一種采用慢病毒技術構建的抗腫瘤遷移藥物篩選細胞模型ea-gfp及其應用方法
【專利摘要】本發明涉及一種表達綠色熒光蛋白的哺乳動物腫瘤細胞系EA?GFP的制備方法和應用，該細胞系與親本細胞系相比具有類似的生長曲線，在細胞遷移實驗中，HGF引起的細胞遷移效應顯著，小分子特異性抑制劑對HGF引起的細胞遷移效應抑制效應顯著，以上生物學活性與親本細胞系一致。本發明制備的細胞模型，是將綠色熒光蛋白（GFP）基因通過慢病毒感染的方式插入哺乳動物腫瘤細胞系的基因組內，獲得的穩定表達綠色熒光蛋白的細胞系，該細胞模型在細胞遷移實驗中可以通過直接熒光顯微鏡觀察的方式來顯示實驗結果，簡化了該細胞模型應用于高通量藥物篩選的步驟。
【專利說明】
一種采用慢病毒技術構建的抗腫瘤遷移藥物篩選細胞模型EA-GFP及其應用方法
[0001 ]技術領域本發明涉及藥物篩選領域，具體涉及一種表達綠色熒光蛋白的EA細胞系O
[0002]【背景技術】腫瘤已成為目前威脅人類健康的頭號殺手，抗腫瘤藥物的研發和腫瘤的臨床治療成為科研的熱點，因此建立有效的抗腫瘤藥物篩選模型刻不容緩，腫瘤本身特有的迀移性和侵襲性是腫瘤逃避機體免疫應答的重要機制，因此抑制腫瘤迀移性和侵襲性的藥物備受人們關注。
[0003]高通量藥物篩選技術是將多種技術方法有機結合而形成的新的技術體系，它以分子水平和細胞水平的實驗方法為基礎，以微板形式作為實驗工具載體，以自動化操作系統執行實驗過程，以靈敏快速的檢測儀器采集實驗數據，以計算機對實驗獲得的數據進行分析處理。它的正常開展需要有一個高容量的化合物庫、自動化的操作系統、高靈敏度的檢測系統、高效率的數據處理系統以及高特異性的藥物篩選模型。
[0004]綠色焚光蛋白(GreenFluorescent Protein，簡稱GFP)的基因是從Hc1ria水母的基因組中提取獲得的，蛋白全長238AA，其65-67氨基酸殘基(絲氨酸一酪氨酸一甘氨酸)可自發的形成熒光發色團，在藍色波長范圍的光線激發下，可以發出綠色熒光，吸收光譜的最大峰值為395nm，發射光譜最大峰值為509nm。如今GFP已作為報告基因被廣泛應用于免疫學，神經生物學，遺傳學，器官移植等各個領域。而在腫瘤相關的基礎研究和藥物研發領域，GFP也發揮了極大的作用。
[0005]目前在真核細胞轉染和穩定細胞株構建領域，病毒載體正越來越受到重視。目前常用的病毒載體包括腺病毒載體、腺相關病毒載體、皰疹病毒載體和逆轉錄病毒載體等，其中逆轉錄病毒中的慢病毒載體因其表達的穩定性，包裝容量大以及能夠實現多基因共感染等優勢被廣泛使用于科研中。慢病毒感染能夠將目的基因整合入細胞的基因組，所以不用再培養基中加入篩選壓力就能穩定表達目的蛋白，大大簡化了實驗過程，降低了成本。
[0006]目前使用的慢病毒包裝體系是由HIV病毒的基因組改造而成的。使用最廣泛的為第三代慢病毒，是一種三質粒系統，能用于感染非分裂期的細胞。通過改造去除了不相關基因序列，并使用異源的部分基因代替同源基因(如:envelope-coding質粒)來增加其安全性，同時對啟動子等序列進行修飾改造提高了病毒滴度和轉染效率。最后通過改造得到了自身失活型慢病毒載體(self-1nactivat1n，SIN)有著較高的滴度，轉染效率和安全性。而病毒獲得后除了能用于細胞的感染外，也能用于基因治療。
[0007]EA細胞全稱為EA.hy926，A549細胞和HUVEC細胞融合而成的血管上皮細胞株，是研究腫瘤增殖、迀移和血管生成的常用細胞系。本發明使用慢病毒系統包裝綠色熒光蛋白(GFP)基因，通過慢病毒感染EA細胞，獲得穩定表達GFP的EA細胞株。這一細胞株的建立大大簡化了體外藥物篩選的檢測手段，同時可以應用于藥物對動物腫瘤模型的療效方面的研究，實現腫瘤大小和分布的實時監控和數據收集。
[0008]
【發明內容】
本發明所要解決的技術問題是提供一種能高通量篩選抗細胞迀移藥物的細胞模型。
[0009]解決本發明技術問題的技術方案為:一種篩選抗細胞迀移藥物的細胞模型，是通過慢病毒將綠色熒光蛋白基因轉入到EA細胞系的基因組內，獲得的穩定表達綠色熒光蛋白的EA細胞株。
[0010]其中，上述細胞模型中的GFP基因能夠穩定表達，
其中，上述細胞模型中的GFP序列為SEQ ID NO:1。
[0011]本發明還提供了一種制備上述篩選抗細胞迀移藥物細胞模型的方法，該方法包括以下步驟:
將GFP基因克隆至prrl質粒內，構建成prrl-CMV-GFP重組質粒，將該質粒和慢病毒包裝質粒共轉染對數期的293T細胞，收獲純化病毒，病毒感染對數期EA細胞，經有限稀釋法和熒光篩選，獲得本發明所述的細胞模型。
[0012]本發明還提供了一種抗細胞迀移藥物的篩選方法，該方法包括以下步驟:
a.取上述的用于篩選抗細胞迀移藥物的EA細胞模型接種于transwell小室的上室，篩選組的上室加入含待篩選物的維持培養基，下室加入含HGF的維持培養基；陽性對照組上室為維持培養基，下室加入含HGF的維持培養基；陰性對照組上室和下室均為維持培養基；
b.培養各組細胞，計數各組迀移細胞數量，根據細胞迀移數的多少確定待篩選物是否為需要的潛在藥物；
進一步的，上述的抗細胞迀移藥物篩選方法的細胞迀移數為從上室迀移至下室的細胞數量。
[0013]根據本發明的第一個方面，在仔細分析不同感染技術的基礎上，選擇慢病毒包裝系統來制備穩定表達綠色熒光蛋白的EA細胞株。本發明細胞模型中含有整合到基因組上的GFP基因的編碼序列，且該序列能夠穩定表達。該細胞模型通過檢測熒光信號來直接進行細胞計數，簡化了細胞迀移實驗的步驟和流程，為實現抗細胞迀移藥物高通量篩選奠定基礎。
[0014]根據本發明的第二個方面，建立了制備上述篩選抗細胞迀移藥物的細胞模型的方法。該方法具體可通過以下步驟實施:
將EA細胞培養至對數生長期；
將裝載有GFP基因的慢病毒在Po I ybr ene的介導下感染EA細胞；
經有限稀釋法和熒光顯微鏡篩選得到本細胞模型。
[0015]根據本發明的第三個方面，建立起了以本發明細胞模型為基礎的抗細胞迀移藥物篩選方法，步驟如下:
a.取上述的用于篩選的細胞模型接種于transwell小室內，細胞接種數目為5X 14/孔。分組為篩選組、陽性對照組和陰性對照組。其中篩選組的上室加入含待篩選物的維持培養基，下室加入含HGF的維持培養基；陽性對照組上室為維持培養基，下室加入含HGF的維持培養基；陰性對照組上室和下室均為維持培養基；
b.細胞孵育24h，細胞固定后，無菌棉簽擦掉上室細胞，熒光顯微鏡下計數小室下表面4個固定視野區域的迀移細胞總數，根據迀移細胞數量確定待篩選物是否為需要的潛在藥物；
其中，上述方法步驟3中加入的邪?的用量為12.5]^/1111-200呢/1111，優選為100呢/1111。
[0016]本發明中涉及的常規細胞培養及常規分子生物學的試驗操作，都是本領域普通技術人員參考現有的相關試驗指南或儀器、試劑的使用說明能夠完成的。
[0017]本發明的有益效果在于:本發明細胞模型通過熒光顯微鏡可以直接觀察迀移細胞數，能夠高通量、高靈敏的準確篩選抗細胞迀移藥物;本發明細胞模型的制備方法簡單可控，成本低廉;本發明抗細胞迀移藥物篩選方法步驟簡單，成本低廉，準確性高，可實現高通量的篩選，具有很好的穩定性和可靠性。為抗細胞迀移藥物的篩選提供了新的思路，具有很好的市場前景。
【附圖說明】
[0018]圖1:prrl-CMV-GFP重組質粒的酶切電泳圖。
[0019]圖2:EA-GFP細胞系穩定性分析。其中第I代和第30代分別指第I代和第30代EA-GFP細胞系，明場是指明場下細胞照片，熒光場是指熒光場下細胞照片。
[0020]圖3:EA-GFP細胞系與野生型EA細胞系生長曲線比較。其中橫坐標為細胞生長時間(培養時間)，縱坐標為450nm單波長條件下測定的光度吸收值(波長450nm)o
[0021 ]圖4:EA-GFP細胞系與野生型EA細胞系在HGF作用下細胞迀移結果分辨率；
A為明場條件下HGF作用下EA-GFP細胞系迀移照片；
B為熒光場條件下HGF作用下EA-GFP細胞系迀移照片，A與B為同一區域不同光場下照片;
C為熒光場條件下無HGF作用下EA-GFP細胞系迀移照片；
D為明場下野生型EA細胞系在HGF作用下細胞迀移照片(經結晶紫染色)；
B與A比較，細胞分辨率明顯升高，B與D比較，細胞分辨率沒有顯著差異，證明EA-GFP細胞系在無需染色的情況下即可達到野生型EA細胞系經結晶紫染色后的細胞分辨率。
[0022]圖5= EA-GFP細胞系與野生型EA細胞系在HGF作用下細胞迀移效應比較。其中橫坐標為不同細胞系名稱，縱坐標為細胞迀移率(迀移率)C=EA-GFP細胞系與野生型EA細胞系比較，在HGF作用下細胞迀移效應更加顯著，證明EA-GFP細胞系具有良好的生物學活性，對照為不含HGF對照組。
[0023]圖6= EA-GFP細胞系在不同濃度HGF作用下的細胞迀移效應及細胞活性；
A為EA-GFP細胞系在不同濃度HGF作用下的細胞迀移數量，其中橫坐標為HGF濃度(HGF:ng/ml)，縱坐標為迀移細胞數量(細胞數量)；
B為EA-GFP細胞系在不同濃度HGF作用下細胞活性，其中橫坐標為HGF濃度(HGF:ng/ml)，縱坐標為450nm單波長條件下測定的光度吸收值(波長450nm)o
[0024]圖7:EA-GFP細胞系在不同濃度PF04217903作用下的細胞迀移效應及細胞活性；
A為EA-GFP細胞系在不同濃度PF04217903作用下的細胞迀移數量，其中橫坐標為PF04217903濃度(PF04217903: μΜ)，縱坐標為迀移細胞數量(細胞數量)，對照為不含HGF，不含PF04217903對照組，其他各組均含有100ng/ml的HGF;
B為EA-GFP細胞系在不同濃度PF04217903作用下的細胞活性，其中橫坐標為PF04217903濃度(PRM217903: μΜ)，縱坐標為450nm單波長條件下測定的光度吸收值(波長450nm)。
[0025]圖8:不同濃度DMSO對細胞迀移效應和細胞活性的影響；
A為不同濃度DMSO對細胞迀移數量的影響，其中橫坐標為不同濃度(體積比)DMS0(DMS0:濃度)，縱坐標為迀移細胞數量(細胞數量)，對照為含HGF( 100ng/ml)，不含DMSO對照組；
B為不同濃度DMSO對細胞活性的影響，其中橫坐標為不同濃度DMS0(DMS0:濃度)，縱坐標為450nm單波長條件下測定的光度吸收值(波長450nm)o
【具體實施方式】
[0026]藥品與試劑:各種限制性核酸內切酶、T4DNA連接酶購自NEB公司，膠回收試劑盒、小量質粒抽提試劑盒購自MN公司；轉染試劑M40為實驗室自主制備;DMEM培養基，抗生素，胰酶，D-PBS購自hyclone公司，胎牛血清購自GIBCO公司；HGF，PF04217903購自RD公司，CCK-8試劑盒購自Dojindo公司；其他試劑均為進口和國產分析純試劑。
[0027]儀器:倒置熒光顯微鏡Ti，尼康公司。
本發明的高效表達細胞模型可穩定表達綠色熒光蛋白，因此可以在熒光顯微鏡下直接觀察。
[0028]實施案例一綠色熒光蛋白(GFP)基因載體的選擇
綠色焚光蛋白(Green Fluorescent Pro te in，簡稱GFP)的基因是從d egworeaHc1ria水母的基因組中提取獲得的，蛋白全長238AA，其65-67氨基酸殘基(絲氨酸一酪氨酸一甘氨酸)可自發的形成熒光發色團，在藍色波長范圍的光線激發下，可以發出綠色熒光，吸收光譜的最大峰值為395nm，發射光譜最大峰值為509nm。如今GFP已作為報告基因被廣泛應用于免疫學，神經生物學，遺傳學，器官移植等各個領域。而在腫瘤相關的基礎研究和藥物研發領域，GFP也發揮了極大的作用。
[0029]本發明中使用慢病毒表達載體prrl-CMV作為GFP的表達載體，制備方法使用現有的公認技術，其中GFP的CDNA序列為SEQ ID N0.1所示。
[0030]實施案例二裝載GFP基因的慢病毒的包裝和純化
在真核細胞轉染和基因治療領域，病毒載體正越來越受到重視。目前常用的病毒載體包括腺病毒載體、腺相關病毒載體、皰疹病毒載體和逆轉錄病毒載體等，其中逆轉錄病毒中的慢病毒載體因其表達的穩定性，包裝容量大以及能夠實現多基因共感染等優勢被廣泛使用于科研中。慢病毒感染能夠將目的基因整合入細胞的基因組，所以不用再培養基中加入篩選壓力就能穩定表達目的蛋白，大大簡化了實驗過程，降低了成本。因此本發明使用慢病毒包裝、感染的方法獲得最終的穩定轉染細胞株。
[0031]目前使用的慢病毒包裝體系是由HIV病毒的基因組改造而成的。使用最廣泛的為第三代慢病毒，是一種三質粒系統，能用于感染非分裂期的細胞。通過改造去除了不相關基因序列，并使用異源的部分基因代替同源基因(如:envelope-coding質粒)來增加其安全性，同時對啟動子等序列進行修飾改造提高了病毒滴度和轉染效率。最后通過改造得到了自身失活型慢病毒載體(self-1nactivat1n，SIN)有著較高的滴度，轉染效率和安全性。而病毒獲得后除了能用于細胞的感染外，也能用于基因治療。
[0032]本發明中以人腎上皮細胞(293T)為受體細胞進行慢病毒的包裝，使用prrl-CMV-GFP為重組包裝質粒。
[0033]使用的包裝質粒為pMD2.G，pMD-PRRE 和 pRSV-REV。
[0034]試驗過程如下:
(I)細胞培養用含抗生素和10%血清的完全DMEM培養基接種細胞于35mm細胞培養皿，細胞濃度為6 X15/孔。待細胞完全貼壁后，用轉染試劑M40進行轉染。
[0035](2)轉染過程
DNA和轉染試劑混合物的配制 A溶液:
prr1-CMV-GFP1.7μg
包裝質粒混合物1.8yg
無血清無抗生素DMEM培養基補充至ΙΟΟμΙ，震蕩混勻；
B溶液:
轉染試劑16μ1
無血清無抗生素DMEM培養基補充至ΙΟΟμΙ，輕柔混勻；
將A液與B液輕柔混勻，室溫靜置1min，將混合液加入到細胞中。37°C，5% C02培養箱內培養，次日換為含血清含抗生素的DMEM培養基。
[0036](3)慢病毒的收集和純化
收集轉染后第4天和第5天的細胞上清，將第四天和第五天收集的病毒液4000g，室溫離心1min;離心后的病毒液經0.45μηι濾膜過濾后轉入超濾管內(ufc910024，MILLIP0RE)，常溫，4000g，離心15min ；收集病毒濃縮液，分裝，凍存于_80度。
[0037]實施案例三本發明細胞模型的建立
在本實驗中使用人肝癌細胞(EA)為受體細胞。
[0038]使用的慢病毒為裝載GFP基因的慢病毒。
[0039]試驗過程如下:
(I)細胞培養
用含抗生素和10%血清的完全DMEM培養基接種細胞于35mm細胞培養皿，細胞濃度為6 X15/孔。待細胞完全貼壁后，用轉染試劑M40進行轉染。
[0040](2)感染過程
慢病毒用完全DMEM培養基(含6yg/ml polybrene)稀釋至合適倍數后，加入到棄去上清的EA細胞表面;慢病毒感染24h后，換用含抗生素和10%血清的完全DMEM培養基繼續培養。[0041 ] (3)細胞克隆化
取飼養細胞。實驗小鼠脫白致死，75%酒精浸泡lOmin，無菌解剖，剪開腹部皮膚，不要損傷腹膜，用注射器吸取6_8ml完全培養基，用鑷子夾起腹膜，進針，注意不要戳到內臟和脂肪，進針方位可以在腹部中間，避開腹部下方的脂肪。
[0042]反復吹打腹腔數次，期間用酒精棉球輕揉小鼠腹部，待吸出培養基變黃時將培養基吸出，轉移到離心管內備用。(一只成年小鼠的腹腔巨噬細胞可以滿足6-8塊96孔細胞培養板的鋪板需要)。
[0043]取感染后EA細胞，消化，計數，每20ml培養基(含相應濃度的飼養細胞)加入150個細胞，分96孔板，200μ1/孔。
[0044]細胞培養I天后觀察是否有污染，培養3-5天后計數細胞亞克隆數目，并做記錄。細胞培養10天，選擇單克隆細胞孔在熒光顯微鏡下進行觀察，選擇發綠色熒光的細胞克隆進行消化和擴大培養。
[0045]實施案例四陽性克隆細胞的篩選和細胞迀移體系建立
由于外源基因隨機整合到宿主細胞的染色體上，根據整合位點的隨機性，可能存在宿主細胞狀態差、對信號分子反應弱和目的基因表達穩定性差等問題。因此將所有挑出的陽性克隆細胞擴大培養后，進行細胞生長曲線對比試驗和GFP表達穩定性分析。
[0046]試驗例一 GFP表達穩定性分析
在本實驗中共篩選得到了 4個陽性克隆。對這4個陽性克隆進行連續傳代培養，連續傳代培養試驗方案:細胞匯合度達到80%時，棄去細胞上清，用D-PBS洗滌一遍，加入適量胰酶進行消化，倒置顯微鏡下觀察，待大部分細胞變為圓形時使用有血清有抗生素的完全DMEM培養基終止消化，吹下細胞，100rpm離心10分鐘，留1/4的細胞在原培養體系中繼續培養，待細胞匯合度達到80%時重復上述操作。
[0047]每傳代5次，熒光顯微鏡下觀察熒光細胞的比例和細胞的熒光強度，拍照記錄。結果如圖2所示:EA-GFP細胞系在第30代時其熒光率仍然保持100%，證明EA-GFP細胞系具有良好的穩定性。
[0048]試驗例二本發明細胞模型與野生型細胞生長曲線比較
從上部試驗篩選獲得的4株細胞中選擇細胞生長狀態最好的I株，對這株細胞與野生型EA細胞進行擴大培養，待細胞數量達到一定規模時進行生長曲線分析。生長曲線分析試驗方案:細胞匯合度達到80%時進行細胞消化和計數，按照1.5 X 13/孔的細胞密度鋪板96孔細胞培養板，每組設立3個復孔，使用有血清有抗生素的完全DMEM培養基進行培養，每孔200μ?，分別在24h，48h，72h，96h，120h和144h進行細胞活力分析，具體步驟為:棄去細胞上清，加入含10% CCK-8試劑的無血清無抗生素DMEM培養基100yl，37°C，5% C02
培養箱內孵育2h后，取出細胞，在酶標儀0D450條件下進行讀數，對結果進行分析，結果如圖3所示:EA-GFP細胞系與野生型EA細胞系相比其生長速度較低，但生長曲線趨勢一致，證明EA-GFP細胞系具有良好的生長活性。
[0049]試驗例一和試驗例二證明我們篩選獲得的細胞模型GFP穩定性好，生長曲線與野生型一致，是良好的穩轉細胞株。
[0050]試驗例三本發明細胞模型與野生型細胞在HGF作用下細胞迀移效應比較
試驗例三從生物學活性角度分析本發明細胞模型是否具有由HGF引起的細胞迀移效應，以及這種效應與野生型EA細胞的比較。HGF是肝細胞生長因子，其能夠促進野生型EA細胞的細胞迀移效應。
[0051 ]細胞迀移效率計算公式為:
細胞迀移效率=給藥孔的迀移細胞數+不含藥孔的迀移細胞數其中不含藥孔的細胞迀移效率定為1.0。
[0052]試驗方案:
1)細胞分孔:細胞匯合度達到80%時進行細胞消化和計數，將細胞用低血清(1%FBS)DMEM培養基稀釋至目標濃度，加入小室內，0.5ml/well，5 X 104cell/well，貼壁培養；
2)加藥:加入含100ng/ml濃度的HGF至小室下層，HGF使用低血清(1%FBS)DMEM培養基進行稀釋，0.75ml/well;
3)培養:37°C，5%C02培養箱內孵育24h;
5)洗滌:取出小室，棄去培養基，PBS 0.5mlol time,RT； 6)固定:小室內加入甲醛，0.5ml，10min，RT;
7)擦拭:取出小室，用棉簽擦掉小室上層細胞，并用PBS淋洗一次；
8)染色:結晶紫染色液置于24孔板0.5ml，將小室置于其中，>30min，RT(步驟8_9為野生型EA細胞操作步驟，本發明細胞模型無需染色，直接在熒光顯微鏡下觀察)
9)洗滌:大量自來水置于500ml燒杯中，漂洗小室；
10)成像計數:顯微鏡下成像，計數。
[0053]結果分析
結果如圖4和圖5所示:
圖4為EA-GFP細胞系與野生型EA細胞系在HGF作用下細胞迀移結果，
其中圖A為明場條件下HGF作用下EA-GFP細胞系迀移照片；
圖B為熒光場條件下HGF作用下EA-GFP細胞系迀移照片，圖A與圖B為同一區域不同光場下照片；
圖C為熒光場條件下無HGF作用下EA-GFP細胞系迀移照片；
圖D為明場下野生型EA細胞系在HGF作用下細胞迀移照片(經結晶紫染色)；
其中圖B與圖A比較，細胞分辨率明顯升高，圖B與圖D比較，細胞分辨率沒有顯著差異，證明EA-GFP細胞系在無需染色的情況下即可達到野生型EA細胞系經結晶紫染色后的細胞分辨率。
[0054]圖5為EA-GFP細胞系與野生型EA細胞系在HGF作用下細胞迀移效應比較。EA-GFP細胞系與野生型EA細胞系比較，在HGF作用下細胞迀移效應更加顯著，證明EA-GFP細胞系具有良好的生物學活性。
[0055]試驗例一和試驗例二證明我們篩選獲得的細胞模型GFP穩定性好，生長曲線與野生型細胞一致，是良好的穩轉細胞株。試驗例三從生物學活性角度分析本發明細胞模型具有與野生型EA細胞一致的對HGF敏感的細胞迀移效應。
[0056]試驗例四EA-GFP細胞系在不同濃度HGF作用下的細胞迀移效應及細胞活性分析試驗例四通過加入不同濃度的HGF，分析不同濃度HGF引起的細胞迀移效應以及細胞活性分析。
[0057]細胞迀移效應試驗方案:分別在小室下部加入不同濃度的HGF。
[0058]細胞活性分析試驗方案:細胞匯合度達到80%時進行細胞消化和計數，按照5X13/孔的細胞密度鋪板96孔細胞培養板，每組設立3個復孔，使用含1% FBS的DMEM培養基進行培養，每孔200μ1，次日加入含不同濃度HGF的1% FBS的DMEM，加藥后72h時進行細胞活力分析，具體步驟為:棄去細胞上清，加入含10% CCK-8試劑的無血清無抗生素DMEM培養基100μ?，37°C，5% C02培養箱內孵育2h后，取出細胞，在酶標儀0D450條件下進行讀數，對結果進行分析，結果如圖6所示:
其中圖A:其中橫坐標為HGF濃度(HGF: ng/ml )，縱坐標為迀移細胞數量(ce 11number) AGF濃度在100ng/ml時EA-GFP細胞系的細胞迀移效應最顯著，因此選擇此濃度建立抗細胞迀移藥物篩選方法；
圖B:其中橫坐標為HGF濃度(HGF: ng/ml)，縱坐標為450nm單波長條件下測定的光度吸收值(0D450 )。EA-GFP細胞系在不同濃度HGF作用下的細胞活性無變化，證明HGF對EA-GFP細胞系增殖活性沒有影響。
[0059]試驗例一和試驗例二證明我們篩選獲得的細胞模型GFP穩定性好，生長曲線與野生型細胞一致，是良好的穩轉細胞株。試驗例三從生物學活性角度分析本發明細胞模型具有與野生型EA細胞一致的對HGF敏感的細胞迀移效應。
[0060]試驗例五EA-GFP細胞系在不同濃度PF04217903作用下的細胞迀移效應及細胞活性分析
試驗例五通過加入HGF抑制劑PF04217903，分析PF04217903對HGF引起細胞迀移效應的抑制效應。？^)4217903是一種選擇性的4了?競爭性(3-]^丨抑制劑，1050為4.8 nM。
[0061 ] 細胞迀移效應試驗方案:分別在小室上部加入不同濃度的PF04217903，小室下部加入 100 ng/ml 的HGF13Control為不含HGF，不含PF04217903對照組。
[0062]細胞活性分析試驗方案:參照試驗例四步驟，分別加入不同濃度的PF04217903和100 ng/ml 的HGF。control為不含HGF，不含PF04217903對照組。
[0063]結果如圖7所示:
其中圖A:其中橫坐標為PF04217903濃度(PF04217903: μΜ)，縱坐標為迀移細胞數量(cell number) ,control為不含HGF，不含PF04217903對照組。其他各組均含有100ng/ml的HGF。HGF濃度在100ng/ml時，不同濃度PF04217903對HGF引起的EA-GFP細胞系的細胞迀移效應完全抑制；
圖B:其中橫坐標為PF04217903濃度(PF04217903: μΜ)，縱坐標為450nm單波長條件下測定的光度吸收值(0D450XEA-GFP細胞系在不同濃度PF04217903和100 ng/ml的HGF共同作用下的細胞活性無變化，證明PH)4217903對EA-GFP細胞系增殖活性沒有影響。
[0064]試驗例六不同濃度DMSO對藥物篩選方法的影響
抗細胞迀移藥物可能溶于DMS0。因此有必要檢測不同濃度DMSO對藥物篩選方法的影響。
[0065]細胞迀移效應試驗方案:分別在小室上部加入不同濃度的DMS0，小室下部加入100ng/ml的HGF。control為不含HGF，不含DMSO對照組。
[0066]細胞活性分析試驗方案:參照試驗例四步驟，分別加入不同濃度的DMSO和100 ng/ml的HGF。control為不含HGF，不含DMSO對照組。
[0067]試驗結果如圖8所示:
其中圖A顯示不同濃度的DMSO對HGF引起的細胞迀移效率沒有顯著影響，圖B顯示不同濃度的DMSO對細胞增殖沒有顯著影響。
【主權項】
1.一種用于檢測人源性BAX基因表達水平的特異性引物組合，該組合包含以下引物序列: BAX基因檢測的引物組合: 上游引物 F-bax: CGGGTTGTCGCCCTTTTCTA 下游引物 R-bax: GTCCAATGTCCAGCCCATGA RPL19內參基因檢測的引物組合: 上游引物F-rpl: CGAGCGAGCTCTTTCCTTT 下游引物R-rpI: AGACCTTCTTCTTGCCACAGC。2.—種檢測人源性BAX基因表達水平的方法，其特征在于，使用如權利要求1所述的特異性引物組合而進行。3.—種用于檢測人源性BAX基因表達水平的試劑盒，其特征在于，包含有如權利要求1所述的特異性引物組合。4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，還包括DNA聚合酶、dNTP和緩沖液。5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述聚合酶為熱穩定性DNA聚合酶。
【文檔編號】C12N15/867GK105925673SQ201610254110
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年4月23日
【發明人】蔣明, 蔣韻, 尹衍新, 劉敏亞
【申請人】同濟大學蘇州研究院