一種檢測卡那霉素的方法
【專利摘要】本發明提供了一種檢測卡那霉素的方法，本發明采用雙限制性內切酶切割位點及基于G?四連體引發的顏色變化來檢測卡那霉素，具體制備方法：將發夾和卡那霉素特異性結合；將均相反應混合液加入顯色劑顯示檢測。本發明利用了G?四聯體的氧化性，實現了對目標物卡那霉素的高特異性檢測；利用核酸工具酶，起到了信號放大的作用。
【專利說明】
-種檢測卡那霉素的方法
技術領域 [0001] 本發明設及傳感器技術領域，特別設及一種檢測卡那霉素的比色傳感器。
【背景技術】 [0002] 卡那霉素是一種蛋白質生物合成抑制劑，通過與30S核糖體結合從而致使MRNA密碼誤 讀。若細菌中產生一種破壞卡那霉素的酶，則可變為抗性株。卡那霉素抗性的質粒經常被作 為選擇基因或標記基因用于分子克隆中。卡那霉素是一種氨基糖巧類抗生素。對多數腸桿 菌科細菌如大腸埃希菌、克雷伯菌屬、腸桿菌屬、變形桿菌屬、志賀菌屬、沙口菌屬、構祿酸 桿菌屬、普羅菲登菌屬、耶爾森菌屬等均有良好抗菌作用;流感嗜血桿菌、布魯菌屬、腦膜炎 奈瑟菌、淋病奈瑟菌等對本品也大多敏感。卡那霉素對葡萄球菌屬（甲氧西林敏感株)和結 核分枝桿菌亦有一定作用，對銅綠假單胞菌無效。其他革蘭陽性細菌如溶血性鏈球菌、肺炎 鏈球菌、腸球菌屬和厭氧菌等對本品多數耐藥。近年來耐藥菌株顯著增多，由于某些細菌產 生氨基糖巧類純化酶，使之失去抗菌活性。卡那霉素與鏈霉素、新霉素有完全交叉耐藥，與 其他氨基糖巧類可有部分交叉耐藥。卡那霉素使用不當會引起神經和皮膚過敏反應，所W 檢測卡那霉素是很重要的。
[0003] 檢測卡那霉素的方法有分光光度法，酶聯免疫法，膠體金免疫層析法及電化學檢 測方法等，運些方法有儀器操作復雜，需要專業操作人員等缺點。
【發明內容】
[0004] 本發明針對現有檢測方法中儀器操作復雜，需要專業操作人員的缺點，提供了一種檢 測卡那霉素的比色傳感器。
[0005] 本發明是通過W下步驟得到的： 本發明中一共用到W下幾條鏈，其序列分別是： PP:5~GGG TTG GGC GGG ATG GGT TT AA T CAC ~3 (SEQ:ID:NO:1); AP:5~GGT TGA GGA AAC TAG CTT ATT AAA TTT AGT GAT TAAA CCCAT C ~3(沈Q:ID: N0:2)； HAP(發卡）：：5~TGG GGG TTG AGG CTA AGC CGA TTGATCC T GGATCTTTT AAT CAC TAA ATTTAA TA AGC T AGT TT CCT CAA C03 (SEQ: ID:NO: 3); Primer(引物）：5~GGTT GAG GAA A ~3 (SEQ:ID:N0:4)。
[0006] 本發明中用到了兩種酶:pM29 DNA聚合酶和化.Alwi內切酶。地i29 DNA聚合酶在 引物與模板的作用下，沿著模板鏈從5'端向3'端生長，聚合出與模板鏈堿基完全互補的序 列。Nt .ALwi內切酶可W在特異性位點實現對DNA雙鏈的特異性切割，其特異性的切割識別 序列是，切割位點是在M和N之間。
[0007] 本發明中卡那霉素的檢測是在均相溶液中實現的，通過循環和鏈的重復利用的方 式來實現信號的放大，從而實現卡那霉素的高靈敏，特異性的檢測，并獲得較低的檢測下 限。
[0008] 均相中發生的反應主要有:HAP由四部分組成：卡那霉素的aptamer，內切酶的識 別序列，內切酶的互補序列和Primer的互補序列。當有卡那霉素存在時，由于卡那霉素的 aptamer與目標物之間的特異性識別與結合，可W將發卡打開，使HAP上內切酶的識別序列 和引物(primer)的互補序列W單鏈的形式暴露在外面。隨后均相中的primer可W通過堿基 互補配對與打開的HAP雜交成一定的雙鏈。在phi29DNA聚合酶的作用下，primerW打開的 HAP為模板生長成完全互補的雜交雙鏈，限制性內切酶在相應的切割位點進行切割，因為 HAP有限制性內切酶的切割位點和其切割位點的互補序列，限制性內切酶在雙鏈上進行切 害d，切下來的鏈既是引物又是模板，切下來的Pl與aptamer互補，運樣又可W打開發夾，然 后重復上述過程。此為第一步循環放大（目標物誘導的循環放大）。
[0009] 第二步放大仍是在均相中產生的，上述循環放大的結果是產生大量的被切割的鏈 Tl，在Tl中加入PP和AP的雜交鏈，AP和Tl的結合能力強于AP和PP的結合，所W，Tl與AP結 合，只剩下PP運個單鏈，PP富含G堿基，加入血紅素形成G四聯體，加入雙氧水和ABTS有明顯 的顏色變化。
[0010]在均相反應中，反應條件為37°C，反應時間是2個小時。
[0011] 所述的生物傳感器的制備方法，包括W下步驟： (1) 使用目標物打開發夾； (2) 切割下的序列與AP結合，使含有大量師咸基的鏈呈單鏈； (3) 對序列進行比色檢測。
[0012] 所述的制備方法，檢測物卡那霉素打開發夾的操作步驟如下:將化L的發夾與化L 的卡那霉素混合，在37°C下解育0.化。
[0013] 所述的制備方法，優選將均相反應產物進行信號放大操作步驟如下： (1) 將滅菌水，10 X的buffer緩沖液、發夾及目標物加入離屯、管中，震蕩30s，放入37°C 的恒溫箱中解育0.化； (2) 將(1)中解育好的混合溶液取出，在運混合溶液中加入引物DNTPs，phi29DNA聚合酶 與化.Alwi內切酶，震蕩30s，放入37 °C的恒溫箱中解育化； 其中因為被打開的發夾上有限制性內切酶的切割位點和其切割位點的互補序列，當加 入聚合酶和引物時，被打開的發夾形成雙鏈，并且在限制性內切酶的作用下，在其切割位點 進行切割。運時的切割下來的DNA鏈既是引物又是模板。
[0014] 所述的制備方法，對酶添加在低溫下進行，確保酶的活性。
[0015] 該發明的檢測方式是比色檢測，利用紫外光譜儀進行檢測。在檢測之前，將步驟 (2)中產生的大量的TI與PP和AP形成的雙鏈混合，然后在37°C解育0.5小時，使產生的大量 的Tl與PP和AP形成的雙鏈進行鏈置換反應，由于Tl和AP的結合能力遠大于AP和PP的結合能 力，所WTl和AP形成了雙鏈結構，而PP變成了富含G堿基的單鏈，最后加入ABTS和雙氧水使 信號進行顯色，用紫外光譜儀來檢測待測目標物。
[0016] 本發明基于核酸適配體與目標物的特異性識別，具有鏈置換功能的曲i29DNA聚合 酶，核酸內切酶在特異性位點對核酸鏈的切割作用，鏈置換等溫放大W及底物顯色劑。該傳 感器具有檢測速度快，檢測限低，特異性高等優點，可W彌補檢測卡那霉素現有檢測方法的 缺陷與不足，實現對其快速，準確的檢測。
[0017]本發明的有益效果： 1、 利用了核酸適配體的特異型識別，利用核酸適配體和目標物卡那霉素可W進行特異 性結合來檢測； 2、 利用具有鏈置換功能的地i29 DNA聚合酶，實現了目標物的循環利用，放大了檢測信 號，提高了檢測的靈敏度； 3、 利用核限制性核酸內切酶對特異性序列的識別和切割作用，結合聚合酶，其中對DNA 鏈獨特的設計了雙切割位點，使被切割下來的DNA鏈既是引物又是模板，從而生成了大量可 作為二級目標物的Tl和能繼續打開發夾的API,實現了第二步循環放大，進一步提高了檢測 的靈敏度； 4、 該傳感器的反應條件溫和，反應速度快； 5、 檢測原理的主要過程均是在均相中實現的，提高了反應速度，降低了操作的復雜程 度，實現了目標物的快速，簡單，靈敏的檢測； 6、 制備方法簡單，性能穩定，重復性好，適用于食品，水中卡那霉素的檢測和生物傳感 器產業化的實際應用； 7、 制作的工藝成本低，適用于產業化中價廉的要求。
【附圖說明】 [001 引 圖1為該實驗的原理圖。
【具體實施方式】
[0019] 下面結合具體實施例對本發明進行進一步說明。
[0020] 所述的生物傳感器的制備方法，包括W下步驟： (1) 目標物與發夾的特異性結合； (2) 對檢測的特異性序列進行信號的放大； (3) 對序列進行比色檢測。
[0021] 所述的制備方法，優選將目標物與發夾進行反應，操作步驟如下:將化L目標物卡 那霉素與化L發夾混合，在37°C下解育0.化。
[0022] 所述的制備方法，優選將檢測的信號進行特異性放大的過程如下： (2)將（1)中解育好的混合溶液取出，在運混合溶液中加入引物，dNTPs，phi29DNA聚合 酶與化.Alwi內切酶，震蕩30s，放入37 °C的恒溫箱中解育化； 所述的制備方法，對酶添加在低溫下進行，確保酶的活性。
[0023] (3 )將(2)中的混合溶液與PP和AP雜交鏈一同混合，并繼續放在37 °C的恒溫箱中解 育0.化。
[0024] 該發明的檢測方式是比色檢測，利用紫外光譜儀進行檢測。
[0025] 在檢測之前，將步驟(2)中產生的大量的Tl和API, APl可W繼續循環使用，打開發 夾，Tl可W與AP結合，是PP中12G堿基暴露出來，加入血紅素后，可W形成G四聯體的結構。最 后加入ABTS和雙氧水使信號進行顯色，用紫外光譜儀來檢測待測目標物。
[00%]本發明基于核酸適配體與目標物的特異性識別，具有鏈置換功能的曲i29DNA聚合 酶，核酸內切酶在特異性位點對核酸鏈的切割作用，鏈置換等溫放大W及底物顯色劑。該傳 感器具有檢測速度快，檢測限低，特異性高等優點，可W彌補現有檢測方法的缺陷與不足， 實現對其快速，準確的檢測。
[0027]實施例1 探針雜交的主要步驟如下： 曰、在離屯、管中加入化L的PHI29的buffer(buffer為購買PHI29DNA聚合酶的配套緩沖 液)； b、將祉L的滅菌水加入離屯、管中，并振蕩均勻； 運個時候，我們再進行溶鏈： a、 根據HAP鏈上對應的溶解一 0. D所需的滅菌水數，依次加入； b、 將加入滅菌水的probe鏈放入離屯、機中，設定3000;r/min，離屯、30秒； C、將離屯、好的HAP鏈取出，在每個離屯、管中分別加入化L卡那霉素，四環素，鏈霉素于離 屯、管中，并振蕩均勻。
[002引 d、在依次向各個離屯、管中加入化L的引物，2化dNTPs,化L地i29DNA聚合酶與化 L Nt .Alwi內切酶，在37度恒溫箱中解育一小時； e、再將化L AP和化L PP混合后加入各個離屯、管中，加入血紅素和ABTS，37度恒溫箱中 解育0.5小時，通過變化來檢測目標物。
[0029] 檢測結果為只有加入了卡那霉素的離屯、管中有顏色變化，其余的離屯、管與空白對 照幾乎一致，所W說此生物傳感器對卡那霉素具有特異性識別。
[0030] 實施例2 限制性內切酶優化的主要步驟如下： 曰、在加入目標物的離屯、管中加入化L的DNTP，化LPhi29DNA聚合酶后分別在各個離屯、管 中加入化LNt. Alwi內切酶，1.5化Nt. Alwi內切酶，2化化.Alwi內切酶和2.扣LNt. Alwi內切 酶，3化Nt. Alwi內切酶； b、振蕩均勻后，在37°C解育比； 下面介紹一下均相溶液中發生的反應，均相反應中的主要步驟： C、將滅菌水，10 X的buffer緩沖液、HAP(化L),卡那霉素(2化），地i29 DNA聚合酶(2 y L)，dNTPs(2化），加入離屯、管中，震蕩30s。
[0031] d、將離屯、管中混合溶液依次加入不同濃度的化.Alwi內切酶； e、將(d)中的混合溶液放在37°C的恒溫箱中解育比。
[0032] f、將e中解育好的混合溶液都加入PP和AP的雜交鏈，血紅素及ABTS和雙氧水。充分 反應后紫外光譜儀進行檢測。
[0033] 加入化LNt. Alwi內切酶的樣品中吸光度的峰值最大，加入2.扣LNt. Alwi內切酶和 化LNt. Alwi內切酶樣品的吸光度的峰值跟加入化LNt. Alwi內切酶的樣品中吸光度的峰值 相差不多，而加入其他限制性內切酶濃度的樣品中吸光度的峰值與化LNt. Alwi內切酶的樣 品的吸光度的峰值有比較明顯的差距。所W最佳的限制性內切酶的濃度為化L。
[0034] 實施例3 ABTS濃度的優化主要步驟如下： a、 在離屯、管中加入化L的PHI29的buffer(buffer為購買PHI29DNA聚合酶的配套緩沖 液)； b、 將祉L的滅菌水，2化HA巧日2化濃度分別為10 nM、25 nM、50 nM、75 nM、100 nM目標 物加入離屯、管中，并振蕩均勻，在37度的恒溫箱中水浴0.5小時； C、在b中水浴好的離屯、管中加入化L的DNTP，引物，2iiLPhi29DNA聚合酶，2iiLNt. Alwi內 切酶，在37度的水浴箱中水浴一小時； d、 在C中水浴好的離屯、管中加入AP和PP的雜交鏈，再加入化L的血紅素，在37度的恒溫 箱中水浴0.5小時； e、 將水浴好的離屯、管分別加入0.7扣山LABTS，化LABTS和1.扣LABTS，再加入化L的雙氧 水開始檢測。通過樣品吸光度的峰值，可W看出在目標物濃度為10 nM-75 nM之間，數據呈 線性關系，說明在此范圍內檢測結果有效。具體結果如下表。
[0035]
【主權項】
1. 一種檢測卡那霉素的方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 目標物與發夾的特異性結合； (2) 對檢測的特異性序列進行信號的放大； (3) 對序列用紫外光譜儀進行比色檢測。2. 根據權利要求1所述的檢測卡那霉素的方法，其特征在于，步驟1)的具體檢測方法 為:將2yL目標物卡那霉素與2yL發夾混合，在37°C下孵育0.5h。3. 根據權利要求1所述的檢測卡那霉素的方法，其特征在于，步驟2)中，將1)中孵育好 的混合溶液取出，加入2以1^引物，2以1^(11?1^，2以1^1^290嫩聚合酶與2以1^財.六1"內切酶，震 蕩30s，放入37 °C的恒溫箱中孵育Ih;將孵育液與PP和AP雜交鏈一同混合，并繼續放在37 °C 的恒溫箱中孵育〇.5h。
【文檔編號】C12Q1/68GK105925699SQ201610396248
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月7日
【發明人】王玉, 崔雪君, 黃加棟, 劉素, 王虹智, 郭玉娜
【申請人】濟南大學