一種常溫穩定的pcr預混液的制作方法
【專利摘要】本發明屬于生物技術領域，涉及PCR實驗，具體地，本發明提供了一種PCR預混液，包括Taq酶、緩沖液、dNTP以及甘油、疊氮化鈉和1，2，4?三氮唑等。本發明的PCR預混液能夠在常溫下穩定存在144小時以上，提高工作效率，節省成本。
【專利說明】
-種常溫穩定的PCR預混液
技術領域
[0001 ]本發明屬于生物技術領域，設及PCR實驗。
【背景技術】
[0002] 隨著PCR技術的發展，市場上出現了各種PCR試劑盒，用W體外診斷、動物疾病監 控。一些公司嘗試將化q酶加入PC時式劑中，組成PCR預混液，方便客戶操作。因此，PCR預混液 通常包括dNTP、化q酶和緩沖液等必要成分。
[0003] 然而，現有的PCR預混液在常溫下僅能在4~5小時內進行有效擴增，超過化的常溫 放置之后，性能會有較大的損失。
[0004] -些PCR試劑往往會添加0.02 %~0.09 %疊氮化鋼作為試劑防腐劑。疊氮化鋼防 腐機理與其毒性相關。與氯化物相似，疊氮化鋼對細胞色素氧化酶和其它酶有抑制作用。雖 然疊氮化鋼對一般的PC時式劑有較強的防腐效果，但是對于預混了化q酶的PCR預混液，只添 加0.02 %~0.09 %疊氮化鋼，防腐效果有限，僅能常溫放置不到48小時。
[0005] -些PCR試劑也會加入5 %~15 %的甘油等成分來增強試劑中的聚合酶穩定性，但 是實際測試發現，加入5%~15%甘油的PCR預混液，防腐效果雖有提升，仍然不能在常溫下 放置超過96小時。
[0006] 還有一些PCR試劑會加入0.1~0.2M海藻糖、1 %~10 %右旋糖巧用W穩定化q酶， 但是經實際測試發現，運些預混液仍然不能在常溫下放置超過96小時。
[0007] 因此，本領域希望有一種PCR預混液，可W常溫下放置更長的時間，既能夠減少試 劑的存儲，使使用更加方便，又能減少因試劑在-20°C和常溫下頻繁轉換，反復凍融帶來的 Taq酶性能損失。
【發明內容】
[000引本發明的一個目的是為解決現有PCR預混液常溫下保存時間較短的問題，提供一 種加入幾種混合化合物的可在常溫下穩定存放144小時W上的PCR預混液。
[0009] 本發明的PCR預混液包括Taq酶、緩沖液、dNTP，還進一步包括甘油、疊氮化鋼和1， 2.4- S氮挫。優選地，所述甘油的含量為1 %~10% (W/W)，所述疊氮化鋼的含量為0.002% ~0.09 % (W/W)，所述1，2，4-S氮挫的含量為0.1 %~1 % (W/W)。
[0010] 進一步地，所述PCR預混液還包括Tris-馬來酸巧0~IOOmM,pH 8.7)、Tris-蘋果酸 (50~100mM，pH 8.7)、Tris-班巧酸（50~100mM，pH 8.7)或化is-富馬酸（50~100mM，pH 8.7)中的一種。
[0011] 或者，所述PCR預混液包括化q酶、緩沖液、dNTP，其中，還進一步包括甘油、DMSO、1， 2.4- S氮挫，W及化is-馬來酸、Tris-蘋果酸、Tris-班巧酸或化is-富馬酸中的一種;優選 地，所述DMSO的含量為2 %~10 % (V/V)，其它成分含量如上所述。
[001 ^ 優選地，所述PCR預混液中還包括擴增引物和/或探針。
[0013]優選地，所述PCR預混液中還包括氯化鐘、氯化儀和/或硫酸錠。
[0014]優選地，所述化q酶為熱啟動化q酶。
[001引再一方面，本發明提供本發明的PCR預混液在制備PC時式劑盒中應用。
[0016]經過實驗發現，本發明的PCR預混液可W在常溫下儲存144小時而依然能夠工作， 甚至可W儲存19化，使得本領域技術人員可W方便地進行PCR實驗，提高工作效率，節省成 本。
【附圖說明】
[0017]圖1顯示了放置2地后，試劑組合A、B、C、D、E均可W有效擴增出單增李斯特菌；
[0018] 圖2顯示了放置7化后，試劑組合B、C、D、E可W有效擴增出單增李斯特菌，試劑組合 A無法有效擴增；
[0019] 圖3顯示了放置9加后，試劑C、D、E可W有效擴增出單增李斯特菌，試劑組合A、B無 法有效擴增；
[0020] 圖4顯示了放置16化后，試劑D、E可W有效擴增出單增李斯特菌，試劑組合A、B、C無 法有效擴增；
[0021] 圖5顯示了放置19化后，試劑E可W有效擴增出單增李斯特菌，試劑組合A、B、C、D無 法有效擴增，其中翅起的曲線為試劑組合D。
[0022] 圖6顯示了放置2地后，試劑組合。、6、山1、巧勻可^有效擴增出沙口氏菌；
[0023] 圖7顯示了放置72h后，試劑組合6、山1心可^有效擴增出沙口氏菌，試劑組合尸無 法有效擴增；
[0024] 圖8顯示了放置9加后，試劑I、J可W有效擴增出沙口氏菌，試劑組合F、G、H無法有 效擴增；
[0025] 圖9顯示了放置19化后，試劑J可W有效擴增出沙口氏菌，試劑組合F、G、H、I無法有 效擴增。
【具體實施方式】
[0026] W下將通過具體實施例來說明本
【發明內容】
，但本
【發明內容】
不限于此。如無特殊說 明，W下實施例中所使用的試劑、儀器都是本領域常用試劑、儀器，可W從化學或生物制品/ 制劑公司購買；W下實施例中使用的方法都是本領域常規方法，本領域技術人員根據現有 技術或生產商提供的操作手冊可W毫無疑義地知道運些實驗的操作過程并獲得相應結果。
[0027] 實施例1:
[00%]本實施例比較不同的疊氮化鋼、1，2,4-=氮挫、甘油和Tris緩沖液的組合，研究不 同的PCR預混液在常溫下的保存時間。
[0029] 配制了幾種PCR緩沖液，用單增李斯特菌的引物探針（引自出入境標準SN/T 1870- 2007)做測試;擴增程序為:95°(：15111111;93°(：153,581：353,40個循環。
[0030] 上述單增李斯特菌的引物探針分別為：
[0031] 上游引物為：CTGAATCTCAAGCAAAACCTGGT，
[0032] 下游引物為:CGCGACCGAAGCCAACTA，
[0033] 探針為：5 ' 6-Fam-ATACGATAACATCCACGGCTCTGGCTGG-3 ' B冊 1。
[0034] 按下表配制幾種不同的試劑組合(預混液）：
[00對表1:預混液配方
[O / 1 [
[0038] 配制好W上的試劑組合A、B、C、D、E，放置在常溫環境下。使用購自北京北納創聯生 物技術研究院的單增李斯特菌株（貨號：BNCC185986)，經Roche Hi曲化re PCR Template Pr邱aration Kit提取后，作為PCR模板。每隔一天，對試劑進行巧光PCR測試。如圖1-5所示， 經過實驗發現:不加入甘油、疊氮化鋼、1，2，4-S氮挫、僅使用Tris-Cl的PCR預混液，可W在 常溫下儲存24h;加入2% (W/W)甘油和0.05% (W/W)疊氮化鋼的PCR預混液，可W在常溫下儲 存72h;加入2%(W/W)甘油和0.5%(W/W)1，2,4-S氮挫的PCR預混液，可W在常溫下儲存 96h;加入2 % (W/W)甘油、0.05 % (W/W)疊氮化鋼和0.5 % (W/W) 1，2，4-S氮挫的PCR預混液， 可W在常溫下儲存16化;加入2%(W/W)甘油、0.05%(W/W)疊氮化鋼和0.5%(W/W)1，2,4-S 氮挫，并且用馬來酸調節抑至8.7的PCR預混液，可W在常溫下儲存19化。
[0039] 根據上述結果可見，本發明的PCR預混液在常溫下的保存時間長，可W穩定存放 168小時W上，甚至達到192小時。
[0040] 實施例2
[0041 ]本實施例比較了不同的疊氮化鋼、1，2，4-S氮挫、甘油、DMSO和Tr i S緩沖液的組 合，研究不同的PCR預混液在常溫下的保存時間。
[0042] 配制了幾種PCR緩沖液，用沙口氏菌通用的引物探針（引自出入境標準SN/T 1059.7-2010)做測試;擴增程序為:95 °C15min; 93 °C 15s，58 °C 35s，40 個循環。
[0043] 上述沙口氏菌通用引物探針為：
[0044] 上游引物為:CTCACCAGGAGATTACAACATGG，
[0045] 下游引物為:AGCTCAGACCAAAAGTGACCATC，
[0046] 探針為：5 ' 6-Fam-CACCGACGGCGAGACCGACTTT-3 '冊Ql。按下表配制幾種不同的試劑 組合(預混液）。
[0047] 表2:預混液配方 [00481
[0049]配制好W上的試劑組合。、6、山1心，放置在常溫環境下。使用購自北京北納創聯生 物技術研究院的乙型副傷寒沙口氏菌（貨號BNCC103169)，經Roche High Pure PCR Temp I at e Pr epara tion Kit提取后，作為PCR模板。每隔一天，使用上述模板，對所述試劑組 合F、G、H、I、J進行巧光PCR測試。如圖6-9所示，經過實驗發現:不加入DMS0、疊氮化鋼、1，2， 4-立氮挫，只加入2%(W/W)甘油的PCR預混液，可W在常溫下儲存2地;加入5%(V/V)DMS0、 2%(W/W)甘油的PCR預混液，可W在常溫下儲存24h;加入5%(V/V)DMS0、2%(W/W)甘油和 0.5% (W/W)疊氮化鋼的PCR預混液，可W在常溫下儲存72h;加入5% (V/V)DMS0、2% (W/W)甘 油和0.5 % (W/W) 1，2，4-S氮挫的PCR預混液，可W在常溫下儲存96h;加入5% (V/V)DMS0、 2% (W/W)甘油和0.5% (W/W) 1，2，4-S氮挫，并且用班巧酸調節抑至8.7的PCR預混液，可W 在常溫下儲存19化。
[0050]由實驗結果可見，本發明的PCR預混液在常溫下的保存時間延長，可W在常溫下穩 定存放144hW上，比如168小時，甚至19化。
【主權項】
1. 一種PCR預混液，包括Taq酶、緩沖液、dNTP，其中，還進一步包括甘油、疊氮化鈉以及 1，2,4_三氮唑。2. 根據權利要求1所述的PCR預混液，其中，所述甘油的含量為1 %~10% (W/W)，所述疊 氮化鈉的含量為〇. 002%~0.09% (W/W)，所述1，2，4-三氮唑的含量為0.1 %~1 % (W/W)。3. 根據權利要求1或2所述的PCR預混液，其中，所述PCR預混液還包括Tris-馬來酸（50 ~100mM，pH 8.7)、Tris-蘋果酸（50~100mM，pH 8.7)、Tris-琥珀酸（50~100mM，pH 8.7)或 Tris-富馬酸(50 ~100mM，pH8.7)中的一種。4. 根據權利要求1-3任一項所述PCR預混液，還包括擴增引物和/或探針。5. 根據權利要求4所述的PCR預混液，還包括氯化鉀、氯化鎂和/或硫酸銨。6. 根據權利要求5所述的PCR預混液，其中，所述Taq酶為熱啟動酶。7. -種PCR預混液，包括Taq酶、緩沖液、dNTP，其中，還進一步包括甘油、DMSO、1，2，4-三 氮挫，以及Tr is-馬來酸、Tr is-蘋果酸、Tr is-琥泊酸或Tr is-富馬酸中的一種。8. 根據權利要求7所述的PCR預混液，其中，所述甘油的含量為1 %~10 % (W/W)，所述 0130的含量為2%~10%(￥八），所述1，2,4-三氮唑的含量為0.1%~1%(1/1)，所述1^8-馬來酸、Tris-蘋果酸、Tris-琥珀酸或Tris-富馬酸的含量為50~100mM，pH 8.7。9. 根據權利要求7或8所述的PCR預混液，還包括擴增引物、探針、氯化鉀、氯化鎂和/或 硫酸銨，且其中，所述Taq酶為熱啟動酶。10. 根據權利要求1-9任一項所述的PCR預混液在制備PCR試劑盒中的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK105925692SQ201610321072
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年5月16日
【發明人】疏義林, 張守德
【申請人】安陸市疾病預防控制中心