弓形蟲檢測并聯探針、基因芯片、試劑盒與檢測方法
【專利摘要】弓形蟲檢測并聯探針、基因芯片、試劑盒與檢測方法。本發明公開了一種弓形蟲檢測并聯探針，包括探針1、2、3，序列分別為SEQ ID NO.1～3；還公開了含有上述探針的基因芯片以及該基因芯片的試劑盒；還公開了利用該試劑盒進行弓形蟲檢測的方法：使用本發明弓形蟲檢測試劑盒進行檢測，當檢測對象的三個探針顯示的檢測結果一致時可以判斷樣品是否感染弓形蟲；當檢測對象的三個探針顯示的檢測結果不一致時，不能判斷該待測樣品為陽性或陰性，使用該檢測試劑盒重新檢測或者使用現有其它檢測方法進行進一步驗證。本發明操作簡單、結果易讀，滿足醫院、產前檢測等的現場檢測需求，結果準確可靠。
【專利說明】
弓形蟲檢測并聯探針、基因巧片、試劑盒與檢測方法
技術領域
[0001] 本發明屬于分子生物學領域，設及一種弓形蟲檢測并聯探針、基因忍片、試劑盒與 檢測方法。
【背景技術】
[0002] 弓形蟲（Toxoplasma)中醫叫S尸蟲，屬于頂端復合物亞口，抱子蟲綱，真球蟲目， 等抱子球蟲科、弓形體屬，是細胞內寄生蟲。寄生于細胞內，隨血液流動，到達全身各部位， 破壞大腦、屯、臟、眼底，致使人的免疫力下降，患各種疾病。弓形蟲是一種可通過水源和食源 傳播的寄生蟲病，對人和動物健康具有極大潛在危險，它們寄生于宿主細胞內，可W感染包 括人在內的所有恒溫脊椎動物。弓形蟲感染人在某些情況下，后果非常嚴重甚至有生命危 險，例如妊娠期間的胎兒和免疫缺陷的人群。動物感染弓形蟲會造成母畜流產、木乃伊胎、 死胎，豬場爆發本病，死亡率更是高達60% W上。但是，目前檢測弓形蟲的方法比較常用的 方法是化ISA法，普遍存在敏感性低、特異性差、存在假陽性的缺點。弓形蟲的感染影響著人 口素質，與優生優育有重要關系。
[0003] 生物忍片技術是九十年代發展起來的一項新興生物技術。按照檢測對象來分類， 可W分為基因忍片和蛋白質忍片等兩大類。相較于蛋白質忍片，基因忍片利用的是核巧酸 鏈之間的互補作用，特異性強，重現性好。基因忍片指的是將大量(通常每平方厘米點陣密 度高于400)探針分子固定于支持物上后與標記的樣品分子雜交，通過檢測每個探針分子的 雜交信號強度進而獲取樣品分子的數量和序列信息。采用基因忍片進行檢測，其檢測通量 大，直接針對病原體基因進行，結果更準確，具有檢測靈敏度高、特異性好，所需樣本量少等 優點。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一種特異性好、結果準確、假陽性率低、檢測效率高的弓形蟲 檢測的并聯探針、基因忍片、試劑盒與檢測方法。
[0005] 本發明實現其目的的技術方案為：
[0006] -種弓形蟲檢測并聯探針，包括探針1、2、3,序列分別為SEQ ID NO.1~3。
[0007] -種弓形蟲檢測基因忍片，包括固體相和權利要求1所述的探針組。
[000引作為優選地，所述固相載體為氨基修飾的玻璃基片、尼龍膜或者硝酸纖維素膜。
[0009] -種弓形蟲檢測試劑盒，包括前述的基因忍片。
[0010] 在上述弓形蟲檢測試劑盒中，還包括弓形蟲祀基因擴增引物對，引物對序列如SEQ ID N0.4、5所示。
[0011] 作為優選地，所述引物對的下游引物的5'端含有生物素標記。
[0012] 作為優選地，上述弓形蟲檢測試劑盒，還包括PCR反應體系、雜交緩沖液、親和素、 洗涂液、TMB顯色液。
[001引在上述技術方案中，10化的PCR反應體系包括：50~ISOngAiL的擴增模板0.4化， Premix化q化L，濃度為8~12iiM的上、下游引物各0.化L。
[0014] -種弓形蟲檢測方法，使用前述的弓形蟲檢測試劑盒進行檢測，當檢測對象的= 個探針顯示的檢測結果一致時可W判斷樣品是否感染弓形蟲；當檢測對象的=個探針顯示 的檢測結果不一致時，不能判斷該待測樣品為陽性或陰性，使用該檢測試劑盒重新檢測或 者使用現有其它檢測方法進行進一步驗證。
[0015] 作為優選地，PCR 擴增反應程序為 95。[5111111;95。(：103、55。[303、72。[303、30個循 環；72°C10min。
[0016] 本發明的有益效果是:設計=條高特異性的探針，當3條探針均檢測出陽性時才判 斷該項指標為陽性，能極大的提高產品的準確性和精確性，減少其它方法容易出現的假陽 性問題;本發明通過PCR技術對病原體基因組進行擴增，檢測的特異性高，擴增產物與生物 忍片上的寡核巧酸探針進行雜交，通過生物素標記，顯色液進行顯色后，可W用普通數碼相 機拍照或肉眼直接判讀，直觀的表現檢測結果，檢測操作簡單、結果易讀，滿足醫院、產前檢 測等的現場檢測需求，為優生優育及診斷弓形蟲感染提供可靠的實驗依據。
【附圖說明】
[0017] 圖1為檢測弓形蟲的基因忍片示意圖。
[001引圖2為待測樣品弓形蟲基因擴增后PCR產物電泳條帶圖；Y-T:弓形蟲;M: 1000 Obp m過rker0
【具體實施方式】
[0019] W下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
[0020] 主要試劑及生產者：
[0021] 氨基修飾的玻璃基片（武漢陽達生物科技有限公司），病毒基因組DNA/RNA共提試 劑盒(貨號DP438,天根生化科技(北京)有限公司），親和素(辣根過氧化物酶標記）（碧云天 生物技術研究所），TMB顯色液(上海生工生物工程有限公司），Premix Taq(TAKARA公司，日 本）：成分為PrimeSTAR 服 DNA Polymerase,dNTP Mixture,PrimeSTARBuffer。
[0022] 引物合成公司為英濰捷基(上海)貿易有限公司。
[0023] 實施例1目的片段引物與探針設計
[0024] 查找NCBI數據庫中弓形蟲的基因序列，選擇高特異性的基因序列作為祀序列（ID 號為:AF179871.1)，設計引物與探針。祀序列確定后，根據引物與探針設計原則，設計弓形 蟲祀基因的擴增引物與探針，為了使忍片結果用顯色液顯色后可直接通過肉眼判讀，在弓 形蟲祀基因擴增引物的R引物5'端用生物素進行標記，具體序列如下：
[0025] 弓形蟲(TOX)祀基因擴增引物：
[0026] F引物（T0X-F):5'-CGTATTGTCGAGTAGATCAG-3,（沈Q ID N0.4)，
[0027] 巧|物（1'0乂-1〇:5'-61〇^11-1'〔6押6〔66八6八〔八6〔6八八6(569 10^).5)-3'。
[002引 TOX并聯探針：
[0029] TOX 探針 1:
[0030] 5，-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAACATCCGTTCATGAGTATAAG-3，（沈Q ID NO.1)，
[0031] TOX 探針 2:
[0032] 5'-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAGACGCTAATGTGTTTGCA-3'（沈Q ID N0.2)，
[0033] TOX 探針 3:
[0034] 5 '-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGTGAAATTCATGAGTATCT-3 '（SEQ ID NO.3)。
[0035] 實施例2忍片的制備
[0036] 將實施例1中TOX的并聯探針按照表1的順序點樣到氨基修飾的玻璃基片上，得到 含有探針的基因忍片(如圖1所示）。探針濃度為30iiM，每個點0.化L，然后80°C解育1.5小時。
[0037] 表1弓形蟲檢測忍片探針排列順序 [00381
[0039] 實施例3檢測方法
[0040] 1、待測樣品基因組提取
[0041] 使用病毒基因組DNA/RNA共提試劑盒，按照操作說明書的步驟提取待測樣品的基 因組作為擴增模板。
[00創 2、PCR擴增目的片段
[0043] 經過大量實驗摸索，確定TOX檢測的祀基因 PCR擴增體系和PCR反應程序。
[0044] 總體積化化L的PCR擴增體系含有如下試劑：
[0045]
[0046] PCR 反應程序為：951：5111111;95°(：1〇3、551：3〇3、721：3〇3、30個循環；72°(：1〇111111。
[0047] 3、PCR產物與忍片雜交 [004引按照如下步驟操作：
[0049] a.在實施例2中制備好的基因忍片上，將待測樣品的PCR擴增產物點樣到3個探針 的檢測孔中，具體步驟為:PCR產物95°C解鏈5分鐘，迅速置于冰上，PCR產物與雜交緩沖液 (50%甲酯胺，10 X SSC，0.2%SDS)等體積混合，每孔點10微升混合液，在濕盒中，于60°C雜 交解育2小時。
[0050] b.取出解育后的基因忍片，用洗涂液(0.3 X SSC緩沖液)清洗3次，驚干忍片。
[0化1] C.將親和素(辣根過氧化物酶標記)加到驚干的忍片上，室溫解育lOmin。
[0052] d.用洗涂液(0.3 X SSC緩沖液)清洗3次后驚干。
[0053] e.在驚干的基因忍片上點樣TMB顯色液，反應15分鐘，拍照，統計結果，檢測對象為 陽性的樣品TMB顯色反應后溶液顏色由藍色變為黃色。
[0054] 實施例4檢測待測樣品
[0055] 從第=軍醫大學獲取感染了弓形蟲的樣本20份(陰道分泌物），按照實施例1和3中 的引物和方法分別提取待測樣品的基因組，進行PCR擴增后，使用實施例2中的基因忍片進 行檢測。PCR擴增后的產物電泳條帶表明本發明設計的弓形蟲祀序列擴增引物特異性高，能 特異、靈敏地擴增出目標基因（如圖2所示）。
[0056] 對于感染了弓形蟲的樣品，TMB顯色反應后溶液顏色由藍色變為黃色，表明樣品為 陽性，感染了該病原體，檢測中設置陽性和陰性對照。判斷檢測結果時，當=個探針均顯示 陽性時才判斷該樣品感染了病原體，如果其中某一個或者兩個探針顯示陰性，則應對該檢 測樣品重新檢測，=個探針結果須一致才能采信該檢測結果。=個探針檢測結果不一致時， 也可使用現有其它技術(比如Elisa方法)進一步檢測驗證。
[0057] 使用本發明方法檢測的20份已知陽性樣品中，有19份樣品檢測時，基因忍片上的3 個并聯探針均顯示陽性，與實際情況相符；另外1份樣品的檢測結果顯示，3個并聯探針中2 個探針顯示陽性、1個探針顯示陰性，對運份可疑樣品利用本發明的基因忍片重新檢測，3個 探針均顯示陽性，并且利用El i sa方法對該樣品進一步檢測確認，El i sa結果顯示該樣品為 感染弓形蟲陽性。本發明的探針、基因忍片、試劑盒，特異性高、結果非常準確，檢測快速、工 作效率高，操作簡單、結果易讀，滿足醫院、產前檢測等的現場檢測需求，為優生優育及診斷 弓形蟲感染提供可靠的實驗依據。
【主權項】
1. 一種弓形蟲檢測并聯探針，其特征在于:包括探針1、2、3,序列分別為SEQ ID NO.1~ 3〇2. -種弓形蟲檢測基因芯片，其特征在于:包括固體相和權利要求1所述的探針組。3. 如權利要求2所述的弓形蟲檢測基因芯片，其特征在于:所述固相載體為氨基修飾的 玻璃基片、尼龍膜或者硝酸纖維素膜。4. 一種弓形蟲檢測試劑盒，其特征在于:包括權利要求2或3所述的基因芯片。5. 如權利要求4所述的弓形蟲檢測試劑盒，其特征在于:還包括弓形蟲靶基因擴增引物 對，引物對序列如SEQ ID NO.4、5所示。6. 如權利要求5所述的弓形蟲檢測試劑盒，其特征在于:所述引物對的下游引物的5'端 含有生物素標記。7. 如權利要求6所述的弓形蟲檢測試劑盒，其特征在于:還包括PCR反應體系、雜交緩沖 液、親和素、洗滌液、TMB顯色液。8. 如權利要求7所述的弓形蟲檢測試劑盒，其特征在于：IOyL的PCR反應體系包括:50~ 150ng/yL的擴增模板0 · 4yL，Premix Taq 5yL，濃度為8~12μΜ的上、下游引物各0 · 2yL。9. 一種弓形蟲檢測方法，其特征在于:使用權利要求4至8任一項所述的弓形蟲檢測試 劑盒進行檢測，當檢測對象的三個探針顯示的檢測結果一致時可以判斷樣品是否感染弓形 蟲；當檢測對象的三個探針顯示的檢測結果不一致時，不能判斷該待測樣品為陽性或陰性， 使用該檢測試劑盒重新檢測或者使用現有其它檢測方法進行進一步驗證。10. 如權利要求9所述的弓形蟲檢測方法，其特征在于:PCR擴增反應程序為95 °C 5min; 95。(：1〇8、551€3〇8、721€3〇8、30個循環；72。(：1〇11^11。
【文檔編號】C12Q1/68GK105925700SQ201610396885
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月6日
【發明人】周勇, 徐建
【申請人】重慶威斯騰生物醫藥科技有限責任公司