方法預培養 一夜后，按照參考例1的7記載的方法對細胞進行回收，用錐蟲藍染色法測定活細胞數。
[0090] 表中的組織重量表示用于回收細胞的癌組織的每1組的重量。回收細胞數比較表 示同一檢體的實施例1和2的細胞數除W比較例1的細胞數所得的值。與回收的糊狀組織片 中的細胞數不同，通過測定剛預培養后的細胞數，可W更準確地測定未受損傷的細胞數量。
[0091] 應予說明，對于比較，用剛預培養后的數據進行比較。不用回收后的細胞進行確認 的原因是由于無法判斷回收的細胞是否受到損傷。
[0092] [表 5]
[0093] 若W回收細胞數的相對差異小于25%作為相同程度，W25%W上作為一方多于另一 方，則如表5所示，在采用實施例的方法的情況下，與采用比較例的方法的情況相比，可從癌 組織回收相同程度或更多的細胞。表明根據本發明的方法能夠獲得損傷少的細胞。
[0094] 預培養后的細胞的觀察 使用非小細胞肺癌、胃癌和大腸癌的癌組織，用光學顯微鏡對比較例和實施例1、2所得 的預培養后的在膠原/凝膠/玻瓶內植活的細胞進行觀察。結果示于圖1。如圖1所示，實施例 中所得的細胞與比較例相比可確認顯著增殖。表明根據本發明的方法能夠獲得損傷少的細 胞。
【主權項】
1. 在評價藥物對癌細胞的抗癌作用的方法中所用的癌細胞的獲得方法，其特征在于， 該方法包括： (a) 將經細切處理后的來自癌組織的試樣化學破碎的工序、 (b) 將由工序(a)所得的試樣物理破碎的工序、以及 (c) 將由工序(b)所得的試樣化學破碎的工序。2. 根據權利要求1所述的方法，其中，還包括將由工序(c)所得的試樣物理破碎的工序 作為工序(d)。3. 根據權利要求1或2所述的方法，其中，工序(a)中化學破碎的來自癌組織的試樣是未 經切碎處理的試樣。4. 根據權利要求1至3中任一項所述的方法，其中，工序(a)和工序(c)的化學破碎是由 含酶組合物進行的處理。5. 根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其中，工序(a)的化學破碎進行10分鐘~60 分鐘。6. 根據權利要求1至5中任一項所述的方法，其中，工序(b)的物理破碎進行10秒~3分 鐘。7. 根據權利要求1至6中任一項所述的方法，其中，工序(c)的化學破碎進行10分鐘~60 分鐘。8. 根據權利要求1至7中任一項所述的方法，其中，還包括將由工序(c)或(d)所得的試 樣在支持物上進行培養，獲得附著于支持物的細胞的工序。9. 評價藥物對癌細胞的抗癌作用的方法，其中，該方法包括對采用權利要求1~8中任一 項所述的方法獲得的癌細胞進行培養，使藥物作用于培養后的癌細胞的工序。10. 評價藥物對癌細胞的抗癌作用的方法，其中，該方法包括將采用權利要求1~8中任 一項所述的方法獲得的癌細胞包埋于滴塊狀凝膠中進行培養，使藥物作用于培養后的癌細 胞的工序。
【文檔編號】C12Q1/02GK105934513SQ201580006775
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2015年2月3日
【發明人】宮川功, 河村圣子, 小林昶運
【申請人】倉敷紡績株式會社