一種利用單細胞測序檢測微量真菌的方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明涉及微生物及分子生物學領域，尤其涉及一種利用單細胞測序檢測微量真菌的方法及利用該方法制成的真菌檢測試劑盒。本發明方法包括微量真菌細胞的獲取、真菌細胞壁破壁提取真菌原生質、微量真菌原生質gDNA的提取和擴增、微量gDNA建庫、基因組測序、生物信息學分析比對、判定所檢測真菌的種類等步驟。本發明方法實現了對微量真菌的高效檢測，可以直接應用于微量、疑難真菌樣本或混合樣本的分離、檢測、鑒別及遺傳信息的深入研究。本發明真菌檢測方法及試劑盒適用于工業生產、環境監測、空氣檢測、土壤檢測、水質檢測、食品檢測、藥品檢測、化妝品檢測、保健品檢測以及醫學檢測等領域。
【專利說明】
-種利用單細胞測序檢測微量真菌的方法及試劑盒
技術領域
[0001] 本發明設及微生物及分子生物學領域，尤其設及一種利用單細胞測序檢測微量真 菌的方法及利用該方法制成的真菌檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002] 1.現有單細胞測序技術概述
[0003] 1)目前單細胞測序技術主要用于人或哺乳動物胚胎細胞、干細胞發育研究，此類 細胞只有細胞膜，沒有細胞壁，因而無需破壁，從微量細胞中提取曲NA比較容易。
[0004] 2)有報道單細胞測序技術用于植物種子發育、植物內生真菌的細胞測序研究，此 類細胞可W被分離培養，所W比較容易獲得純細胞系進行分子檢測實驗。
[0005] 2.現有的真菌破壁、DNA提取技術概述
[0006] 1)物理方法:于研鉢中加液氮研磨、研磨儀低溫研磨，但此法需要大量的菌體，不 能應用于微量樣本。
[0007] 2)化學方法:氯化節提取法等，易降解，所提取的DNA完整性差，一般只夠做PCR，難 W達到用于基因組建文庫的完整性要求。
[000引3)酶法:蝸牛酶、纖維素酶、溶菌酶、溶壁酶等，效率低，所提取的DNA不夠微量樣本 進行建庫的量。
[0009] 3.現有對微量真菌樣本的檢測技術概述
[0010] 1)鏡檢:直接在顯微鏡下觀察，雖然簡便、快速，但靈敏度低，需要豐富經驗，極易 漏檢。
[0011] 2)培養:培養過程中真菌的形態和生化指標可作為檢測的重要標準，但耗時長、易 污染、很多真菌(尤其是病原真菌)難W在人工培養條件下培養成功。
[0012] 3)PCR及基因忍片技術:適用于有明確范圍的真菌檢測，需要有針對性的設計引 物、探針，不適用于完全未知的物種。
[0013] 4)使用通用引物進行PCR擴增后進行一代測序:適用于單一的未知真菌檢測，一般 用于可培養的純菌檢測，不適用于復雜樣本的一次性檢測。
[0014] 5)應用新一代宏基因組測序:可用于復雜樣本的檢測，但由于真菌的DNA與其他微 生物或哺乳動物相比難W提取，所W會產生大量與目的菌種無關的數據，數據的甄別難度 很大。
[0015] 根據W上對現有技術的概述可W看出，目前針對微量真菌的檢測技術主要存在W 下技術缺點：
[0016] 1.難W對微量、不可培養或培養難度大的真菌進行高效破壁。
[0017] 2.難W對微量真菌提取足量的可進行基因組建庫的曲NA。
[0018] 3.難W對復雜樣本中特定的真菌進行檢測。
[0019] 總而言之，真菌破壁提取完整基因組DNA-直是本領域中的難題，尤其是微量真菌 樣本，如何在微量的復雜樣本中，提取可W達到二代測序建文庫所需的真菌曲NA,并對其進 行全基因組測序是目前還未有人報道的。
[0020] 本發明方法通過取真菌微量細胞進行破壁，提取、擴增曲NA,并進行新一代測序的 文庫建立、基因組測序分析等步驟，可W很好的克服上述技術缺陷，從而實現對微量真菌的 高效檢測，本發明方法可W直接應用于微量、疑難真菌樣本或混合樣本的分離、檢測、鑒別 及遺傳信息的深入研究。根據本發明方法制成的真菌檢測試劑盒可廣泛應用于工業生產、 環境監測、空氣檢測、±壤檢測、水質檢測、食品檢測、藥品檢測、化妝品檢測、保健品檢測W 及醫學檢測等多種領域。本發明技術的推廣應用將會具有良好的市場前景并產生可觀的經 濟及社會效益。
【發明內容】
[0021] 解決的技術問題
[0022] 本發明需要解決的問題是:本發明的目的是克服現有微量真菌檢測技術所存在的 不足，如難W對微量、不可培養或培養難度大的真菌進行高效破壁;難W對微量真菌提取足 量的可進行基因組建庫的曲NA;難W對復雜樣本中特定的真菌進行檢測等問題。
[00剖技術方案
[0024] 本發明旨在建立一套完整的微量真菌檢測技術方案，W解決目前存在的難W分離 培養、難W用常規方法對復雜樣本中的微量真菌進行分子檢測和遺傳信息研究的技術難 題。
[0025] 本發明方法通過復雜樣本中單個真菌細胞的分離獲取和對其原生質的提取，尤其 是對該真菌細胞壁的高效破除，W及對上述真菌原生質進行曲NA提取、擴增和建庫，并與新 一代測序技術結合分析基因組信息，而不是傳統的PCR或基因忍片層次的單個或多個特定 序列的測定和分析，最終實現對該真菌的準確檢測。
[0026] 首先，本發明提供了一種利用單細胞測序檢測微量真菌的方法，包括W下步驟：
[0027] (1)微量真菌細胞的獲取:將微量真菌樣本涂于激光顯微切割覆膜載玻片上，用激 光顯微切割系統找到目的細胞，用激光強度37-43微焦對所選出的單個真菌細胞進行激光 顯微切割，獲得單個目的細胞，重復上述操作獲取總數為1-100個的目的細胞；
[0028] (2)真菌細胞壁破壁:化學法與混合酶法結合提取真菌原生質；
[0029] 1)將0.8M D-山梨醇溶液加入到裝有上述目的細胞的離屯、管中，在4°C條件下浸泡 目的細胞2小時；
[0030] 2)配制復合預處理劑:將50mM Tris，5mM邸TA，5%0-琉基乙醇混合均勻；
[0031] 3)配制混合酶處理劑:將蝸牛酶1-lOmg/mL，溶壁酶1-lOmg/mL，溶菌酶I-IOmg/血， 纖維素酶1-lOmg/mL四種酶中的至少兩種酶按一定比例混合，當所述混合酶處理劑僅由兩 種酶混合組成時，其中至少包括蝸牛酶和溶壁酶中的一種；
[00創 4)將上述復合預處理劑加入裝有目的細胞的離屯、管中，35°C處理細胞1小時；
[0033] 5)上述離屯、管經離屯、后將細胞收集至管底，棄去處理劑；
[0034] 6)向上述離屯、管中加入無菌水洗涂細胞兩次，離屯、，棄去液體；
[0035] 7)向上述離屯、管中加入混合酶處理劑，35-45。(：處理3-12小時；
[0036] 8)上述離屯、管經離屯、后將細胞收集至管底，棄去液體；
[0037] 9)向上述離屯、管中加入PBS洗涂細胞一次，離屯、，棄去液體，保留4-lOiil細胞懸液；
[0038] (3)微量真菌原生質曲NA的提取和擴增：利用單細胞全基因組擴增試劑盒對上述 步驟中獲得的4-lOiil細胞懸液進行核酸提取及擴增反應，獲得上述真菌曲NA;
[0039] (4)微量曲NA建庫:利用DNA建庫試劑盒對上述真菌曲NA進行建庫；
[0040] (5)基因組測序:對上述建庫的真菌曲NA進行全基因組測序；
[0041] (6)生物信息學分析:利用相關軟件對測序獲得的數據進行組裝，得到組裝結果與 相關公開數據庫進行比對，判定所檢測真菌的種類。
[0042] 進一步地，本發明方法可檢測的真菌包括念珠菌屬中的白色念珠菌、光滑念珠菌、 克柔念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌、都柏林念珠菌；曲霉屬中的煙曲霉、黃曲霉、±曲 霉、構巢曲霉、黑曲霉、焦曲霉;隱球菌屬中的新生隱球菌、格特隱球菌W及上述各菌種的變 種;上述各菌種及其變種均屬于臨床醫學中的致病菌，雖然是可被體外培養的，但由于患者 用藥等因素，在真實臨床樣本中難W被分離培養成功。
[0043] 進一步地，本發明方法可檢測的真菌還包括馬拉色菌，該菌種屬于苛養的真菌，對 培養條件要求苛刻，需要在培養基中補充特殊營養成分才能夠培養成功。
[0044] 進一步地，本發明方法可檢測的真菌還包括組織胞漿菌、伊蒙菌、申克氏抱子絲 菌、馬爾尼菲青霉、己西副球抱子菌、皮炎芽生菌、粗球抱子菌;上述菌種在體外難W培養成 功。
[0045] 作為一種優選方案，本發明方法中的第(2)步驟真菌細胞壁破壁:化學法與混合酶 法結合提取真菌原生質，其中配制的混合酶處理劑為蝸牛酶6mg/mL和溶壁酶4mg/mL向離 屯、管中加入混合酶處理劑后，37°C處理6小時;最終保留化1細胞懸液。
[0046] 作為另一種優選方案，本發明方法中的第(2)步驟真菌細胞壁破壁:化學法與混合 酶法結合提取真菌原生質，其中配制的混合酶處理劑為蝸牛酶6mg/mL和溶菌酶4mg/mL;向 離屯、管中加入混合酶處理劑后，45°C處理10小時;最終保留化1細胞懸液。
[0047] 作為另一種優選方案，本發明方法中的第(2)步驟真菌細胞壁破壁:化學法與混合 酶法結合提取真菌原生質，其中配制的混合酶處理劑為蝸牛酶4mg/mL、溶壁酶4mg/mL和溶 菌酶4mg/mL向離屯、管中加入混合酶處理劑后，35°C處理8小時;最終保留化1細胞懸液。
[0048] 作為另一種優選方案，本發明方法中的第(2)步驟真菌細胞壁破壁:化學法與混合 酶法結合提取真菌原生質，其中配制的混合酶處理劑為蝸牛酶4mg/mL、溶壁酶3mg/mL和纖 維素酶3mg/mL向離屯、管中加入混合酶處理劑后，37°C處理3小時;最終保留化1細胞懸液。
[0049] 作為另一種優選方案，本發明方法中的第(2)步驟真菌細胞壁破壁:化學法與混合 酶法結合提取真菌原生質，其中配制的混合酶處理劑為蝸牛酶4mg/mL、溶菌酶3mg/mL和纖 維素酶3mg/mL向離屯、管中加入混合酶處理劑后，37°C處理12小時;最終保留祉1細胞懸液。
[0050] 作為另一種優選方案，本發明方法中的第(2)步驟真菌細胞壁破壁:化學法與混合 酶法結合提取真菌原生質，其中配制的混合酶處理劑為溶壁酶5mg/mL、溶菌酶4mg/mL和纖 維素酶3mg/mL向離屯、管中加入混合酶處理劑后，37°C處理6小時;最終保留IOiil細胞懸液。
[0051] 作為另一種優選方案，本發明方法中的第(2)步驟真菌細胞壁破壁:化學法與混合 酶法結合提取真菌原生質，其中配制的混合酶處理劑為蝸牛酶4mg/mL、溶壁酶2mg/mL、溶菌 酶3mg/血和纖維素酶4mg/血；向離屯、管中加入混合酶處理劑后，37°C處理6小時；最終保留6 yl細胞懸液。
[0052] 此外，本發明還提供了一種根據本發明微量真菌檢測方法制成的真菌檢測試劑 盒，該真菌檢測試劑盒可適用于W下領域:工業生產、環境監測、空氣檢測、±壤檢測、水質 檢巧U、食品檢測、藥品檢測、化妝品檢測、保健品檢測W及醫學檢測。
[0化3]有益效果
[0054]本發明的微量真菌檢測方法及相應試劑盒克服了現有技術存在的許多不足，為從 復雜樣本中分離獲取難W培養的真菌提供了方案;為微量真菌的高效破壁提供了優化的技 術方案;并為針對復雜樣本中微量真菌進行基因組測序分析提供了整套的技術方案，最終 實現了對微量真菌的高效檢測。本發明方法可W直接應用于微量、疑難真菌樣本或混合樣 本的分離、檢測、鑒別及遺傳信息的深入研究。根據本發明方法制成的真菌檢測試劑盒可廣 泛應用于工業生產、環境監測、空氣檢測、±壤檢測、水質檢測、食品檢測、藥品檢測、化妝品 檢測、保健品檢測W及醫學檢測等多種領域。本發明技術的推廣應用將會具有良好的市場 前景并產生可觀的經濟及社會效益。
【附圖說明】
[0化5] 圖1為DNA質控檢測電泳圖，其中：為DNA marker, 1-3號為可建庫的曲NA陽性對 照，4-6號為本實驗提取的真菌單細胞曲NA,樣本和陽性對照的DNA都有>10化明顯條帶。
【具體實施方式】
[0056] W下通過特定的具體實例說明本發明的實施方式，本領域技術人員可由本說明書 所掲露的內容輕易地了解本發明的其他優點與功效。本發明還可W通過另外不同的具體實 施方式加 W實施或應用，本說明書中的各項細節也可W基于不同觀點與應用，在沒有背離 本發明的精神下進行各種修飾或改變。
[0057] 在進一步描述本發明【具體實施方式】之前，應理解，本發明的保護范圍不局限于下 述特定的具體實施方案;還應當理解，本發明實施例中使用的術語是為了描述特定的具體 實施方案，而不是為了限制本發明的保護范圍；在本發明說明書和權利要求書中，除非文中 另外明確指出，單數形式"一個"、"一"和"運個"包括復數形式。
[0058] 當實施例給出數值范圍時，應理解，除非本發明另有說明，每個數值范圍的兩個端 點W及兩個端點之間任何一個數值均可選用。除非另外定義，本發明中使用的所有技術和 科學術語與本技術領域技術人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設備、 材料外，根據本技術領域的技術人員對現有技術的掌握及本發明的記載，還可W使用與本 發明實施例中所述的方法、設備、材料相似或等同的現有技術的任何方法、設備和材料來實 現本發明。實施例1
[0059] 1.微量格特隱球菌細胞的獲取:顯微涂片、激光切割，獲得單個目的細胞
[0060] 將微量樣本涂于激光顯微切割覆膜載玻片化eica Membrane Slides陽N2.0微米 或類似產品），用激光顯微切割系統化eica LMD7000或類似產品）在63倍放大下找到目的細 胞，用激光強度40微焦(可設范圍laser power 40 + 3)對所選出的單個真菌細胞進行激光 顯微切割，落于無菌的離屯、小管中，重復上述操作共獲取10個真菌細胞(可獲取細胞數范圍 1-100個）。
[0061] 2.格特隱球菌細胞壁破壁:化學法與混合酶法結合提取真菌原生質
[0062] 1)將20化1 0.8M D-山梨醇溶液加入到上述離屯、管中，在4°C條件下浸泡細胞2小 時；
[0063] 2)配制復合預處理劑100ml:將50mM Tris，5mM邸TA，5%0-琉基乙醇混合均勻；
[0064] 3)配制混合酶處理劑Iml:蝸牛酶6mg/mL，溶壁酶4mg/ni;
[0(?日]4)加入20化1復合預處理劑于離屯、管中，35。(：處理細胞1小時；
[0066] 5) 500化pm離屯、5min將細胞收集至管底，棄去處理劑；
[0067] 6)加入20化1無菌水洗涂細胞兩次，500化pm離屯、5min，棄去液體；
[006引 7)加入20化1混合酶處理劑，37 °C處理6小時；
[0069] 8)500化pm離屯、5min將細胞收集至管底，棄去液體；
[0070] 9)加入SOiil PBS洗涂細胞一次，500化pm離屯、5min，棄去液體，保留化1細胞懸液。
[0071] 3.微量格特隱球菌原生質曲NA的提取和擴增
[0072] 銜接步驟2中化1細胞懸液，加入RE化I-g Single Cell Kit(德國Qiagen公司）中3 iil BufferD2,混勻并瞬時離屯、，65°C解育IOmin;加入化1試劑盒中Stop Solution,混勻并 瞬時離屯、，暫時保存于冰上;每個擴增反應中加40iU PCR反應液(按試劑盒說明書配制:此0 SC 化1，RE化I-g SC Reaction Buffer 2化1，RE化I-g SC DNA Polymerase 2]il)，30°C反 應8小時;于65°C3min下使RE化I-g DNA聚合酶失活，即為提取的格特隱球菌曲NA。
[0073] 上述10個格特隱球菌細胞的曲NA提取擴增后，經DNA質控檢測達到二代測序建庫 要求，0D260/0D280 :1.82，DNA濃度：75ngAU，完整性〉IOkb，如附圖1所示，其中TT為DNA marker, 1-3號為可建庫的曲NA陽性對照，4-6號為本實驗提取的真菌單細胞曲NA,樣本和陽 性對照的DNA都有>10化明顯條帶。W上結果說明單細胞的DNA提取擴增實驗是成功的，符 合二代測序建庫要求，可W進行全基因組測序。
[0074] 4.微量曲NA建庫
[007引按照試劑盒NEBNex峨叫haDNA LibraiT Prep Kit forlllumi皿?(美國肥B公 司）對W上格特隱球菌曲NA進行建庫。
[0076] 5.新一代基因組測序
[0077] 用Illumina MiSeq儀器及相應試劑（MiSeq 600 cycles Reagent V3美國 111皿ina公司）對W上建庫的曲NA進行全基因組測序。
[0078] 6.生物信息學分析
[0079] 使用SPAdes軟件對測序數據進行組裝，得到組裝結果與NCBI公開數據庫nt庫進行 比對，判定是格特隱球菌。
[0080] 實施例2
[0081 ] 1.微量都柏林念珠菌細胞的獲取:顯微涂片、激光切割，獲得單個目的細胞
[0082] 將微量樣本涂于激光顯微切割覆膜載玻片化eica Membrane Slides陽N2.0微米 或類似產品），用激光顯微切割系統化eica LMD7000或類似產品）在63倍放大下找到目的細 胞，用激光強度43微焦(可設范圍laser power 40 + 3)對所選出的單個真菌細胞進行激光 顯微切割，落于無菌的離屯、小管中，共獲取1個真菌細胞(可獲取細胞數范圍1-100個）。
[0083] 2.都柏林念珠菌細胞壁破壁:化學法與混合酶法結合提取真菌原生質
[0084] 1)將20化1 0.8M D-山梨醇溶液加入到上述離屯、管中，在4°C條件下浸泡細胞2小 時；
[0085] 2)配制復合預處理劑100mL:將50mM Tris,5mM邸TA,5%e-琉基乙醇混合均勻；
[0086] 3)配制混合酶處理劑Iml:蝸牛酶6mg/mL，溶菌酶4mg/ni;
[0087] 4)加入20化1復合預處理劑于離屯、管中，35°C處理細胞1小時；
[0088] 5) 500化pm離屯、5min將細胞收集至管底，棄去處理劑；
[0089] 6)加入20化1無菌水洗涂細胞兩次，500化pm離屯、5min，棄去液體；
[0090] 7)加入20化1混合酶處理劑，45°C處理10小時；
[0091] 8) 500化pm離屯、5min將細胞收集至管底，棄去液體；
[0092] 9)加入SOiil PBS洗涂細胞一次，500化pm離屯、5min，棄去液體，保留化1細胞懸液。
[0093] 3.微量都柏林念珠菌原生質曲NA的提取和擴增
[0094] 銜接步驟2中扣1細胞懸液，加入RE化I-g Single Cell Kit(德國Qiagen公司）中3 iil BufferD2,混勻并瞬時離屯、，65°C解育IOmin;加入化1試劑盒中Stop Solution,混勻并 瞬時離屯、，暫時保存于冰上;每個擴增反應中加40iU PCR反應液(按試劑盒說明書配制:此0 SC 化1，RE化I-g SC Reaction Buffer 2化1，RE化I-g SC DNA Polymerase 2]il)，30°C反 應8小時;于65°C3min下使RE化I-g DNA聚合酶失活，即為提取的都柏林念珠菌曲NA。
[0095] 4.微量曲NA建庫
[0096] 按照試劑盒NEBNext?UltraDNA Libra巧 Prep Kit formumina⑥（美國肥B公 司）對W上都柏林念珠菌曲NA進行建庫。
[0097] 5.新一代基因組測序
[009引 用Illumina MiSeq儀器及相應試劑（MiSeq 600 cycles Reagent V3美國 111皿ina公司）對W上建庫的曲NA進行全基因組測序。
[0099] 6.生物信息學分析
[0100] 使用SPAdes軟件對測序數據進行組裝，得到組裝結果與NCBI公開數據庫nt庫進行 比對，判定是都柏林念珠菌。
[0101] 實施例3
[0102] 1.微量馬拉色菌細胞的獲取:顯微涂片、激光切割，獲得單個目的細胞
[0103] 將微量樣本涂于激光顯微切割覆膜載玻片化eica Membrane Slides陽N2.0微米 或類似產品），用激光顯微切割系統化eica LMD7000或類似產品）在63倍放大下找到目的細 胞，用激光強度38微焦(可設范圍laser power 40 + 3)對所選出的單個真菌細胞進行激光 顯微切割，落于無菌的離屯、小管中，重復上述操作共獲取60個真菌細胞(可獲取細胞數范圍 1-100個）。
[0104] 2.馬拉色菌細胞壁破壁:化學法與混合酶法結合提取真菌原生質
[01化]1)將20化1 0.8M D-山梨醇溶液加入到上述離屯、管中，在4°C條件下浸泡細胞2小 時；
[0106] 2)配制復合預處理劑100mL:將50mM Tris,5mM邸TA,5%e-琉基乙醇混合均勻；
[01 07] 3)配制混合酶處理劑Iml:蝸牛酶4mg/mL，溶壁酶4mg/mL，溶菌酶4mg/ni;
[0108] 4)加入20化1復合預處理劑于離屯、管中，35°C處理細胞1小時；
[0109] 5) 500化pm離屯、5min將細胞收集至管底，棄去處理劑；
[0110] 6)加入20化1無菌水洗涂細胞兩次，500化pm離屯、5min，棄去液體；
[0111] 7)加入20化1混合酶處理劑，35 °C處理8小時；
[0112] 8) 500化pm離屯、5min將細胞收集至管底，棄去液體；
[0113] 9)加入50iil PBS洗涂細胞一次，500化pm離屯、5min，棄去液體，保留化I細胞懸液。
[0114] 3.微量馬拉色菌原生質曲NA的提取和擴增
[0115] 銜接步驟2中化1細胞懸液，加入RE化I-g Single Cell Kit(德國Qiagen公司）中3 iil Buffer D2,混勻并瞬時離屯、，65°C解育IOmin;加入化1試劑盒中Stop Solution,混勻并 瞬時離屯、，暫時保存于冰上;每個擴增反應中加40iU PCR反應液(按試劑盒說明書配制:此0 SC 化1，RE化I-g SC Reaction Buffer 2化1，RE化I-g SC DNA Polymerase 2]il)，30°C反 應8小時;于65°C3min下使RE化I-g DNA聚合酶失活，即為提取的馬拉色菌曲NA。
[0116] 4.微量曲NA建庫
[0117] 按照試劑盒NEBN放t?叫traDNA LibraiT Prep Kit fo;rI.llumina?(美國肥B公 司）對W上馬拉色菌曲NA進行建庫。
[0118] 5.新一代基因組測序
[0119] 用Illumina MiSeq儀器及相應試劑(MiSeq 600巧cles Reagent V3美國Illumina 公司）對W上建庫的曲NA進行全基因組測序。
[0120] 6.生物信息學分析
[0121] 使用SPAdes軟件對測序數據進行組裝，得到組裝結果與NCBI公開數據庫nt庫進行 比對，判定是馬拉色菌。
[0122] 實施例4
[0123] 1.微量伊蒙菌細胞的獲取:顯微涂片、激光切割，獲得單個目的細胞
[0124] 將微量樣本涂于激光顯微切割覆膜載玻片化eica Membrane Slides陽N2.0微米 或類似產品），用激光顯微切割系統化eica LMD7000或類似產品）在63倍放大下找到目的細 胞，用激光強度40微焦(可設范圍laser power 40 + 3)對所選出的單個真菌細胞進行激光 顯微切割，落于無菌的離屯、小管中，重復上述操作共獲取20個真菌細胞(可獲取細胞數范圍 1-100個）。
[0125] 2.伊蒙菌細胞壁破壁:化學法與混合酶法結合提取真菌原生質
[01%] 1)將20化1 0.8M D-山梨醇溶液加入到上述離屯、管中，在4°C條件下浸泡細胞2小 時；
[0127] 2)配制復合預處理劑100mL:將50mM Tris,5mM邸TA,5%e-琉基乙醇混合均勻；
[01 %] 3)配制混合酶處理劑Iml:蝸牛酶4mg/mL，溶壁酶3mg/mL，纖維素酶3mg/ml^;
[01巧]4)加入20化1復合預處理劑于離屯、管中，35°C處理細胞1小時；
[0130] 5) 500化pm離屯、5min將細胞收集至管底，棄去處理劑；
[0131 ] 6)加入20化1無菌水洗涂細胞兩次，500化pm離屯、5min，棄去液體；
[0132] 7)加入20化1混合酶處理劑，37°C處理3小時；
[0133] 8) 500化pm離屯、5min將細胞收集至管底，棄去液體；
[0134] 9)加入SOiil PBS洗涂細胞一次，500化pm離屯、5min，棄去液體，保留化1細胞懸液。
[0135] 3.微量伊蒙菌原生質曲NA的提取和擴增
[0136] 銜接步驟2中化1細胞懸液，加入RE化I-g Single Cell Kit(德國Qiagen公司）中3 iil BufferD2,混勻并瞬時離屯、，65°C解育IOmin;加入化1試劑盒中Stop Solution,混勻并 瞬時離屯、，暫時保存于冰上;每個擴增反應中加40iU PCR反應液(按試劑盒說明書配制:此0 SC 化1，RE化I-g SC Reaction Buffer 2化1，RE化I-g SC DNA Polymerase 2]il)，30°C反 應8小時;于65°C3min下使RE化I-g DNA聚合酶失活，即為提取的伊蒙菌曲NA。
[0137] 4.微量曲NA建庫
[013引 按照試劑盒NEBNex喚叫化aDNA Libra巧Prep Kit formumha?(美國肥B公 司）對W上伊蒙菌曲NA進行建庫。
[0139] 5.新一代基因組測序
[0140] 用Illumina MiSeq儀器及相應試劑（MiSeq 600 cycles Reagent V3美國 111皿ina公司）對W上建庫的曲NA進行全基因組測序。
[0141] 6.生物信息學分析
[0142] 使用SPAdes軟件對測序數據進行組裝，得到組裝結果與NCBI公開數據庫nt庫進行 比對，判定是伊蒙菌。
[0143] 實施例5
[0144] 1.微量黑曲霉細胞的獲取:顯微涂片、激光切割，獲得單個目的細胞
[0145] 將微量樣本涂于激光顯微切割覆膜載玻片化eica Membrane Slides陽N2.0微米 或類似產品），用激光顯微切割系統化eica LMD7000或類似產品）在63倍放大下找到目的細 胞，用激光強度37微焦(可設范圍laser power 40 + 3)對所選出的單個真菌細胞進行激光 顯微切割，落于無菌的離屯、小管中，重復上述操作共獲取100個真菌細胞(可獲取細胞數范 圍1-100個)。
[0146] 2.黑曲霉細胞壁破壁:化學法與混合酶法結合提取真菌原生質
[0147] 1)將20化1 0.8M D-山梨醇溶液加入到上述離屯、管中，在4°C條件下浸泡細胞2小 時；
[014引 2)配制復合預處理劑100mL:將50mM Tris,5mM邸TA,5%e-琉基乙醇混合均勻；
[0149] 3)配制混合酶處理劑Iml:蝸牛酶4mg/mL，溶菌酶3mg/mL，纖維素酶3mg/mL
[0150] 4)加入20化1復合預處理劑于離屯、管中，35。(：處理細胞1小時；
[0151] 5) 500化pm離屯、5min將細胞收集至管底，棄去處理劑；
[0152] 6)加入20化1無菌水洗涂細胞兩次，500化pm離屯、5min，棄去液體；
[0153] 7)加入20化1混合酶處理劑，37 °C處理12小時；
[0154] 8) 500化pm離屯、5min將細胞收集至管底，棄去液體；
[0巧日]9)加入SOiil PBS洗涂細胞一次，500化pm離屯、5min，棄去液體，保留祉1細胞懸液。
[0156] 3.微量黑曲霉原生質曲NA的提取和擴增
[0157] 銜接步驟2中祉1細胞懸液，加入RE化I-g Single Cell Kit(德國Qiagen公司）中3 iil Buffer D2,混勻并瞬時離屯、，65°C解育IOmin;加入化1試劑盒中Stop Solution,混勻并 瞬時離屯、，暫時保存于冰上;每個擴增反應中加40iU PCR反應液(按試劑盒說明書配制:此0 SC 化1，RE化I-g SC Reaction Buffer 2化1，RE化I-g SC DNA Polymerase 2]il)，30°C反 應8小時；于65°C3min下使RE化I-g DNA聚合酶失活，即為提取的黑曲霉曲NA。
[015引 4.微量曲NA建庫
[0159] 按照試劑盒NEHNext?叫haDNA LibraiT Prep Kit forlllu拍虹a霞（美國肥B公 司）對W上黑曲霉曲NA進行建庫。
[0160] 5.新一代基因組測序
[0161] 用Illumina MiSeq儀器及相應試劑（MiSeq 600 cycles Reagent V3美國 111皿ina公司）對W上建庫的曲NA進行全基因組測序。
[0162] 6.生物信息學分析
[0163] 使用SPAdes軟件對測序數據進行組裝，得到組裝結果與NCBI公開數據庫nt庫進行 比對，判定是黑曲霉。
[0164] 實施例6
[0165] 1.微量皮炎芽生菌細胞的獲取:顯微涂片、激光切割，獲得單個目的細胞
[0166] 將微量樣本涂于激光顯微切割覆膜載玻片化eica Membrane Slides陽N2.0微米 或類似產品），用激光顯微切割系統化eica LMD7000或類似產品）在63倍放大下找到目的細 胞，用激光強度42微焦(可設范圍laser power 40 + 3)對所選出的單個真菌細胞進行激光 顯微切割，落于無菌的離屯、小管中，重復上述操作共獲取30個真菌細胞(可獲取細胞數范圍 1-100個）。2.皮炎芽生菌細胞壁破壁:化學法與混合酶法結合提取真菌原生質
[0167] 1)將20化1 0.8M D-山梨醇溶液加入到上述離屯、管中，在4°C條件下浸泡細胞2小 時；
[016引 2)配制復合預處理劑100mL:將50mM Tris,5mM邸TA,5%e-琉基乙醇混合均勻；
[0169] 3)配制混合酶處理劑Iml:溶壁酶5mg/mL，溶菌酶4mg/mL，纖維素酶3mg/mL
[0170] 4)加入20化1復合預處理劑于離屯、管中，35°C處理細胞1小時；
[0171] 5) 500化pm離屯、5min將細胞收集至管底，棄去處理劑；
[0172] 6)加入20化1無菌水洗涂細胞兩次，500化pm離屯、5min，棄去液體；
[0173] 7)加入20化1混合酶處理劑，37°C處理6小時；
[0174] 8) 500化pm離屯、5min將細胞收集至管底，棄去液體；
[01巧]9)加入SOiil PBS洗涂細胞一次，500化pm離屯、5min，棄去液體，保留IOiil細胞懸液。
[0176] 3.微量皮炎芽生菌原生質曲NA的提取和擴增
[0177] 銜接步驟2中10山細胞懸液，加入RE化I-g Single Cell Kit(德國Qiagen公司）中 化IBuffer D2,混勻并瞬時離屯、，65°C解育IOmin;加入化1試劑盒中Stop Solution,混勻并 瞬時離屯、，暫時保存于冰上;每個擴增反應中加40iU PCR反應液(按試劑盒說明書配制:此0 SC 化1，RE化I-g SC Reaction Buffer 2化1，RE化I-g SC DNA Polymerase 2]il)，30°C反 應8小時;于65°C3min下使RE化I-g DNA聚合酶失活，即為提取的皮炎芽生菌曲NA。
[017引 4.微量曲NA建庫
[0179] 按照試劑盒NEBN巧㈱UltraDNA Libra巧 Prep Kit forlllumina⑥（美國肥B公 司）對W上皮炎芽生菌曲NA進行建庫。
[0180] 5.新一代基因組測序
[0181] 用Illumina MiSeq儀器及相應試劑（MiSeq 600 cycles Reagent V3美國 111皿ina公司）對W上建庫的曲NA進行全基因組測序。
[0182] 6.生物信息學分析
[0183] 使用SPAdes軟件對測序數據進行組裝，得到組裝結果與NCBI公開數據庫nt庫進行 比對，判定是皮炎芽生菌。
[0184] 實施例7
[0185] 1.微量粗球抱子菌細胞的獲取:顯微涂片、激光切割，獲得單個目的細胞
[01化]將微量樣本涂于激光顯微切割覆膜載玻片化eica Membrane Slides陽N2.0微米 或類似產品），用激光顯微切割系統化eica LMD7000或類似產品）在63倍放大下找到目的細 胞，用激光強度40微焦(可設范圍laser power 40 + 3)對所選出的單個真菌細胞進行激光 顯微切割，落于無菌的離屯、小管中，重復上述操作共獲取5個真菌細胞(可獲取細胞數范圍 1-100個）。
[0187] 2.粗球抱子菌細胞壁破壁:化學法與混合酶法結合提取真菌原生質
[0188] 1)將20化1 0.8M D-山梨醇溶液加入到上述離屯、管中，在4°C條件下浸泡細胞2小 時；
[0189] 2)配制復合預處理劑100mL:將50mM Tris,5mM邸TA,5%e-琉基乙醇混合均勻；
[0190] 3)配制混合酶處理劑Iml:蝸牛酶4mg/mL，溶壁酶2mg/mL，溶菌酶3mg/mL，纖維素酶 4mg/mL；
[0191] 4)加入200til復合預處理劑于離屯、管中，35它處理細胞1小時；
[0192] 5) 500化pm離屯、5min將細胞收集至管底，棄去處理劑；
[0193] 6)加入20化1無菌水洗涂細胞兩次，500化pm離屯、5min，棄去液體；
[0194] 7)加入20化1混合酶處理劑，37 °C處理6小時；
[01巧]8) 500化pm離屯、5min將細胞收集至管底，棄去液體；
[0196] 9)加入SOiil PBS洗涂細胞一次，500化pm離屯、5min，棄去液體，保留化1細胞懸液。
[0197] 3.微量粗球抱子菌原生質曲NA的提取和擴增
[019引銜接步驟2中化1細胞懸液，加入RE化I-g Single Cell Kit(德國Qiagen公司）中3 iil BufferD2,混勻并瞬時離屯、，65°C解育IOmin;加入化1試劑盒中Stop Solution,混勻并 瞬時離屯、，暫時保存于冰上;每個擴增反應中加40iU PCR反應液(按試劑盒說明書配制:此0 SC 化1，RE化I-g SC Reaction Buffer 2化1，RE化I-g SC DNA Polymerase 2]il)，30°C反 應8小時;于65°C3min下使RE化I-g DNA聚合酶失活，即為提取的粗球抱子菌曲NA。
[0199] 4.微量曲NA建庫
[0200] 按照試劑盒NEBN株炮叫haDNA Library Prep Kit foril山虹ina?(美國肥B公 司）對W上粗球抱子菌曲NA進行建庫。
[0201] 5.新一代基因組測序
[0202] 用Illumina MiSeq儀器及相應試劑（MiSeq 600 cycles Reagent V3美國 111皿ina公司）對W上建庫的曲NA進行全基因組測序。
[0203] 6.生物信息學分析
[0204] 使用SPAdes軟件對測序數據進行組裝，得到組裝結果與NCBI公開數據庫nt庫進行 比對，判定是粗球抱子菌。
【主權項】
1. 一種利用單細胞測序檢測微量真菌的方法，包括以下步驟： (1) 微量真菌細胞的獲取:將微量真菌樣本涂于激光顯微切割覆膜載玻片上，用激光顯 微切割系統找到目的細胞，用激光強度37-43微焦對所選出的單個真菌細胞進行激光顯微 切割，獲得單個目的細胞，重復上述操作獲取總數為1-100個的目的細胞； (2) 真菌細胞壁破壁:化學法與混合酶法結合提取真菌原生質； 1) 將0.8M D-山梨醇溶液加入到裝有上述目的細胞的離心管中，在4°C條件下浸泡目的 細胞2小時； 2) 配制復合預處理劑:將50mM Tris，5mM EDTA，5%0-巰基乙醇混合均勻； 3) 配制混合酶處理劑:將蝸牛酶1-lOmg/mL，溶壁酶1-lOmg/mL，溶菌酶1-lOmg/mL，纖維 素酶1-lOmg/mL四種酶中的至少兩種酶按一定比例混合，當所述混合酶處理劑僅由兩種酶 混合組成時，其中至少包括蝸牛酶和溶壁酶中的一種； 4) 將上述復合預處理劑加入裝有目的細胞的離心管中，35°C處理細胞1小時； 5) 上述離心管經離心后將細胞收集至管底，棄去處理劑； 6) 向上述離心管中加入無菌水洗滌細胞兩次，離心，棄去液體； 7) 向上述離心管中加入混合酶處理劑，35-45°C處理3-12小時； 8) 上述離心管經離心后將細胞收集至管底，棄去液體； 9) 向上述離心管中加入PBS洗滌細胞一次，離心，棄去液體，保留4-10μ1細胞懸液； (3) 微量真菌原生質gDNA的提取和擴增：利用單細胞全基因組擴增試劑盒對上述步驟 中獲得的4-10μ1細胞懸液進行核酸提取及擴增反應，獲得上述真菌gDNA; (4) 微量gDNA建庫:利用DNA建庫試劑盒對上述真菌gDNA進行建庫； (5) 基因組測序:對上述建庫的真菌gDNA進行全基因組測序； (6) 生物信息學分析:利用相關軟件對測序獲得的數據進行組裝，得到組裝結果與相關 公開數據庫進行比對，判定所檢測真菌的種類。2. 如權利要求1所述利用單細胞測序檢測微量真菌的方法，其特征在于:所述真菌包括 念珠菌屬中的白色念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌、都柏林念 珠菌；曲霉屬中的煙曲霉、黃曲霉、土曲霉、構巢曲霉、黑曲霉、焦曲霉;隱球菌屬中的新生隱 球菌、格特隱球菌以及上述各菌種的變種。3. 如權利要求1所述利用單細胞測序檢測微量真菌的方法，其特征在于:所述真菌包括 馬拉色菌。4. 如權利要求1所述利用單細胞測序檢測微量真菌的方法，其特征在于:所述真菌包括 組織胞漿菌、伊蒙菌、申克氏孢子絲菌、馬爾尼菲青霉、巴西副球孢子菌、皮炎芽生菌、粗球 孢子菌。5. 如權利要求1-4中任一項所述的利用單細胞測序檢測微量真菌的方法，其特征在于： 其中的第(2)步驟如下： (2)真菌細胞壁破壁:化學法與混合酶法結合提取真菌原生質； 1) 將0.8M D-山梨醇溶液加入到裝有上述目的細胞的離心管中，在4°C條件下浸泡目的 細胞2小時； 2) 配制復合預處理劑:將50mM Tris，5mM EDTA，5%0-巰基乙醇混合均勻； 3) 配制混合酶處理劑:蝸牛酶6mg/mL，溶壁酶4mg/mL; 4) 將上述復合預處理劑加入裝有目的細胞的離心管中，35°C處理細胞1小時； 5) 上述離心管經離心后將細胞收集至管底，棄去處理劑； 6) 向上述離心管中加入無菌水洗滌細胞兩次，離心，棄去液體； 7) 向上述離心管中加入混合酶處理劑，37 °C處理6小時； 8) 上述離心管經離心后將細胞收集至管底，棄去液體； 9) 向上述離心管中加入PBS洗滌細胞一次，離心，棄去液體，保留4μ1細胞懸液。6. 如權利要求1-4中任一項所述的利用單細胞測序檢測微量真菌的方法，其特征在于： 其中的第(2)步驟優選如下： 3)配制混合酶處理劑:蝸牛酶6mg/mL，溶菌酶4mg/mL; 7)向上述離心管中加入混合酶處理劑，45 °C處理10小時； 9)向上述離心管中加入PBS洗滌細胞一次，離心，棄去液體，保留5μ1細胞懸液。7. 如權利要求1-4中任一項所述的利用單細胞測序檢測微量真菌的方法，其特征在于： 其中的第(2)步驟優選如下： 3)配制混合酶處理劑:蝸牛酶4mg/mL，溶壁酶4mg/mL，溶菌酶4mg/mL; 7)向上述離心管中加入混合酶處理劑，35 °C處理8小時； 9)向上述離心管中加入PBS洗滌細胞一次，離心，棄去液體，保留6μ1細胞懸液。8. 如權利要求1-4中任一項所述的利用單細胞測序檢測微量真菌的方法，其特征在于： 其中的第(2)步驟優選如下： 3)配制混合酶處理劑:蝸牛酶4mg/mL，溶壁酶3mg/mL，纖維素酶3mg/mL; 7)向上述離心管中加入混合酶處理劑，37 °C處理3小時； 9)向上述離心管中加入PBS洗滌細胞一次，離心，棄去液體，保留6μ1細胞懸液。9. 如權利要求1-4中任一項所述的利用單細胞測序檢測微量真菌的方法，其特征在于： 其中的第(2)步驟優選如下： 3)配制混合酶處理劑:蝸牛酶4mg/mL，溶菌酶3mg/mL，纖維素酶3mg/mL; 7)向上述離心管中加入混合酶處理劑，37 °C處理12小時； 9)向上述離心管中加入PBS洗滌細胞一次，離心，棄去液體，保留8μ1細胞懸液。10. 如權利要求1-4中任一項所述的利用單細胞測序檢測微量真菌的方法，其特征在 于:其中的第(2)步驟優選如下： 3)配制混合酶處理劑:溶壁酶5mg/mL，溶菌酶4mg/mL，纖維素酶3mg/mL; 7)向上述離心管中加入混合酶處理劑，37 °C處理6小時； 9)向上述離心管中加入PBS洗滌細胞一次，離心，棄去液體，保留10μ1細胞懸液。11. 如權利要求1-4中任一項所述的利用單細胞測序檢測微量真菌的方法，其特征在 于:其中的第(2)步驟優選如下： 3)配制混合酶處理劑:蝸牛酶4mg/mL，溶壁酶2mg/mL，溶菌酶3mg/mL，纖維素酶4mg/mL; 7)向上述離心管中加入混合酶處理劑，37 °C處理6小時； 9)向上述離心管中加入PBS洗滌細胞一次，離心，棄去液體，保留6μ1細胞懸液。12. -種根據權利要求1所述利用單細胞測序檢測微量真菌的方法制成的真菌檢測試 劑盒，所述真菌檢測試劑盒適用于以下領域:工業生產、環境監測、空氣檢測、土壤檢測、水 質檢測、食品檢測、藥品檢測、化妝品檢測、保健品檢測以及醫學檢測。
【文檔編號】C12Q1/04GK105925720SQ201610535044
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年7月8日
【發明人】楊英, 王升啟, 周喆, 王澎, 李珍, 李宗瑋
【申請人】中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所