一種用于檢測奶牛四種遺傳病的核酸質譜的檢測產品及應用

一種用于檢測奶牛四種遺傳病的核酸質譜的檢測產品及應用
【專利摘要】本發明公開了一種可以同時檢測奶牛是否具有脊椎畸形綜合癥(CVM)、白細胞粘附缺陷癥(BLAD)、尿苷酸合酶缺乏癥(DUMPS)、瓜氨酸血癥(CN)四種遺傳病的引物系統。基于該引物系統所制備的產品，能實現同時對奶牛CVM、BLAD、DUMPS、CN四種遺傳病基因相關的4處多態性位點進行檢測。此外，本發明還公開了能夠同時聯合檢測以上遺傳病和奶牛A2基因型的檢測方法及其檢測產品，該聯合檢測的結果可用于指導健康奶牛的篩選、育種等。
【專利說明】
-種用于檢測奶牛四種遺傳病的核酸質譜的檢測產品及應用
技術領域
[0001] 本發明屬于基因檢測領域，設及一種用于檢測奶牛脊椎崎形綜合癥(CVM)、白細胞 粘附缺陷癥(BLAD)、尿巧酸合酶缺乏癥(DUMPS)、瓜氨酸血癥(CN)四種遺傳病相關的基因突 變的核酸質譜的制備方法及應用。具體而言，即利用多重PCR技術、單堿基延伸技術和質譜 技術，對奶牛的化C35A3基因4號外顯子第559位、CD18基因第二外顯子第55位、UMPS基因第5 個外顯子上的密碼子405位、ASS基因第5外顯子的第86個氨基酸進行檢測，確定某奶牛在該 四個位點處是否存在突變，設及篩選無此四種遺傳病的奶牛的篩選方法。
【背景技術】
[0002] 荷斯坦奶牛是當前世界各國廣泛使用的奶牛品種，用于生產大量鮮乳供應我們日 常食物的需求，經高度選育與良好的飼養管理，生產性能不斷提高，在人類生活中發揮著越 來越重要的作用。
[0003] 隨著人工授精技術和胚胎移植技術的發展，有潛力的優良公牛被用于制作大量冷 凍精液，供給眾多母牛配種使用，其優良遺傳性能迅速地傳播至世界各地。然而，奶牛間的 近交現象也不斷增加，若追溯全世界荷斯坦奶牛的系譜，其親緣大都密集地來自幾個特定 的公牛家族。此外，具有遺傳缺陷的公牛攜帶者不會表現任何病癥，一旦其凍精被大規模使 用，其隱性有害基因則會在牛群中快速傳播，給奶牛業造成巨大經濟損失。在我國，進口檢 驗檢疫的重點在于防止動物傳染病和寄生蟲病的傳入，對遺傳病的危害尚缺乏足夠的重 視，因此，大量進口的種牛、胚胎、冷凍精液等大大增加了遺傳缺陷在我國快速傳播的風險。 所W，急需建立全面、完善的檢測、防控體系。
[0004] 牛遺傳病主要由遺傳物種變異（如基因突變、染色體崎變）引起的身體或生理缺 陷，可由親代傳遞給后代。人工授精技術在奶牛育種中的廣泛應用，使得遺傳病傳播的危險 性大大增加。然而，目前我國大部分地區畜牧部口和養殖戶對于奶牛遺傳病的管控管理并 不清晰，人們對于遺傳病的認識不夠，因遺傳病導致的奶牛健康問題不斷出現，對奶牛業的 經濟效益造成惡行影響。此外，帶病奶牛制品還會對人類的身體健康產生危害。因此，在奶 牛遺傳育種過程中有效地預防奶牛遺傳病的擴散對奶牛業的健康發展至關重要。
[0005] 奶牛遺傳病中由常染色體單基因控制的情況較多。其中，完全顯性突變引起的遺 傳缺陷易發現、易淘汰，而隱性有害基因只有在純合時發病，雜合時卻不易發現。隱性遺傳 病的傳播擴散與近交密切相關，使得隱性有害基因的純合率大大增加。隱性遺傳病的遺傳 機理在于，由于等位基因(Aa)的顯隱性關系，雜合子并不會表現發病，但如果兩個表型正常 的攜帶者(Aa)進行交配，產生表型正常與缺陷純合后代的比例為3:1，后代基因型AA、Aa、aa 個體的比例為1:2:1，也就是50%的個體為攜帶者，如果在胚胎時期隱性純合個體(aa)發生 流產或出生時即死亡，那么其后代攜帶者的比例為2/3,也就是67%的個體為攜帶者。因此， 在奶牛遺傳育種過程中檢測并淘汰表型正常的攜帶者對控制隱性遺傳病的擴散尤為重要。
[0006] 脊椎崎形綜合癥（Complex Vertebral Malformation,CVM)是荷斯坦牛的一種由 常染色體單基因控制的隱性遺傳病，最早由丹麥科學家于1999年發現。最初，丹麥科學家發 現荷斯坦牛群中存在體型較小、脊椎崎形、兩前腿筋腫變短、無法直立行走、頸短、屯、臟崎形 等各式各樣病變的新生轄牛。另外，CVM對奶牛的繁殖性狀也有很大影響，導致母牛的不返 情率提高，產轄間隔大大延長，流產比例上升，并直接影響產奶量，導致母牛非計劃性淘汰， 最終造成嚴重的經濟損失。Thomsen B等人報道了（Genome Res，2006，16(1): 97-105)該遺 傳病的產生是由于奶牛第3號染色體(BTA3)上的化C35A3基因外顯子4的第559位的單堿基 發生突變(G/T)所致;該基因編碼尿巧二憐酸-氮-乙酷氨基葡萄糖轉運蛋白，該突變導致其 第180位的氨基酸由鄉氨酸突變為苯丙氨酸，從而影響其正常的生理功能。其中，研究者通 過與CVM基因座的連鎖分析，確定并公開了可用于鑒定CVM的疾病基因的連鎖標記-12個小 隨體，即微衛星(SSR)標記。
[0007] 白細胞粘附缺陷癥(Bovine Leuko巧te A化esion Deficien巧，BLAD)也是發生在 荷斯坦牛中的一種常見遺傳性免疫缺陷病，為常染色體單基因隱性遺傳病。該病是一種牛 的造血系統的遺傳性疾病，W嚴重的重復性感染、缺少脈液形成、損傷愈合延遲和白細胞增 多癥為特癥，實質是白細胞粘附及相關的功能包括吞隧和趨化作用的缺陷。患病牛的常見 癥狀表現為口腔粘膜、牙銀和舌粘膜潰瘍，牙銀萎縮，病程長者前白齒脫落;粘膜和腸道等 軟組織發生重復性感染，泛發性淋己樣增生；易感染肺炎、持續性嗜中性粒細胞數目增多、 生長發育受阻、胃腸粘膜潰瘍、慢性腹瀉，最終導致早期死亡。其致病機理是一種與白細胞 粘附有關的細胞表面糖蛋白--的整合素 (CD 18)表達缺陷，CD 18基因編碼區的第383位的 堿基由A突變為G(A383G)，導致第128位的天口冬氨酸被甘氨酸所取代，致使白細胞表面的 整合素表達明顯減少或缺乏而引起臨床發病。牛的CD18基因已經被定位在1號染色體上。 [000引 牛尿巧酸合酶缺乏癥（Deficiency of Uridine Monophos 曲ate Synthase, DUMPS),也稱單譜病，是荷斯坦牛群中一種常染色體單基因隱性遺傳病。患該病的牛的主要 癥狀為血液中瓜氨酸含量很高，尿素循環受阻引起高氨血癥，從而導致胚胎死亡，即使轄牛 能順利出生，但在出生一周內死亡，或母牛懷孕約40d左右即流產。DUMI^的遺傳學基礎是奶 牛1號染色體(BTAl)上的UMPS基因 C-末端405處的密碼子存在著一個點突變(C405T)，原編 碼精氨酸的密碼子CGA轉變為終止密碼子的TGA，從而導致突變基因的轉錄產物最終翻譯成 一段C-末端缺失76個氨基酸催化亞基的短蛋白，造成乳清酸轉化為鳥巧酸的催化功能喪 失，不能合成DNA、RNA所需的喀晚核巧酸，從而導致胚胎在妊娠40~60d時死亡，死亡率 100%。
[0009] 瓜氨酸血癥（Citrullinemia, CN)又稱精氨酸合成酶缺失癥（Bovine Argininosuccinate Synthe1:ase Deficien巧），是一種引起荷斯坦牛尿循環代謝素亂的常 染色體單基因隱性遺傳缺陷病。發病個體由于缺乏尿素代謝過程中催化瓜氨酸生成精氨酸 班巧酸的關鍵酶-精氨酸班巧酸合成酶，而導致瓜氨酸不能轉變為精氨酸班巧酸，引起機體 內尿代謝素亂。運一代謝素亂的發生使體內代謝生成的瓜氨酸前體-氨無法轉變為尿素，而 無法排出體外，從而在組織或血液中積累大量對機體有害的氨，最終導致轄牛在出生一周 內死亡。該病最早于1986年在澳大利亞的荷斯坦牛群中發現。引發機體病變的遺傳學基礎 是奶牛第11號染色體(BTAll)上的編碼精氨酸合成酶的ASS基因的第5外顯子第86個氨基酸 發生單堿基突變(C^T),第86位氨基酸突變為終止密碼子，從而使ASS功能喪失。
[0010] 目前，常用的檢測奶牛常染色體單基因單堿基多態性遺傳病的分子診斷方法有： [0011 ] (I)PCR-SSCP聚合酶鏈式反應一單鏈構象多態性（polymerase chain reactions- single shanded conformation polymo;rphism)，是一種基于PCR的單鏈構象多態性分析 技術。即相同長度的單鏈DNA，如果堿基序列不同，形成的構象就不同。雖然從理論上講，該 技術可W檢測任何位點上的堿基變異，但在實際應用中會遇到相當比例的假陰性結果。原 因在于，該技術受DNA結構(堿基組成和排列順序）、電泳凝膠的成分和電泳條件(如溫度、緩 沖液的嘗試等)等諸多因素的影響，在具體操作時要想得到清晰可靠、可重復的結果，需要 對各種條件進行嚴格控制。該方法的另一弊端在于并不能確定突變類型和具體位置。
[0012] (2)PCR-化FP聚合酶鏈式反應一限制性片段長度多態性（polymerase chain react ions-restrict ion fragment length polymorphism)，是在 PCR 技術基礎上發展起來 的。該技術需要用特異設計的PCR引物擴增目標DM,擴增產物再用特異性內切酶消化成不 同大小的片段，通過凝膠電泳進行分辨。由于該方法是通過在突變點處設計酶切位點，PCR 擴增后通過酶切PCR產物判斷是否含有突變點，該方法引入錯配堿基后，PCR的擴增效率會 受到影響，且存在假陽性的可能。另外，PCR-RLFP需要使用內切酶，又增加了研究成本，從而 限制了該技術的廣泛應用。
[OOU] (3 )PCR-PIRA聚合酶鏈式反應-引物誘導限制性分析法（POIymerase chain reaction-primer introduced restriction analysis)，也稱創造酉每切位點法（Created RestrictionSite PCR，CRS-PCR)。該方法主要應用引物錯配技術結合單堿基突變位點而配 合形成一個酶切位點，使之成為可用PCR-RFLP方法分析的突變位點，是對單堿基突變位點 進行基因型鑒定的有效而簡捷的手段。運一基因型檢測方法的關鍵在于CRS引物的設計，需 要考慮多態性位點鄰近序列的情況、擴增片段大小和錯配堿基的選擇等諸多因素，導致引 物選擇余地較小，擴增片段長度宜短不宜長，錯配的類型和數量需慎重選擇，否則會嚴重影 響PCR擴增效率等。此外，由于該方法在PCR反應后不能直接判定被檢測個體的基因型，需要 通過酶切反應才能進一步區分致病基因和正常基因，延長了操作時間，提高了檢測成本。另 夕h不同等位基因間片段的長度差異只有大約一個引物的長度(一般為20bp~25bp)，且酶 切后的片段電泳條帶較淡，給基因型的判讀帶來很大不便。
[0014] (4)AS-PCR等位基因特異性PCR檢測法(Allele-Specific PCR)，其基本原理是根 據SNP位點設計特異引物，其中一條引物(特異）的3'末端與SNP位點堿基互補(或相同），另 一條引物(普通)按常規方法設計，從而使得特異引物在一種基因型中有擴增產物，在另一 種基因型中沒有擴增產物，用凝膠電泳就能夠很容易地分辨出擴增產物的有無，從而檢測 SNP。雖然該方法操作簡便，成本低，可直接對突變位點進行檢測，但有時即使引物的3'末端 的堿基與模板的堿基不互補，延伸仍然可W進行，容易造成結果的誤判。此外，該方法設計 的上下游引物堿基數相差較大，致使退火溫度相差較大，在實驗條件要求嚴格。
[001引（5)測序法:無論是Sanger測序還是焦憐酸測序均可W直接測出DNA序列中的所有 突變位點的堿基替代情況。隨著測序自動化程度的提高和測序成本的不斷降低，直接測序 技術越來越多地用于SNP的檢測和基因分型，但該方法需要昂貴的儀器和較長的操作步驟， 目前仍是一種費用較高的方法。
[0016] 此外，還有變性高效液相色譜（DHPLC)、高分辨率烙解曲線化igh-resolution melting,HRM)等技術用于奶牛單堿基突變性疾病檢測中，但因儀器要求較高、材料成本較 大，運些方法未能得到廣泛應用。
[0017] 中國專利申請201510569964、發明名稱"一種篩查荷斯坦奶牛白細胞粘附缺陷病 攜帶者的分子檢測方法"和中國專利申請201510571292、發明名稱"一種篩查荷斯坦奶牛脊 椎崎形綜合征攜帶者的分子檢測方法"分別公開了一種鑒定荷斯坦牛是否攜帶BLAD、或CVM 的競爭性等位基因特異性巧光定量PCR成套引物。該發明利用KASP技術，通過設計一組針對 BLAD突變位點的引物，進行反應，經過約1.5小時后通過配套的軟件進行簡單識別分析，即 可準確獲得所有待測樣品的基因型，從而實現篩查BLAD攜帶者的目的。然而，該方法需要合 成巧光探針和澤滅探針，每次僅能檢測一個位點，成本高。此外，該方法基于巧光信號進行 結果判讀，準確率并不高。
[001引中國專利申請201310708022、發明名稱"一種牛瓜氨酸血癥有害基因檢測的引物 組合物及其試劑盒和應用"公開了一種應用于牛瓜氨酸血癥有害基因檢測的方法，具體如 下：提取牛血液中的全組DNA作為模板，進行巢式PCR(化Sted PCR)擴增，所得PCR產物進行 測序，根據測序結果可直接了解突變位點的堿基變化，確保了結果的準確性，滿足快速、精 準等特點的檢測技術的需求。然而，巢式PCR-次僅能檢測一個位點，且第二次PCR擴增引起 交叉污染的幾率較大，同時，采用直接測序法進行基因分型，通量低、成本高，難W適應中國 大規模的種畜篩查。
[0019]中國專利申請201310697676、發明名稱"引起DUMPS相關的SNP的檢測引物組、檢測 試劑盒和檢測方法"和中國專利申請201310699024、發明名稱"引起CVM相關的SNP的檢測引 物組、檢測試劑盒和檢測方法"分別公開了一種通過巧光定量PCR檢測牛DUMI^或CVM有害基 因相關的SNP的檢測引物組，包括檢測引物、針對SNP突變的探針W及針對野生型的探針。本 發明的方法簡單、快速、準確，并且通過本發明的方法可W進一步開發檢測試劑盒。然而，該 方法需要設計合成巧光探針，且每次僅能檢測一個位點，通量低，成本較高。此外，基于巧光 探針法，易造成假陽性。
[0020] 綜上所述，目前檢測奶牛單堿基多態性遺傳病的分子診斷方法普遍存在的技術問 題主要有兩個方面:一方面，檢測位點通量低，如CRS-PCR、測序等，一次只能對單一 SNP位點 進行檢測，當位點較多時操作復雜，費用較高；另一方面，檢測樣本通量低，如AS-PCR，PCR- SSCP等常規檢測法并不適合對大規模批量樣本的檢測等。
[0021] 隨著人們對單核巧酸多態性(SNP)的深入研究，國內外對牛遺傳缺陷病的研究技 術也在不斷推陳出新。其中，飛行時間質譜技術(MALDI-T0F-MS)是近年來發展起來的一種 新型的軟電離生物質譜，檢測本質為物質的分子量，不設及任何巧光染料，結果準確，成本 低，而且靈敏度高，低至pmol級物質均能被檢測到。因此，樣本用量少，且操作簡單，快速，通 量高且靈活等優勢，使其在核酸檢測領域顯示出巨大的生命力。
[0022] 然而，所述質譜技術目前主要集中在臨床醫學研究中，對于農業生產中設及的牲 畜疾病少有研究，國內尚未有應用飛行時間質譜技術對奶牛遺傳病檢測的報道。此外，鑒于 傳統分子生物學檢測農業牲畜遺傳病的技術已經被廣泛接受，因此人們對于使用飛行時間 質譜技術來檢測奶牛遺傳病的技術有待時間的檢驗。然而，目前奶牛的遺傳病檢測技術中， 均針對單一遺傳病的檢測，缺乏對于多種常見遺傳病的高效檢測技術。因此，本發明第一方 面目的在于針對W上遺傳病，需要建立一種快速、簡單、靈敏、準確、通量靈活的檢測技術。
[0023] 此外，在現代奶牛科學育種的研究中，除了需要檢測和排除患有上述遺傳病的奶 牛資源外，提高奶牛奶制品的質量也是奶牛育種的研究方向。其中，篩選A2型奶牛對于中國 從傳統乳業向現代乳業轉型具有重大意義。已有研究證明，牛奶中e-酪蛋白（e-CN)的編碼 基因 CSN2全長8.化b，共發現A1、A2、A3、B、C、D、E、F、G、H1、H2和I 12種基因型，其兩個主要的 變異型，稱為Al和A2,例如as2酪蛋白的外顯子17-18位的AC61位點，8101位點。比較而言，人 乳中的e-酪蛋白與牛奶中的A2型0-酪蛋白結構更為相似，人0-酪蛋白同樣不會產生BCM-7， 而BCM-7能穿過胃腸壁進入血液循環，并通過阿片受體影響全身和細胞活動。此外，BCM-7和 其他e-酪蛋白衍生物為阿片受體的強效外源性激動劑一外啡膚，其中與y受體的親合力最 大。因此，BCM-7可能影響多個器官/系統的活動，尤其消化系統和免疫細胞。此外，BCM-7也 可能與嬰幼兒的各種疾病有關，如I型糖尿病和呼吸功能障礙，消化功能疾病，促使產生肛 擾，免疫功能疾病，并影響中樞神經系統活動。
[0024] 因此，基于與母乳更為接近、同樣不產生BCM-7的A2型0-酪蛋白制成的配方奶因其 不含Al型0-酪蛋白，更有利于促進嬰幼兒的生長發育。篩選專產A2型0-酪蛋白的奶牛進行 擠奶并用于生產只含A2型0-酪蛋白的高端優質配方奶對于改善目前的國產奶粉品質具有 重要作用。
[0025] 現今，西方的奶牛中只有約30%的奶牛為純正的A2奶牛，由其所產的牛奶只含 100%純凈A2型0-酪蛋白。如果我國能掌握A20-酪蛋白的奶源的鑒定技術，根據我國龐大的 奶牛牲畜資源，從中篩選出純產A2型奶的奶牛，從而發展中國特色的A2奶制品加工產業，對 于提升中國的乳業行業發展水平具有不可估量的作用。
[0026] 綜上所述，如何篩選和建立A2奶牛種畜資源成為當前的首要任務。目前國內尚無 有關檢測編碼A20-酪蛋白基因方法及研究，并且現有國際上相關檢測技術仍然停留在傳統 PC財目關測序技術。因此，考慮到我國乳業產業的轉型和升級，我們一方面需要加強建立基 于飛行時間質譜技術對奶牛多種遺傳病進行檢測的方法之外，另一方面還要根據中國國情 需要建立檢測奶牛中e-酪蛋白的方法，同時篩選出只編碼A2型0-酪蛋白而不編碼Al型0-酪 蛋白的奶牛，繼而可W利用只編碼A2型0-酪蛋白奶牛產的牛奶生產純的A2型0-酪蛋白型的 奶粉或鮮奶。
[0027] 所W，本發明的第二方面目的在于建立基于飛行時間質譜技術對奶牛多種遺傳病 W及聯合檢測A2型奶牛的篩選方法，從而科學地指導我國奶牛育種，促進我國奶牛業健康 穩定的發展。

【發明內容】

[002引本發明的原理在于：提供了一種聯合PCR技術、單堿基延伸技術和質譜檢測技術， 同時對奶牛脊椎崎形綜合癥(CVM)、白細胞粘附缺陷癥(BLAD)、尿巧酸合酶缺乏癥化UMPS)、 瓜氨酸血癥(CN)四種遺傳病同時進行檢測的方案。考慮到當同一反應體系中存在多重反應 引物，那么多重擴增的規模主要受限于引物之間的相互作用程度，從而影響核酸質譜檢測 過程。因此，本發明通過優化和選用使用針對上述四種遺傳病相關基因的特殊引物，同時進 行PCR多重擴增，然后對經過純化的PCR產物進行單堿基延伸，特異性的延伸引物延伸一個 核巧酸，所延伸的核巧酸類型與上述四種遺傳病的野生型或突變型相對應；W質譜技術對 單堿基延伸產生的延伸引物和延伸產物組成的待檢混合物進行檢測，通過質譜峰確定待檢 混合物中各物質的分子量，并與預先計算的延伸引物和延伸產物的理論分子量進行比對， 從而確定待檢混合物是否包含指定的堿基類型，進而確定樣本的基因型。在W上優化多重 反應體系的基礎上，本發明進而研究并獲得能夠與上述四種遺傳病進行同時檢測和篩選A2 型奶牛的檢測系統，通過確定e-酪蛋白的基因型，從而最終實現遺傳病和A2型奶牛的聯合 檢測。
[0029] 因此，本發明的第一個目的是提供一種同時檢測奶牛脊椎崎形綜合癥(CVM)、白細 胞粘附缺陷癥(BLAD)、尿巧酸合酶缺乏癥化UMPS)、瓜氨酸血癥(CN)四種遺傳病的引物系統 或引物組，其序列如表1所示。
[0030] 表1四種遺傳病的引物序列
[0031]
L0032J 其中，所還的與脊椎崎形綠合癥（CVM)、日細胞粘附缺陷癥（BLAD)、巧巧酸合酶缺 乏癥(DUMPS)、瓜氨酸血癥(CN)四種遺傳病相關的基因位點分別是:SLC35A3基因4號外顯子 第559位(G〉T)、CD18基因第二外顯子第55位(A〉G)、UMPS基因第5個外顯子上的密碼子405位 (OT)、ASS基因第5外顯子的第86個氨基酸(OT)。本發明中，脊椎崎形綜合癥(CVM)和白細 胞粘附缺陷癥(BLAD)兩種遺傳病檢測時所選擇位點位于反義鏈，即分別為C〉A和T〉C。其中， 所設及的延伸引物及延伸產物的分子量如表2所示。
[0033] 表2四種遺傳病延伸引物信息
[0034]
[0035] 注:基因型1為野生型，基因型2為突變型。
[0036] 在一個實施方案中，上述PCR擴增引物序列為核屯、序列，其在5'端可包括保護堿基 序列，優選5-15個堿基。在一個具體實施方案中，保護堿基序列選自在5'端加入IObp的tag (ACGTTGGATG)，例如，在PCR引物SEQ ID No : I 的 5 ' 端加入 IObp的 tag (ACGTTGGATG)后即為 沈Q ID No:13:
[0037] 5'-ACGTTGGATGAAGTAAACCCCAGCAAAGCC-3'。在另一個具體實施方案中，延伸引物 的5'端也可W增加作為接頭的堿基序列，例如，在延伸引物SEQ ID No: 10的5'端加入化P的 接頭t，為與原始序列區分，接頭用小寫字母表示，則增加接頭后的序列為為SEQ ID No: 14: 5 '-tTCCATCAGGTAGTACAGG-3 '。
[0038] 本發明第二個目的是提供由上述引物系統所制備的用于確定奶牛是否具有脊椎 崎形綜合癥(CVM)、白細胞粘附缺陷癥(BLAD)、尿巧酸合酶缺乏癥化IMPS)、瓜氨酸血癥(CN) 四種遺傳病的檢測產品。
[0039] 在一個實施方案中，該產品為檢測試劑盒，包括：
[0040] (1)用于PCR反應的試劑，包括:特異性PCR引物，耐高溫的DNA聚合酶，dNTPs，PCR反 應緩沖液；
[0041 ] (2)用于PCR產物純化的試劑；
[0042] (3)用于單堿基延伸反應的試劑，包括：延伸引物，耐高溫的單堿基延伸酶， ddNTPs，延伸反應緩沖液。
[0043] 在一個具體實施方案中，該試劑盒還可包括：陰性質控品，陽性質控品，純化用樹 月旨，點樣及質譜檢測用祀片，外切酶等試劑。
[0044] 在另一個具體實施方案中，用于PCR產物純化的試劑:堿性憐酸酶，或堿性憐酸酶 和外切酶Exo I，或電泳凝膠回收試劑，或PCR產物純化柱。其中，當包括堿性憐酸酶和外切 酶Exo I的純化試劑時，所使用的PCR引物無需包括保護堿基。
[0045] 本發明的第=個目的是利用上述引物系統、檢測產品或試劑盒，來檢測奶牛是否 具有脊椎崎形綜合癥(CVM)、白細胞粘附缺陷癥(BLAD)、尿巧酸合酶缺乏癥(DUMPS)、瓜氨酸 血癥(CN)的方法，其特征在于，它至少包括W下步驟：
[0046] (I)PCR反應:使用上述特異性的針對包含所選擇基因多態位點片段的PCR擴增引 物，在一個反應體系內，通過多重PCR同時擴增含有不同多態位點的序列，得到含擴增目標 區域的PCR產物；
[0047] (2)PCR產物純化:對步驟(1)得到的PCR產物進行純化，W減少對后續反應的干擾；
[0048] (3)單堿基延伸:使用針對所選擇基因多態位點的特異延伸引物，在一個反應體系 中，對步驟(2)得到的純化后PCR產物進行單堿基延伸，延伸引物在對應的SNP位點處延伸一 個堿基;該堿基與SNP位點處的基因型互補配對；
[0049] (4)延伸產物純化:對步驟(3)得到的延伸產物進行純化，W獲得高純的延伸產物， 避免鹽離子等雜質對后續檢測的影響；
[0050] (5)質譜儀檢測：將步驟(4)得到的純化產物點在含有基質的祀片上，放入質譜儀 進行檢測，得到不同SNP位點延伸產物的核酸譜圖；
[0051] (6)將得到的不同SNP位點延伸產物的核酸譜圖，經過質譜儀配套軟件分析后，確 認SNP位點的堿基，從而判定該樣本的基因型。
[0052] 其中，所述與脊椎崎形綜合癥(CVM)、白細胞粘附缺陷癥(BLAD)、尿巧酸合酶缺乏 癥化UMPS)、瓜氨酸血癥(CN)四種遺傳病相關的基因位點分別是:SLC35A3基因4號外顯子第 559位(G〉T)、CD18基因第二外顯子第55位(A〉G)、UMPS基因第5個外顯子上的密碼子405位(C 〉T)、ASS基因第5外顯子的第86個氨基酸(C〉T)。本發明中，脊椎崎形綜合癥(CVM)和白細胞 粘附缺陷癥(BLAD)兩種遺傳病檢測時所選擇位點位于反義鏈，即分別為C〉A和T〉C。
[0053] 在一個實施方案中，步驟（1)所用的PCR擴增引物和步驟(3)所用的延伸引物選自 但不局限于表1所示序列；步驟(2)的純化過程可W選擇堿性憐酸酶消化、堿性憐酸酶和外 切酶ExoI消化、切膠純化、PCR純化柱過柱等。在一個具體實施方案中，當使用堿性憐酸酶消 化、或堿性憐酸酶和外切酶ExoI消化進行純化后，進行高溫酶滅活處理。
[0054] 本發明第四個目的是提供通過上述引物組或檢測產品，用于制備奶牛篩選、繁育 中進行聯合檢測的產品。
[0055] 在一個實施方案中，所述聯合檢測包括檢測奶牛的0-酪蛋白基因、遺傳性疾病(包 括脊椎崎形綜合癥CVM、白細胞粘附缺陷癥BLAD、尿甘酸合酶缺乏癥DUMPS、瓜氨酸血癥CN) 相關基因等。
[0056] 在另一個實施方案中，所述聯合檢測的產品包括用于檢測上述任意兩種或多種或 全部性狀的檢測產品。在一個具體實施方案中，該聯合檢測的產品包括用于通過核酸質譜 方法來檢測所述癥狀的擴增引物、延伸引物及其相關試劑。在另一具體實施方案中，所述聯 合檢測包括檢測奶牛的e-酪蛋白基因和遺傳性疾病(包括脊椎崎形綜合癥CVM、白細胞粘附 缺陷癥BLAD、尿甘酸合酶缺乏癥DUMPS、瓜氨酸血癥CN)相關基因的分型，或A2基因與W上任 意一種或多種遺傳病的組合。
[0057] 在一個具體實施方案中，上述聯合檢測產品中用于核酸質譜檢測奶牛是否具有0- 酪蛋白A2/A1基因的引物組，其序列如下表所示。
[0062]在上述實施方案中，其中，延伸引物及延伸產物的分子量如下表所示。
[00631
[0064] 在一個實施方案中，上述引物組僅包括沈Q ID No:21-23或沈Q ID No:24-26的組 合。
[0065] 在另一個實施方案中，上述PCR擴增引物序列為核屯、序列，其在5'端可包括保護堿 基序列，優選5-15個堿基。在一個具體實施方案中，保護堿基序列選自在5 '端加入IObp的 化g (ACGTTGGATG)，例女日，在PCR 引物沈Q ID No: 21 的 5 ' 端加入 1 Obp的 tag (ACGTTGGATG)后即 為：
[0066] 5'-ACGTTGGATGTAAAATCCACCCCTTTGCCC-3'。在另一個具體實施方案中，延伸引物 的5'端也可W增加作為接頭的堿基序列。
[0067] 本發明的第五個目的是提供通過上述任一目的引物組或檢測產品，來繁育健康奶 牛W及形成健康奶牛群的方法，至少包括：
[0068] (1)根據上述任一方法確定奶牛在脊椎崎形綜合癥（CVM)、白細胞粘附缺陷癥 (BLAD)、尿巧酸合酶缺乏癥(DUMPS)、瓜氨酸血癥(CN)四種遺傳病相關基因多態位點為野生 型還是突變型；
[0069] (2)選擇在上述四種遺傳病相關基因多態位點處均為野生型的奶牛，形成健康奶 牛群。
[0070] 在一個實施方案中，所述檢測還包括檢測奶牛的0-酪蛋白基因分型。
[0071] 在另一個實施方案中，所述聯合檢測的產品包括用于檢測上述任意兩種或多種或 全部性狀的檢測產品。在一個具體實施方案中，該聯合檢測的產品包括用于通過核酸質譜 方法來檢測所述癥狀的擴增引物、延伸引物及其相關試劑。在另一具體實施方案中，所述聯 合檢測包括檢測奶牛的e-酪蛋白A2基因和遺傳性疾病(包括脊椎崎形綜合癥CVM、白細胞粘 附缺陷癥BLAD、尿甘酸合酶缺乏癥DUMPS、瓜氨酸血癥CN)相關基因的分型，或A2基因與W上 任意一種或多種遺傳病基因的組合。
[0072] 本發明的第六個目的是提供從按照本發明的方法檢測來自奶牛的精液或胚胎，該 精液或胚胎優選地用于人工繁殖技術生產后代。
[0073] 在上述所有實施方案中，盡管該方法可用于確定其他奶牛品種是否具有脊椎崎形 綜合癥(CVM)、白細胞粘附缺陷癥(BLAD)、尿巧酸合酶缺乏癥(DUMPS)、瓜氨酸血癥(CN)四種 遺傳病，W及同時確定奶牛是否為A2型奶牛，但本發明的奶牛優選為中國荷斯坦奶牛。
[0074] 在上述所有實施方案中，受試奶牛的DNA可W從含有有核細胞的任何組織中得到， 該組織優選為該奶牛的血液、精液、毛發或奶。
[00巧]技術效果
[0076] 1.敏感:本發明綜合了 PCR、單堿基延伸、質譜檢測等技術為一體，既可通過PCR技 術放大檢測模板，又可通過質譜技術檢測微量樣本。因此，運種多技術結合的方法遠遠優于 單獨使用PCR檢測SNP，該方法具有相當高的檢測靈敏度。
[0077] 2.特異:單堿基延伸又稱為"微測序"，使用特異性探針對DNA分子進行識別，具有 測序技術的準確性高、特異性高、假陽性低等特點;特別的，不同于測序技術延伸數百個堿 基，該技術僅延伸單個堿基，出錯概率更低。
[0078] 3.簡便安全:操作簡單、安全、自動化程度高、防污染。
[0079] 4.快速:速度快、通量高，可在5-6小時內完成數百個樣本的檢測。
[0080] 5.檢測結果準確且穩定，抗干擾能力強:本發明是使用質譜圖譜進行奶牛脊椎崎 形綜合癥(CVM)、白細胞粘附缺陷癥(BLAD)、尿巧酸合酶缺乏癥(DUMPS)、瓜氨酸血癥(CN)四 種遺傳病W及A2型基因的相關基因位點多態性的鑒定，質譜技術具有極強的分辨率和靈敏 度，最高分辨率達到9Da，且通過計算機程序判讀，人為干擾因素小。相反，傳統PCR擴增后凝 膠電泳檢測，其各自擴增成分的電泳凝膠條帶如果區分度過低，將導致結果難W分辨。
[0081] 6.本發明首次突破了國外技術封鎖，填補了國內A2奶產業的聯合檢測其他疾病的 空白，對于我國乳業產業的轉型和升級具有重要的促進和支撐作用。
[0082] 7.本發明將提高我國檢驗檢疫系統的檢疫把關能力，防止國外不合格的奶牛或產 品進入國內，從而保證我國奶牛的健康水平W及育種安全和行業的健康發展。
[0083] 原理與定義
[0084] 本發明提供了一種聯合PCR、單堿基延伸和質譜檢測等技術，檢測奶牛是否具有脊 椎崎形綜合癥(CVM)、白細胞粘附缺陷癥(BLAD)、尿巧酸合酶缺乏癥(DUMPS)、瓜氨酸血癥 (CN)四種遺傳病的檢測方案。另外，本發明還提供了同時檢測W上遺傳病和A2型基因的聯 合檢測方案。其原理在于:使用特異性PCR引物，對待測模板進行擴增，得到含待檢SNP位點 的PCR產物;PCR產物經過純化處理后，進行單堿基延伸，在延伸引物后延伸一個核巧酸，該 核巧酸與模板互補配對(如模板為核巧酸A，將在對應的延伸引物上延伸T);在單堿基延伸 步驟中，采用ddNTP代替dNTP，因此，在延伸一個堿基后，延伸引物將終止延伸;在質譜檢測 過程中，單堿基延伸產物脫鹽純化后，點至含基質的祀片上，并在真空環境中被激光激發， 通過飛行管至檢測器。不同物質通過飛行管的時間與其分子量呈負相關，即分子量越大，飛 行時間越慢，到達檢測器的時間越晚。
[0085] 術語"PCR擴增"，指在引物和聚合酶的作用下，對于特定的目的片段進行擴增反 應，W便進行相應的檢測，例如酶切鑒定、測序鑒定等。在本發明中，由于需要考慮到質譜檢 巧化勺區分度和檢測窗口等限制條件，因此，擴增長度不同于普通PCR擴增檢測過程，本發明 中用于質譜檢測的擴增產物長度一般在l〇〇-2(K)bp左右。而通常運種擴增產物長度，是難W 直接進行酶切鑒定或測序鑒定的。由此可見，本發明的PCR擴增是與常規檢測所設及的PCR 擴增是不完全相同的。
[0086] 術語"保護堿基"，指在PCR引物的5'端額外增加的堿基。保護堿基的序列使得PCR 引物的分子量增大，可W避免反應剩余的PCR引物進入質譜檢測窗口，W避免干擾檢測效 果。此外，延伸引物的5'端也可W適量增加堿基序列，但其作用并非如同PCR引物的保護堿 基，使其超出檢測窗口，而是適當調整延伸引物的分子量，使延伸引物及其產物在檢測窗口 內處于一個合理的位置。例如，當兩個基因多態位點對應的延伸引物及產物的分子量接近 時，通過給其中一個延伸引物增加堿基，改變引物及其產物的分子量，與其他延伸引物及產 物的分子量之間拉大差距，W避免局部區域質譜峰過于集中而產生干擾和分辨不清，從而 提高檢測效果。因此，增加堿基后的延伸引物及產物的分子量，一定不會超出檢測窗口。上 述延伸引物的額外堿基可稱為引物接頭。
[0087]術語"堿性憐酸酶消化"，其作用是降解PCR反應后體系中殘余dNTP，其原理是使 dNTP的5 ' -P末端轉換成5 ' -OH末端，從而失去與引物結合使引物延伸的能力，避免了對下一 步單堿基延伸的影響。
[00則術語"外切酶Exo I消化"，其作用是從單鏈DNA的一端開始按序催化水解組成DNA 的dNTP之間的3，5-憐酸二醋鍵，使單鏈DNA最終水解為dNTP。在本技術方案中用于降解PCR 反應后剩余的PCR引物。由于外切酶可W將單鏈的PCR引物切除，并不會在檢測窗口中出現， 因此在使用該外切酶時，所使用的PCR引物無需包括保護堿基。
[0089] 術語"單堿基延伸"，又被稱之為微測序(mini sequence)，指在體系中加入延伸引 物和ddNTP，ddNTP與延伸引物的3 '連接形成延伸產物，即引物延伸了一個堿基。ddNTP與普 通dNTP不同的是，在脫氧核糖的3'位置缺少了一個徑基，不能與后續的ddNTP形成憐酸二醋 鍵，因而，延伸引物僅可連接一個ddNTP，故而稱之為單堿基延伸。單堿基延伸與測序過程非 常相似，測序體系中加入的是dNTP和ddNTP的混合物，測序引物連接dNTP后將繼續延伸，只 有連接ddNTP后方可終止延伸，因此，測序產生的是長短不一的核巧酸片段的混合物；單堿 基延伸體系中只加入ddNTP，延伸引物只能連接一個ddNTP，并終止延伸。因此，單堿基延伸 反應產生的是延伸引物僅延伸一個堿基的核巧酸片段。
[0090] 術語"ddNTP"是一種特殊的核巧酸，本技術方案共采用四種，它們之間存在分子量 差異，如，(1(1機？、(1(141?、(1(161?和(1(1刊？的分子量分別是247.2〇3、271.2〇3、287.20曰和 327. IDa,其中，ddTTP為修飾后的分子量。當延伸引物根據SNP位點的基因型而延伸不同的 核巧酸時，將形成分子量差異。可W通過質譜檢測，分辨出運種差異（質譜檢測核酸的最小 靈敏度約為9Da)。例如，某SNP位點若為G/A多態，對應的延伸引物長度為22個堿基(分子量 為6153化），當該SNP位點是G基因型時，延伸引物將延伸一個C核巧酸并終止延伸，形成23個 堿基長、分子量為6400.2化的延伸產物；當該SNP位點處為A基因型，延伸引物將延伸一個T 核巧酸并終止延伸，形成23個堿基長、分子量為6480.1 Da的延伸產物，兩種產物間存在 80.1 Da的分子量差異。即對該SNP位點而言，使用此6153Da的延伸引物，G基因型將對應 6400.2化的質譜峰，A基因型將對應6480.1化的質譜峰。在實際檢測過程中，使用者可通過 軟件對6153化、6400.2Da、6480.1化S處進行觀察:若6153化處出現質譜峰，則表明有部分 或全部延伸引物未與ddNTP結合;不論6153化處是否有質譜峰，若6400.2化與6480.1化處僅 出現一處質譜峰，則該SNP位點的基因型為純合型，其基因型與質譜峰的位置對應。如前所 述，6400.2Da的質譜峰對應G基因型，6480.1 Da的質譜峰對應A基因型；若6400.2Da與 6480.1化兩處均出現質譜峰，則該SNP位點的基因型為雜合型;若6400.2化與6480.1化兩處 均未出現質譜峰，則實驗失敗。
[0091] 術語"純化"，指用于減少待檢體系內其他物質對后續反應的影響的處理步驟。本 發明的PCR產物純化有兩種方式:一是分離雜質并丟棄，二是使雜質失去活性。其中，切膠純 化、過純化柱等都是通過電泳、純化柱等分離介質，并回收相對較純的PCR產物，屬于第一種 純化方式，該方式一般耗時較長、操作復雜，尤其是樣本量大時，更難W提高批量處理能力； 堿性憐酸酶的作用是降解(亦稱消化)dNTP,使之不能繼續作為DNA聚合酶或單堿基延伸酶 的底物參與PCR或單堿基延伸反應，從而不干擾后續反應，屬于第二種純化方式。應當指出 的是，單獨的外切酶ExoI不起純化作用，當它與堿性憐酸酶混合使用時，其作用是預先將單 鏈DNA(在反應完成的PCR產物體系中，主要是剩余的PCR引物)降解成dNTP，再由堿性憐酸酶 令dNTP繼續降解。由于PCR引物被降解，不會進入最后的質譜檢測步驟，因此，如果計劃純化 步驟中增加外切酶ExoI處理，則無需使用具有保護堿基的PCR引物。此外，在單堿基延伸步 驟之前，由于外切酶和堿性憐酸酶都通過高溫滅活，其不降解在單堿基延伸步驟中加入的 單鏈的延伸引物、ddNTP等，因此對后續實驗不會產生影響。
[0092] 術語"檢測窗口 "，指可用于質譜檢測核巧酸分子量的范圍，通常設及引物的設計 參考范圍。為避免不同延伸引物與產物間由于分子量接近而存在干擾，從而可在一個相對 較寬的檢測窗口，如4000-9000Da，實現對多種物質的同時檢測。
[0093] 術語"SNP"基因型，表示物種基因組中單核巧酸多態性的類型。其中，在實際檢查 中，作為對照的用于檢測的基因型既可來自于對于物種的基因組中，也可來自克隆入質粒 的載體工具，而后者具有可復制和保存便捷、來源穩定、易得而受到實際使用者的歡迎。
[0094] 術語"檢測產品"，指用于檢測SNP位點基因型的任何常規產品，包括:檢測試劑、檢 測忍片(如基因忍片、液體忍片等）、檢測載體，W及檢測試劑盒等。
[00巧]術語"SLC35A3"，指位于奶牛3號染色體上的化C35A3基因4號外顯子的第559位的 一個堿基突變(G〉T)，該突變導致其第180位的氨基酸由鄉氨酸突變為苯丙氨酸，致使奶牛 患有脊椎崎形綜合癥(Complex Vertebral Malfo;rmation，CVM)。
[0096] 術語"CD18"，指位于奶牛I號染色體上的的整合素(CD18)基因2號外顯子第55位的 一個堿基突變(A〉G)，導致第128位的天口冬氨酸被甘氨酸所取代，致使奶牛患有白細胞粘 附缺陷癥（Bovine Leuko巧te A化esion Deficien巧，BLAD)。
[0097] 術語"UMPS"，指位于奶牛1號染色體上的UMPS基因第5個外顯子上的密碼子405位 的一個堿基突變(C〉T)，導致原編碼精氨酸的密碼子CGA轉變為終止密碼子的TGA，致使奶牛 患有牛尿巧酸合酶缺乏癥(Deficiency of Uridine Mono 地 OS Phate Synthase ,DUMPS)。
[0098] 術語"ASS",指位于奶牛11號染色體上的編碼精氨酸合成酶的ASS基因的第5外顯 子第86個氨基酸發生單堿基突變(OT)，使第86位氨基酸突變為終止密碼子，致使奶牛患有 瓜氨酸血癥（Cit;rullinemia，CN)。
[0099] 術語乂SN2(810ir，指位于CSN2基因（0-酪蛋白基因）的8101位的一個SNP，該SNP 位于6號染色體，其67位氨基酸發生變異，導致CSN2基因型的差異。CSN2基因的NCBI登陸號 為281099。
[0100] 術語"A2(AC6ir，指位于as2酪蛋白（CSN1S2基因）的外顯子17-18位的一個SNP，其 同樣位于6號染色體上(參見中國專利申請03817455.3)。該基因的NCBI登陸號為282209。
[0101] 應當指出的是，鑒于W上核酸質譜的特殊性，例如，其需先通過PCR反應擴增出含 SNP位點的片段，然后通過延伸引物延伸出SNP位點的堿基;各SNP的PCR反應、延伸反應間無 明顯干擾;各SNP的延伸引物、產物間分子量要有足夠大的差異W便實現區分等，因此，并非 所有的已知SNP均可W用來進行核酸質譜的檢測，也并不是所有針對SNP位點設計的引物均 可用W進行多重PCR反應和多重單堿基延伸反應。例如，Cl如dia M.B等人(Optimization of a multiplex minisequencing protocol for population studies and medical genetics,Genet.Mol.Res 4(2005)115-125)指出，在進行多重PCR反應前需首先對單重PCR 的反應效果進行驗證，如果單重PCR擴增效率低則需要放棄；另外，若PCR產物長度偏長，多 重PCR效果會比較差，也需要放棄。Nissum M等人巧igh-throughput genetic screening using m曰trix-曰ssisted laser desorption/ioniz曰tion m曰ss spectrometry,Psychiatr Genets 12(2002)109-117)也報道了通過MLDI-TOF MS高通量檢測SNP的過程中，發現只能 獲得90 %的準確率，其中，在標準實驗條件下，竟然有5 %的情況不能實施PCR擴增過程，而 在單堿基延伸過程中，由于自身引物自身配對、引物二聚體的形成W及擴增產物量過低等 因素，也導致有5 %的情況難W實現單堿基延伸過程。因此，必須進一步優化核酸質譜實驗 條件(如擴增引物、實驗參數等），否則將影響MALDI-TOF MS在核酸質譜檢測SNP中的應用。 例如，本發明在針對AC61位點進行核酸質譜檢測中，發現實際生產中的準確率僅為75%，運 與利用傳統PCR測序技術通過檢測該位點從而獲得A2奶牛分型準確率97%形成強烈對比。 因此，對于已知的AC61位點，在本發明的核酸質譜檢測過程中，僅僅作為輔助分型的用途。
[0102] 此外，在核酸質譜檢測過程中，多重擴增過程的干擾作用，對于最終獲得的延伸產 物也存在景多B向。Sascha Sauer等人（Typin邑 of sin邑Ie nucleotide polymorphisms by MALDI mass spectrometry: Principles and diagnostic applications,Clinica 畑imica Acta 363(2006)95-105)和Heyi Yang等人（Multiplex single-nucleotide polymorphism genotyping by m曰trix-曰ssisted laser desorption/ioniz曰tion time- of-flight mass spechometiT,Analytical Biochemistry 314(2003)54-62)在利用 MALDI質譜技術研究核酸質譜檢測過程中提出，所設計的多重引物應具有相近的烙解溫度 (Tm值）并彼此間的相互作用力較弱。如果引物之間的相互作用力過于強烈（AG的最小值 為-lOkcal/mol)，那么必須放棄該理論設計的引物而重新進行設計；當同一反應體系中存 在多重反應引物，那么多重擴增的規模主要受限于引物之間的相互作用程度，從而影響核 酸質譜檢測過程;此外，為了準確區分不同堿基之間的差異，特別是腺嚷嶺(A)和胸腺喀晚 (T) (4種堿基中運二者分子量之間差值最小，為9Da)，要求的寡核巧酸長度一般不超過40個 堿基，實際應用中，質譜檢測窗口的分子量范圍一般為4000~9000化，即要求所設及的延伸 引物和產物的分子量盡量分布在4000~9000Da范圍之內。同時，要避免各延伸引物及其延 伸產物之間的疊合。由此可見，并非所有已知的SNP均可應用于核酸質譜尤其是多重核酸質 譜的檢測，其實際效果會受到多種實驗因素的影響，因此需要通過實驗來驗證SNP檢測的可 行性W及篩選不同的引物組合。
【附圖說明】
[0103] 圖1為實施例四中對奶牛樣本Al的檢測結果，顯示該樣本的4種待檢基因均為野生 型。
[0104] 圖2為實施例四中對奶牛樣本A2的檢測結果，顯示該樣本的4種待檢基因均為野生 型。
[0105] 圖3為實施例四中對奶牛樣本A3的檢測結果，顯示該樣本的4種待檢基因均為野生 型。
[0106] 圖4為實施例四中對奶牛樣本A4的檢測結果，顯示該樣本的4種待檢基因均為野生 型。
[0107] 圖5為實施例四中對奶牛樣本A5的檢測結果，顯示該樣本的化C35A3基因為突變型 (A)，為CVM病癥患者。
[0108] 圖6為實施例四中對奶牛樣本A6的檢測結果，顯示該樣本的CD18基因為突變型 (C)，為BLAD病癥患者。
[0109] 圖7為實施例四中對奶牛樣本A7的檢測結果，顯示該樣本的UMPS基因為突變型 (T)，為DUMPS病癥患者。
[0110] 圖8為實施例四中對奶牛樣本A8的檢測結果，顯示該樣本的ASS基因為突變型(T)， 為CN病癥患者。
[0111] 圖9為4種遺傳病基因相關的4個位點均為野生型的質粒B1-B4的檢測結果。從左至 右12條虛線分別是ASS基因的延伸引物、ASS基因的野生型(C)延伸產物、ASS基因的突變型 (T)延伸產物、SLC35A3基因的延伸引物、UMI^基因的延伸引物、SLC35A3基因的野生型(C)延 伸產物、SLC35A3基因的突變型(A)延伸產物、UMPS基因的突變型(T)延伸產物、UMPS基因的 野生型(C)延伸產物、CD18基因的延伸引物、CD18基因的突變型(C)延伸產物、CD18基因的野 生型(T)延伸產物的理論峰值。
[0112] 圖10為4種遺傳病相關基因相關的4個位點均為突變型的質粒C1-C4的檢測結果。
[0113] 圖11為實施例五中對奶牛樣本N19的檢測結果，顯示該樣本的化C35A3基因為雜合 突變型(CA)，為CVM病癥的攜帶者。
[0114] 圖12為實施例五中對奶牛樣本N66的檢測結果，顯示該樣本的CD18基因為雜合突 變型(TC)，為BLAD病癥的攜帶者。
[0115] 圖13為實施例五中對奶牛樣本N76的檢測結果，顯示該樣本的UMPS基因為雜合突 變型(CT)，為DUMPS病癥的攜帶者。
[0116] 圖14為實施例五中對奶牛樣本N93的檢測結果，顯示該樣本的ASS基因為雜合突變 型(CT)，為CN病癥的攜帶者。
[0117] 圖15為對照實施例一中對奶牛樣本N19的化C35A3基因位點的測序結果，顯示為CA 雜合。
[011引圖16為對照實施例一中對奶牛樣本N19的CD18基因位點的測序結果，顯示為T純 么 n O
[0119] 圖17為對照實施例一中對奶牛樣本N19的UMPS基因位點的測序結果，顯示為C純 厶 n O
[0120] 圖18為對照實施例一中對奶牛樣本N19的ASS基因位點的測序結果，顯示為C純合。
[0121] 圖19為對照實施例一中對奶牛樣本N66的化C35A3基因位點的測序結果，顯示為C 純合。
[0122] 圖20為對照實施例一中對奶牛樣本N66的CD18基因位點的測序結果，顯示為TC雜 厶 1=1 O
[0123] 圖21為對照實施例一中對奶牛樣本N66的UMPS基因位點的測序結果，顯示為C純 厶 n O
[0124] 圖22為對照實施例一中對奶牛樣本N66的ASS基因位點的測序結果，顯示為C純合。
[0125] 圖23為對照實施例一中對奶牛樣本N76的化C35A3基因位點的測序結果，顯示為C 純合。
[01%] 圖24為對照實施例一中對奶牛樣本N76的CD18基因位點的測序結果，顯示為T純 么 n O
[0127] 圖25為對照實施例一中對奶牛樣本N76的UMPS基因位點的測序結果，顯示為CT雜 厶 n O
[01%]圖26為對照實施例一中對奶牛樣本N76的ASS基因位點的測序結果，顯示為C純合。
[0129] 圖27為對照實施例一中對奶牛樣本N93的化C35A3基因位點的測序結果，顯示為C 純合。
[0130] 圖28為對照實施例一中對奶牛樣本N93的CD18基因位點的測序結果，顯示為T純 么 n O
[0131] 圖29為對照實施例一中對奶牛樣本N93的UMPS基因位點的測序結果，顯示為C純 厶 n O
[0132] 圖30為對照實施例一中對奶牛樣本N93的ASS基因位點的測序結果，顯示為CT雜 厶 n O
[0133] 圖31為實施例六中對奶牛樣本Nl的4種遺傳病相關基因位點及0-酪蛋白CSN2基因 位點的聯合檢測結果，顯示該樣本的4種遺傳病待檢基因均為野生型，0-酪蛋白基因 CSN2為 C純合，即A2型。
[0134] 圖32為實施例六中對奶牛樣本N19的4種遺傳病相關基因位點及0-酪蛋白CSN2基 因位點的聯合檢測結果，顯示該樣本的化C35A3基因為雜合突變型（CA),即CVM病癥的攜帶 者，e-酪蛋白基因 CSN2為A純合，即Al型。
[0135] 圖33為實施例六中對奶牛樣本N23的4種遺傳病相關基因位點及0-酪蛋白CSN2基 因位點的聯合檢測結果，顯示該樣本的化C35A3基因為雜合突變型(CA),即CVM攜帶者，護酪 蛋白基因 CSN2為C純合，即A2型。
[0136] 圖34為實施例六中對奶牛樣本N66的4種遺傳病相關基因位點及0-酪蛋白CSN2基 因位點的聯合檢測結果，顯示該樣本的CD18基因為雜合突變型(TC),即BLAD病癥的攜帶者， e-酪蛋白基因 CSN2為CA雜合，即A1A2型。
[0137] 圖35為實施例六中對奶牛樣本N76的4種遺傳病相關基因位點及0-酪蛋白CSN2基 因位點的聯合檢測結果，顯示該樣本的UMPS基因為雜合突變型（CT)，即DUMPS病癥的攜帶 者，e-酪蛋白基因 CSN2為A純合，即Al型。
[0138] 圖36為實施例六中對奶牛樣本N93的4種遺傳病相關基因位點及0-酪蛋白CSN2基 因位點的聯合檢測結果，顯示該樣本的ASS基因為雜合突變型(CT)，即CN病癥的攜帶者，0- 酪蛋白基因 CSN2為A純合，即Al型。
【具體實施方式】
[0139] 下面結合具體實施例對本發明作進一步詳細說明。
[0140] 實施例一：引物設計及合成
[0141 ]針對奶牛脊椎崎形綜合癥(CVM)、白細胞粘附缺陷癥(BLAD)、尿巧酸合酶缺乏癥 (DUMPS)、瓜氨酸血癥(CN)四種遺傳病相關的基因位點，設計特異性PCR引物核屯、序列（SEQ 10齡：1至569 10齡：8)和特異性延伸引物核屯、序列（569 10齡：9至沈9 10齡：12)，如下 表所示： 「01

[0145] 本發明中，〇^、81^\0、0面口5、〔加勺檢測位點分別為：51〔3543基因4號外顯子第559 位G〉T(反義鏈，C〉A)、CD18基因第二外顯子第55位A〉G(反義鏈，T乂）、UMPS基因第5個外顯子 上的密碼子405位C〉T、ASS基因第5外顯子的第86個氨基酸C〉T。
[0146] 其中，為了避免PCR引物進入質譜儀檢測窗口而干擾檢測效果，每條PCR引物的5' 端可W在核屯、序列（SEQ ID No: 1，SEQ ID No: 2)的基礎上增加一定數目的堿基，常見如 IObp的化g(ACGTTGGATG)，增大PCR引物的分子量，從而超出質譜儀檢測窗口。
[0147] 相關引物均由上海捷瑞生物工程有限公司進行合成。
[014引實施例二:樣本DNA提取
[0149] 采用商業化的核酸提取試劑盒(如QIAGEN公司的DNeasy Blood and Tissue kit) 進行提取，提取后的基因組DNA，在2-8°C保存不應超過一周，-20°C保存不應超過兩年，-80 °C可長期保存，應避免反復凍融，并置于冰盒中進行運輸。
[0150] (一)樣本為奶牛精液，其DNA提取步驟如下：
[0151] (1)潔凈1.5mL離屯、管中加入1支凍精，用消毒小剪剪去一端，然后再剪另一端，加 入50化L生理鹽水，滿旋混勻，12,00化pm離屯、Imin，去上清；
[0152] (2)重復步驟（1),12,000巧 m 離屯、2min;
[0153] (3)向管中加入40化L含DlT的牛凍精裂解液，再加入10化L 20%的SDS，滿旋混勻， 使底部沉淀完全溶解，加入IOiiL蛋白酶K后顛倒混勻；
[0154] (4)將混合樣品放置在56°C分子雜交爐中消化20-2化；
[0巧5] (5)向消化好的樣品中加入30化L飽和食鹽水，顛倒2-3min，4°C放置IOmin;
[0156] (6)4°C ,12,000巧m離屯、lOmin，將上清轉移到新的2mL離屯、管中；
[0157] (7)加入ImL預冷的無水乙醇，顛倒l-2min，12,000巧m離屯、2min，去上清；
[015引 （8)向離屯、管中加入50化L 75%的乙醇，顛倒混勻，12,OO化pm離屯、2min，去上清；
[0159] (9)重復步驟(7)，開蓋放置5min，揮發乙醇；
[0160] (10)向離屯、管中加入適量的P冊.O的dd肥O，溶解沉淀；
[0161] (11)濃度測定及電泳檢測，-20°C保存。
[0162] (二)樣本為奶牛血液，其DNA提取步驟如下：
[0163] (1)取全血200化放入潔凈1.5mL離屯、管中，加入500化Lysis Buffer 1，10化蛋白 酶K，充分混勻(滿旋），于56°C放置30min(期間顛倒混勻3-4次）；
[0164] (2)離屯、，吸上清到新管；
[01化](3)于上清中加入85化L Binding Buffer 2和15化L磁珠（磁珠使用前要充分懸 浮），充分混勻(輕微滿旋），室溫放置5min;
[0166] (4)將離屯、管置于磁力架上Imin，使管內磁珠被吸附，用移液器移走管內液體；
[0167] (5)在離屯、管中加入20化L Wash Buffer 3,顛倒混勻數次（也可輕微滿旋），將磁 珠團打散即可，置于磁力架吸附磁珠 Imin,然后移走管內液體；
[0168] (6)在離屯、管中加入20化L Wash Buffer 4,顛倒混勻數次（也可輕微滿旋），將磁 珠團打散即可，置于磁力架吸附磁珠 Imin,然后移走管內液體；
[0169] (7)在離屯、管中加入20化L Wash Buffer 5,顛倒混勻數次（也可輕微滿旋），將磁 珠團打散即可，置于磁力架吸附磁珠 Imin,然后移走管內液體；
[0170] (8)在離屯、管中加入20化L Wash Buffer 6,顛倒混勻數次（也可輕微滿旋），將磁 珠團打散即可，置于磁力架吸附磁珠 Imin,然后移走管內液體；
[0171] (9)將留有磁珠的離屯、管開蓋、于56°C放置lOmin，充分干燥(注:在加入洗脫液之 前，磁珠必須充分干燥）；
[0172] (10)加入70化Elution Buffer 7(可根據實驗要求決定洗脫體積），使用移液器 吹打，使磁珠重新懸浮，室溫放置IOmin;
[0173] (11)將離屯、管置于磁力架上Imin,使磁珠吸附，將DNA轉移至新的1.5mL離屯、管中， 經過濃度測定及電泳檢測后，-20°C保存備用。
[0174] (S)樣本為DNA，則經質檢合格后，-20°C保存備用。
[01巧]實施例S:生物學實驗
[0176] 在本實施例中，用于PCR、PCR產物純化和單堿基延伸的組分見表3:
[0177] 親3PCR、PCR產物純化巧單堿某巧伸紀A親
[017 引
[0179]
[0180] 使用ABI 9700型PCR儀進斤檢驗。操作孩臘說明書進斤，具體方法如下：
[0181] 1. PCR 擴增
[0182] 1.1在PCR配液區，按照待檢樣品數準備20化L PCR反應管，并在管上標記樣本編 號；
[018引1.2從試劑盒中取出PCR混合物、PCR酶，使其自然解凍，滿旋振蕩使其充分混勻，瞬 時離屯、至管底；
[0184] 1.3根據樣本數目，按下表的比例取出PCR混合液和PCR酶，置于一個離屯、管中混 勻，按每PCR反應管加入16化混合物進行分裝。由于分裝過程中，移液器吸頭殘留等因素可 能造成不足W分裝出所需的份數，建議適當放大混合物的配制體積。如，有10份待測樣品 時，可按10.5至11份樣品配制混合物；
[0185]
[0186] ~1.4在PCR擴增區內向每管混合物中加入化L待測樣品，使每份PCR反應體系總體積 為20化。其中，陰性對照為超純水，空白對照為不加模板；
[0187] 1.5將PCR反應管置于PCR擴增儀中，按下表的程序進行PCR擴增反應。
[018 引
[0189] 2. SAP 酶消化
[0190] PCR反應結束后，依次取化L PCR產物至新管，每管加入SAP酶混合物1化，然后將 PCR反應管置于PCR擴增儀中，執行下表程序。
[0191]
[0192] 3.單堿基延伸
[0193] 3.1在PCR配液區，根據樣本數目，按下表的比例取出延伸引物混合液和延伸酶混 合物，置于一個離屯、管中混勻。由于分裝過程中，移液器吸頭殘留等因素可能造成不足W分 裝出所需的份數，建議適當放大混合物的配制體積。例如，有10份PCR產物時，可按10.5至11 份樣品配制混合物； 「01941
[01 M] 3.2在PCR擴增區，按每管PCR產物加入化L延伸混合物進行分裝；
[0196] 3.3將PCR反應管置于PCR擴增儀中，按下表的程序進行延伸反應。
[0197]
[019引 4.純化
[0199] 在PCR擴增區向每管延伸產物中加入16化純水，6mg樹脂，顛倒混勻30min。
[0200] 5.點樣
[0201] 使用微量移液器，吸取化L純化產物，點樣至含基質祀片上。
[0202] 實施例四：上機檢測及結果判讀
[0203] 使用毅新興業(北京)科技有限公司生產的Clin-TOF型飛行時間質譜儀對點樣后 的祀片進行檢測和結果判斷。
[0204] 分別設置W上位點的野生型對照B1-B4、突變型對照C1-C4。其中，野生型對照Bl- B4、突變型對照C1-C4分別來自市售或實驗室保藏的人工質粒。本發明中所用的野生型對照 質粒B1-B4和突變型對照質粒C1-C4,為在商品化質粒PMD18-T Vector^akara公司）的基礎 上，根據《分子克隆》記載的常規方法，用引物和健康奶牛DNA進行PCR后，將PCR產物插入 PMD18-T Vector,即構建野生型質粒B1-B4,再分別定點突變，即構建4個突變型質粒C1-C4。 所述質粒B1-B4和C1-C4可長期保存于-20°C甘油中，用時活化并提取質粒DNA。
[0205] 如前述表2所示，4條延伸引物及它們在4個基因多態位點上根據各自基因型產生 的延伸產物具有不同的分子量，運些分子量對應各自的質譜峰，若在某分子量處出現質譜 峰，則判斷為存在與該分子量對應的物質(延伸引物或產物）。
[0206] 判斷標準；
[0207] (1)若野生型和突變型對應的質譜峰均未出現，無論延伸引物對應的質譜峰是否 存在，均判斷為實驗失敗；
[0208] (2)若野生型和突變型對應的質譜峰僅出現一個，則判斷為所出現質譜峰對應的 基因型的純合型；
[0209] (3)若野生型和突變型對應的質譜峰均出現，則判斷為雜合型。
[0210] 質譜結果如圖1-10所示，其中，圖1-8為A1-A8樣本的質譜圖，其中圖9為4種遺傳病 相關的4個SNP位點均為野生型的質粒B1-B4的質譜圖，圖10為4種遺傳病相關的4個SNP位點 均為突變型的質粒C1-C4的質譜圖。根據前述表2中的延伸引物及延伸產物的分子量檢查樣 本A1-A8的質譜結果(圖1-8)，確定SNP位點的基因型，結果如表4所示：
[0別。表4樣本分型結果
[0212]
[0213]
[0214] 其中，Al至A4為健康奶牛提取DNA，檢測結果中4種遺傳病相關SNP均為野生型，符 合預期。A5至A8為通過臨床診斷患病樣本，其中，A5樣本來源的奶牛脊柱彎曲崎形、腿部崎 形、妊娠死胎，證實為脊椎崎形綜合癥(CVM)隱性遺傳基因純合奶牛，本發明中的檢測結果 與臨床結論一致;A6樣本來源的奶牛出生體重低、生長緩慢、存在嚴重的反復性感染、傷口 愈合緩慢、白細胞增多且無繁殖能力，證實為白細胞粘附缺陷癥(BLAD)隱性純合奶牛，本發 明中的檢測結果與臨床結論一致;A7和A8樣本均來自出生后1周死亡的轄牛，其血液中瓜氨 酸蓄積，經驗證分別為尿巧酸合酶缺乏癥(DUMPS)和瓜氨酸血癥(CN)基因純合牛，本發明中 的檢測結果與臨床結論一致。
[0215] 實施例五:奶牛樣本盲檢
[0216] 根據本發明的方法，依照實施例一、二、=中所描述的操作步驟，對102例4種遺傳 病基因攜帶情況未知的奶牛樣本進行盲檢。根據實施例四中描述的判定標準對該102例樣 本進行結果分析，得到表5及圖11-14。其中，篩選出脊椎崎形綜合癥(CVM)攜帶者9例（質譜 峰圖W樣本N19的結果為例）、白細胞粘附缺陷癥（BLAD)攜帶者1例、尿巧酸合酶缺乏癥 (DUMPS)攜帶者1例、瓜氨酸血癥(CN)攜帶者1例，未發現患病牛。
[0217] 表5盲檢樣本分型結果
[021 引
[0221 ] 對照實施例一
[0222] -、根據實施例一，使用如下引物，對4種遺傳病相關的4個基因位點進行擴增和測 序：
[0224] 二、樣本來源
[0225] 為使不同實驗之間產生的數據具有可比性，測序驗證時選擇實施例五中檢測結果 為攜帶者的樣本，即編號為 N19、N23、N29、N37、M4、M8、N54、N60、N66、N76、N83、N93，共12例 樣本。
[0。6] 立、測序鑒定
[0227] 1 .PCR反應體系為25化，具體配方如下所示：
[022引
[0229] 2.反應條件
[0230] 使用ABI公司9700PCR熱循環儀進行PCR反應。
[0231] 反應程序為:95°C預變性5min，94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸40s，共35個 循環，最后72°C延伸10min，15°C保存。
[0232] 3. PCR產物純化和測序
[0233] 用試劑盒(OMEGA D2500-01)回收PCR擴增目的條帶，定量后進行測序。
[0234] 測序反應體系為：2化 Mix(Bigdye 3.1,5X sequencing buffer,也0)，2化純化后 的PCR產物，1此測序引物(5皿ol/L);使用ABI 9700PCR擴增儀進行測序反應。
[0235] 循環條件為：
[0236] 96°C2min一（95°C10s一50°C5s一60°C4min)X30巧cles一終止反應
[0237] 測序反應產物用試劑盒(OMEGA 1320-01)進行純化，然后上ABI 3730遺傳分析儀 進行序列測定。
[023引4.結果分析
[0239] 將測序得到的序列，在NCBI上進行BLAST,確定所擴增序列確實為目的序列后，用 SeqMan進行比對，確定所測樣本4種遺傳病基因的基因型，如表6和圖15-30所示。其中，CVM 攜帶者樣本共計9例，測序結果一致，在此僅W樣本N19的測序圖譜為例，其余未顯示。
[0240] 表6奶牛樣本測序分型結果
[0241]
[0242] 經過比較，表6與質譜檢驗結果表5完全一致，證明本發明方法的準確性。
[0243] 實施例六:奶牛0-酪蛋白基因與4種遺傳病基因聯合檢測
[0244]針對奶牛0-酪蛋白A2/A1蛋白基因的SNP位點（CSN2 (8101))，設計特異性PCR引物 核屯、序列和特異性延伸引物核屯、序列，如下表所示：
L0248J 其中，為r避免PCR引物進入質譜儀檢測窗口而干化檢測效果，每條PCR引物的5' 端可W在核屯、序列（SEQ ID No:21-22)的基礎上增加一定數目的堿基，常見如IObp的tag (ACGTTGGATG)，W使PCR引物的分子量增大，從而超出質譜儀檢測窗口。相關引物均由上海 捷瑞生物工程有限公司進行合成。
[0249] 如上述延伸引物及其延伸產物的分子量表，CSN2(8101)位點編號為SEQ ID No:23 的延伸引物及其在2個基因多態位點上根據各自基因型產生的延伸產物具有不同的分子量 (其中，分子量為A堿基時代表Al型0-酪蛋白，為C堿基代表A2型0-酪蛋白）。運些分子量對應 各自的質譜峰，若在某分子量處出現質譜峰，則判斷為存在與該分子量對應的物質(延伸引 物或產物）。具體判斷標準如下：
[0250] (1)若Al型和A2型對應的質譜峰均未出現，無論延伸引物對應的質譜峰是否存在， 均判斷為實驗失敗；
[0251] (2)若Al型和A2型對應的質譜峰僅出現一個，則判斷為所出現質譜峰對應的基因 型的純合型；
[0252 ] (3)若Al型和A2型對應的質譜峰均出現，則判斷為雜合型。
[0253] 根據本發明的聯合檢測方法，結合實施例一，根據實施例二、=中所描述的操作步 驟，對實施例五中檢測出的2例脊椎崎形綜合癥(CVM)攜帶者N19和N23、1例白細胞粘附缺陷 癥(BLAD)攜帶者N66、l例尿巧酸合酶缺乏癥(DUMPS)攜帶者N76、l例瓜氨酸血癥(CN)攜帶者 N93和1例健康奶牛Nl樣本進行0-酪蛋白基因與4種遺傳病聯合檢測。根據實施例四中描述 的判定標準和0-酪蛋白A2/A1蛋白基因 CSN2 (8101)位點的的判定標準對6例樣本進行結果 分析，得到表7及圖31-36。
[0254] 表7奶牛0-酪蛋白基因與4種遺傳病聯合檢測分型結果
[0 巧5]
'[〇巧引如圖31-36W及表7所示，本發明的聯合檢測的引物系統，質譜區分度好，多重擴增 過程的干擾效果不明顯，各延伸引物及其延伸產物之間具有最低程度的疊合，能夠有效地 同時實現0-酪蛋白基因與4種遺傳病的聯合檢測。
【主權項】
1. 一種用于核酸質譜法檢測奶牛的脊椎畸形綜合癥(CVM)、白細胞粘附缺陷癥(BLAD)、 尿苷酸合酶缺乏癥(DUMPS )、瓜氨酸血癥(CN)四種遺傳病的引物組，包括以下序列：2. 權利要求1所述的引物組，其中，延伸引物及延伸產物的分子量如下：3. 權利要求1-2的引物組，其中，PCR擴增引物序列為核心序列，其在5'端可包括5-15個 保護堿基序列，優選為l〇bp的tag: 5 ' -ACGTTGGATG-3 '。4. 權利要求1-3所述的引物組，其中，上述延伸引物的5'端也可以增加作為接頭的堿基 序列。5. 由權利要求1-4的引物組所制備的用于確定奶牛的脊椎畸形綜合癥(CVM)、白細胞粘 附缺陷癥(BLAD)、尿苷酸合酶缺乏癥(DUMPS)、瓜氨酸血癥(CN)四種遺傳病的檢測產品。6. 權利要求5的檢測產品，其中，產品為檢測試劑盒，包括： (1) 用于PCR的反應試劑，包括:權利要求1-4所述的特異性PCR引物，耐高溫的DNA聚合 酶，dNTPs，PCR反應緩沖液； (2) 用于PCR產物純化的試劑； (3) 用于單堿基延伸反應的試劑，包括:權利要求1-4所述的延伸引物，耐高溫的單堿基 延伸酶，ddNTPs，延伸反應緩沖液。7. 權利要求6的檢測產品，其中，試劑盒還可包括：陰性質控品，陽性質控品，純化用樹 月旨，點樣及質譜檢測用的靶片，外切酶，動物基因組DNA提取試劑等試劑。8. 權利要求6檢測產品，其中，用于PCR產物純化的試劑選自堿性磷酸酶，或堿性磷酸酶 和外切酶Exo I，或電泳凝膠回收試劑，或PCR產物純化柱，其中當包括堿性磷酸酶和外切酶 Exo I的純化試劑時，所使用的PCR引物無需包括保護堿基。9. 利用權利要求1-4的引物組，或權利要求5-8的產品，來檢測奶牛是否具有脊椎畸形 綜合癥(CVM)、白細胞粘附缺陷癥(BLAD)、尿苷酸合酶缺乏癥(DUMPS)、瓜氨酸血癥(CN)四種 遺傳病的方法，包括以下步驟： (1)多重PCR反應:使用特異性的針對包含所選擇基因多態位點片段的PCR擴增引物，在 一個反應體系內，通過多重PCR同時擴增含有不同多態位點的序列，得到含擴增目標區域的 PCR產物； (2 )PCR產物純化:對步驟(1)得到的PCR產物進行純化，以減少對后續反應的干擾； (3) 單堿基延伸:使用針對所選擇SNP位點的特異延伸引物，在一個反應體系中，對步驟 (2)得到的純化后PCR產物進行多重單堿基延伸，延伸引物在對應的SNP位點處延伸一個堿 基;該堿基與SNP位點處的基因型互補配對； (4) 延伸產物純化:對步驟(3)得到的延伸產物進行純化，以獲得高純的延伸產物，避免 鹽離子等雜質對后續檢測的影響； (5) 質譜儀檢測：將步驟(4)得到的純化產物點在含有基質的靶片上，放入質譜儀進行 檢測，得到不同SNP位點延伸產物的核酸譜圖。 (6) 將得到的不同SNP位點延伸產物的核酸譜圖，經過質譜儀配套軟件分析后，確認SNP 位點的喊基，從而判定該樣本的基因型。10. 權利要求9的方法，步驟(2)的純化過程可以選擇堿性磷酸酶消化、堿性磷酸酶和外 切酶Exo I消化、切膠純化、PCR純化柱過柱等。11. 利用權利要求1-4的引物組，或權利要求5-8的產品來繁育健康奶牛以及成健康奶 牛群的方法，包括： (1) 根據權利要求9-10中的方法，確定奶牛在脊椎畸形綜合癥(CVM)、白細胞粘附缺陷 癥(BLAD)、尿苷酸合酶缺乏癥(DUMPS)、瓜氨酸血癥(CN)四種遺傳病相關基因多態位點為野 生型或突變型； (2) 選擇在上述四種遺傳病相關基因多態位點處為野生型的奶牛，形成奶牛群。12. -種通過權利要求1-4的引物組，或權利要求5-8的檢測產品，用于制備奶牛篩選、 繁育中進行聯合檢測的產品。13. 權利要求12的產品，其中所述聯合檢測同時包括檢測奶牛的β-酪蛋白基因分型、脊 椎畸形綜合癥CVM、白細胞粘附缺陷癥BLAD、尿甘酸合酶缺乏癥DUMPS、瓜氨酸血癥CN，或包 括酪蛋白基因分型與以上遺傳病中的任意一種或多種組合。14. 權利要求12-13的產品，其中，上述聯合檢測產品中用于核酸質譜檢測奶牛是否具 有酪蛋白Α2/Α1基因的引物組，其序列如下所示：15. 權利要求12-13的產品，其中，上述聯合檢測產品中用于核酸質譜檢測奶牛是否具 有酪蛋白A2/A1基因的引物組，其序列如下所示：16. 權利要求14或15的產品，其中，上述引物組僅包括SEQ ID Νο:21-23或SEQ ID No: 24-26的組合。17. 權利要求14或15的產品，其中，延伸引物及延伸產物的分子量如下所示：18. 權利要求1-17所述的引物組、檢測產品、方法或聯合檢測的產品，其中所述奶牛為 中國荷斯坦奶牛。19. 權利要求1-17所述的引物組、檢測產品、方法或聯合檢測的產品，其中所述奶牛的 DNA可以從含有有核細胞的任何組織中得到，該組織優選為該奶牛的血液、精液、毛發或奶。
【文檔編號】C12Q1/68GK105925674SQ201610262293
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年4月25日
【發明人】孟慶勇, 張玉英, 劉春城, 王金金, 馬慶偉, 柳春霞, 王瑾瑾, 林燕
【申請人】中國農業大學