一種檢測嗜酸氧化硫硫桿菌sor基因mRNA表達水平的特異性引物的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種檢測嗜酸氧化硫硫桿菌sor基因mRNA表達水平的特異性引物，其核苷酸序列如下：上游引物序列：5′?AAGCCCGTGCCTAAAGTG?3′，下游引物序列：5′?CTGCCATAGTTGGTGTTGT?3′。本特異性引物可對嗜酸氧化硫硫桿菌sor基因轉錄水平進行檢測，在檢測基因mRNA表達水平方面具有靈敏度高、特異性好等優點。通過實時監測硫氧化代謝過程中sor基因mRNA表達水平，用于解釋嗜酸氧化硫硫桿菌的硫氧化機理。
【專利說明】一種檢測嗜酸氧化硫硫桿菌基因mRNA表達水平的特異性引物
技術領域
[0001]
本發明屬于分子生物學領域，具體涉及一種檢測嗜酸氧化硫硫桿菌sor基因mRNA表達水平的特異性引物。
【背景技術】
[0002]作為一種無機化能自養型、革蘭氏陰性、桿狀的極端微生物，嗜酸氧化硫硫桿菌與硫化礦系(煤礦、黃銅礦、黃鐵礦、輝銅礦等)的生物浸出密切相關，其在工業應用領域具有廣泛的前景。嗜酸氧化硫硫桿菌能以元素硫及還原型無機硫化合物(Reduced InorganicSulfur Compounds，簡稱RISCs)作為能源物質。關于嗜酸氧化硫硫桿菌的研究至今從未間斷，但對于其生物化學過程則有待進一步的補充和完善。在嗜酸氧化硫硫桿菌中硫氧化酶系的作用下，元素硫或還原型無機硫化合物經過一系列的酶反應或非酶反應最終產生硫酸鹽而釋放到機體外，硫酸鹽對于維持體系中的PH至關重要。
[0003]作為需氧的硫氧化過程中的初始酶，硫氧化還原酶(SOR)存在于某些嗜熱古菌和嗜酸菌中，其在嗜酸嗜熱古菌如騰沖嗜酸兩性菌(d c i c/ia/3 us ie/設cA o/3ge/3 si s)和布氏嗜酸兩性菌ambivalens)以及喜溫硫桿菌{Acidith1baciIIuscaldus)均有敬道。SOR依賴氧分子催化單質硫發生歧化反應，能夠同時產生硫化物、亞硫酸鹽和硫代硫酸鹽。該酶催化的反應具備以下特點:①反應相關的酶是可溶性的且位于細胞質內；②反應的最適 pH 和最適溫度分別為 7.0 ± 0.5 ( Sulfolobusbrierleyi)和 65_85°C{Acidianustengchongensis及Acidianusambivalens);③該反應不需借助外源輔助因子及電子供體。硫氧化還原酶具有催化元素硫發生歧化反應的能力，其產物硫化物、硫代硫酸鹽以及亞硫酸鹽均在硫氧化途徑中充當重要的中間代謝產物，因此該酶在元素硫和還原型無機硫化合物的氧化過程至關重要。
[0004]熒光定量PCR技術是在普通PCR(Polymerase Chain React1n, PCR)的基礎上，結合實時熒光檢測技術和計算機分析技術。它是通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR產物進行標記跟蹤，實時在線監控反應過程，結合相應的軟件可以對產物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度。它的出現，極大地簡化了定量檢測的過程，而且真正實現了絕對定量。
【發明內容】
[0005]本發明提供了一種檢測嗜酸氧化硫硫桿菌硫氧化還原酶基因mRNA表達水平的特異性引物，并采用熒光定量PCR技術，通過反復實驗和優化，我們得到一組能夠有效檢測嗜酸氧化硫硫桿菌sor基因mRNA表達量的引物，并總結出一套最佳的PCR反應使用的參數。
[0006]本發明提供一種嗜酸氧化硫硫桿菌sor基因mRNA表達水平的熒光定量PCR檢測的特異性引物，所述引物的核苷酸序列為:上游引物:57 -AAGCCCGTGCCTAAAGTG-37，
下游引物:5' -CTGCCATAGTTGGTGTTGT-37。
[0007 ]對應地，本發明提供一種嗜酸氧化硫硫桿菌sor基因mRNA表達水平的熒光定量PCR檢測方法，包括以下步驟:
(1)嗜酸氧化硫硫桿菌總RNA的提取和純化；
(2)對步驟(I)提取的RNA進行逆轉錄生成cDNA，利用權利要求1所述的特異性引物進行熒光定量PCR;
(3)根據熒光定量PCR的結果計算出mRNA表達水平。
[0008]其中步驟(3)中的PCR擴增的反應程序為:95°C變性30 sec;在退火溫度56° C下復性15s; 72° C延伸25 s，40個循環。
[0009]優選地，其中采用甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因作為轉錄內參基因；使用△ACt方法計算基因的相對表達量。
[0010]本發明還提供一種用于上述的熒光定量PCR檢測方法的檢測試劑盒，該試劑盒包括如上所述的特異性引物。
[0011 ]具體地，所述方法更具體步驟如下:
(1)采用離心的方法回收菌體，然后使用Trizol試劑來提取RNA，接著使用MicroElute RNA Clean-Up Kit (OMEGA)，提取的總RNA按照說明進行純化，然后使用RNase-free DNase I (OMEGA)去除提取物中含有的基因組DNA;
(2)使用NanoDropND-1000 分光光度計(NanoDrop Technologies)檢測RNA 的濃度和純度，參數設置為0D260 和0D280，使用OMEGA MicroElute RNA Clean-Up Kit (50)純化 RNA;
(3)利用FirstStrand cDNA Synthesis Kit (TOYOBO)對2 Hg總RNA進行逆轉錄;
(4)以I μ I 逆轉錄產物 cDNA 作為模板，使用 QuantiFast? SYBR? Green PCR Kit(QIAGEN)配置25 μ? 的體系，然后使用MyIQ Single Color Real-Time PCR Detect1nSystem (B10-RAD)進行實時定量PCR。
[0012]本發明采用上述的技術方案，通過監測不同時期嗜酸氧化硫硫桿菌sor基因mRNA表達水平和用于解釋硫氧化機理，進而可以作為該菌對硫元素或還原型無機硫化合物氧化速率的依據。
[0013]本發明以嗜酸氧化硫硫桿菌中的sor基因為模板，設計出一系列引物，并通過優化條件和反復實驗，挑選出一對高特異性的引物。該引物在mRNA水平監測sor基因不同時期的表達差異更具有針對性，能夠有效地反映硫氧化過程中基因的表達情況，從而能夠作為考查硫氧化速率的一項重要的參照指標。
【附圖說明】
[0014]圖1為實施例2中的樣品擴增曲線；
圖2為實施例2中的標準曲線；
圖3為實施例2中的樣品溶解曲線。
[0015]
【具體實施方式】
[0016]實施例1、特異性引物對的篩選與獲得
硫氧化還原酶由sor基因編碼，該酶具有催化元素硫發生歧化反應的能力，在元素硫和還原型無機硫化合物的氧化過程至關重要。硫氧化還原酶存在于某些嗜熱古菌和嗜酸菌中，其在嗜酸嗜熱古菌如騰沖嗜酸兩性菌和布氏嗜酸兩性菌以及嗜酸細菌如喜溫硫桿菌均有報道。
[0017]通過全基因組測序，我們獲得th10xidans AOl的全基因組序列信息，并首次在該種中報道了硫氧化還原酶編碼基因的存在。根據兒th10xidansAOl的sor基因(NCBI登錄號為KJ483962)，通過Primer 5設計多組引物，盡量滿足引物設計的規則，尤其是盡可能避免引物二聚體、錯配和發夾結構。5對引物分別為:
引物 I上游序列:5' -ACCAACTATGGCAGTCAGG-37引物 I 下游序列:5' -ATCATGGGTCCAAAGAGC-37引物2上游序列:57 -AAGCCCGTGCCTAAAGTG-37引物2下游序列:57 -CTGCCATAGTTGGTGTTGTAC-37引物3上游序列:5' - AAGCCCGTGCCTAAAGTG-37引物3下游序列:57 - CTGCCATAGTTGGTGTTGT-37引物4上游序列:57 -CAACACCAACTATGGCAGTC-37引物4下游序列:57 -ATCATGGGTCCAAAGAGC-37引物5上游序列:5' -ACCAACTATGGCAGTCAGG-37引物5下游序列:57 -CATGGGTCCAAAGAGCAT-37
通過設置溫度梯度(50°C?60°C;以2為步長遞增)，引物4和5出現多處明暗不等的雜帶，可判斷該引物對的特異性差;而引物I和2的電泳圖顯示，靠近目的條帶的地方出現較暗的雜帶，初步分析可能為引物二聚體。而引物3具有較好的特異性，且根據不同溫度下的實驗結果，最終確定引物最佳的退火溫度(56° C)。
[0018]實施例2、嗜酸氧化硫硫桿菌在不同能源下硫氧化還原酶基因mRNA表達水平一、培養基和培養條件
菌株Acidith1baciIliis th10xidans AOl分別選用9K培養基和德國生物材料資源中心培養基71 (DSMZ medium 71)進行液體培養。其中，含10.0 g/L元素硫的9K培養基用5 mol/L的H2S04調節培養液初始pH至2.0，而含5.0 g/L硫代硫酸鈉的DSMZ medium 71培養基調pH至4.4。細菌在裝有100 mL培養液的錐形瓶(規格為250 mL)培養，其細菌初始濃度為2.5X 16個/毫升，培養溫度為30°C，搖床振蕩頻率為170 rpm。
[0019]二、RNA 的提取
在對數中期(54 h)(三個重復實驗求平均值)采用離心的方法回收菌體并用以提取RNA，然后使用RNase-free (MH2O清洗樣品兩次。具體步驟如下:
(I)細胞裂解。12000 rpm離心20 min收集菌體，加入I ml的Trizol試劑，并反復吹打移液槍，使細胞充分裂解。
[0020](2)為使核酸蛋白復合物完全分離，將勻漿樣品在15-30°C溫育5 min。
[0021](3) 4。C下，10000 rpm 離心2 min，收集上清液。
[0022](4)按每I ml Trizol加0.2 ml的比例添加氯仿，蓋好離心管，吸打15 S，室溫溫育3 min。
[0023](5) 4。C下，10000 rpm離心10-15 min后，樣品分成三層:底層為黃色的有機相，中間層及上層無色的水相，而RNA主要在水相中，使用移液槍小心把水相(約600 μ?)轉移到新離心管中。
[0024](6)在加有水相溶液的新離心管中加入等體積(600 μ?)的異丙醇，經充分混勻后，室溫放置20-30 min。
[0025](7) 4。C，10000 rpm 離心 10 min，棄上清。
[0026]三、RNA的純化
(I) RNA樣品加DEPC-Water至總體積為100 μ?。
[0027](2)加350 μ I QVL Lysis buffer (每 Iml 加20 μ I β_ 巰基乙醇)，另加入 2 μ ILinear Acrylam1le，禍方定混勾。
[0028](3)加250 μ?無水乙醇到樣品混合液中，混合均勻。
[0029](4)轉移700 μ?混合液到套著2 ml收集管的RNeasy純化柱子中，12，000 rpm離心I min，棄收集液。
[0030](5)加300 μ I RffB Buffer (已稀釋)到柱子中，10，000 rpm、離心 I min，棄收集液。
[0031](6)取另一新的離心管，加入 73.5 μ I DNase I Digest1n Buffer和I.5 μ IRNase-free DNase I，充分混勾。
[0032](7)將配成的75 μ? DNase I消化混合液轉移到RNeasy純化柱硅膠膜正中間，室溫(25-30°C)放置15 min。
[0033](8)加400μ1 RffB Wash buffer (已稀釋)到RNeasy純化柱中，室溫放置5 min, 10,000 rpm離心I min，棄收集液。
[0034](9)加500 μ I RffB Buffer (已稀釋)到RNeasy 純化柱中，10,000 rpm 離心 I min,
棄收集液。
[0035](10)重復步驟9。
[0036](11)空柱13,000 rpm離心2 min空用干燥柱子基質。
[0037](12)將柱子轉移到新的1.5ml離心管，加入30 μ I DEPC-treated Water到RNeasy純化柱基質中，靜置2 min，10 ,OOOrpm離心I min。
[0038]四、反轉錄cDNA的合成
(I)配置反應體系:11 μ? RNA樣品和I μ?隨機引物。
[0039](2)輕輕混勻反應體系后，進行如下處理:65°C加熱5 min，置于冰上2_3 min，充分冷卻后，短暫低速離心。
[0040](3)再在反應體系中依次添加12 μ?變性RNA，4 μ? 5 X RT buffer，2 μ? dNTPMixture，I μI RNase Inhibitor和I μ? ReverTra Ace。
[0041 ] (4)輕輕上下吸打均勻。
[0042](5)樣品依次在如下條件下進行處理:30°C，10 min;42°C，20 min;99°C，5 min；4°C，5 min0
[0043](6)使用NanoDrop微量分光光度計檢測cDNA質量，然后將樣品稀釋成200 ng/μI，再使用Real-time PCR進行檢測以備待用。
[0044]五、實時定量RT-PCR
PCR的參數設置為:95°C，30 s;56。C，15s;72。C，25 s，循環數為40。此外，甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因作為轉錄內參基因，并使用△ ACt方法計算基因的相對表達量，其倍數變化采用2—AAet表示。
[0045]實驗結果請參見圖1至圖3，圖1顯示樣品擴增曲線，圖2顯示標準曲線，圖3顯示樣品溶解曲線。其中，樣品擴增曲線(圖1)顯示，樣品擴增的Ct值為26，且擴增在38個循環后達到平臺期。Real-time PCR標準曲線(圖2)表明，擴增的動力學方程相關系數為0.999，PCR擴增效率為82.1%。一般地，擴增效率的范圍在80%?120%，所以該標準曲線的標準方程是理想的。該樣品溶解曲線(圖3)為單一吸收峰，無非特異性產物和引物二聚體等生成，從而表明該引物的特異性良好，能夠用于后續實驗，且Real-time PCR結果能夠準確反映樣品初始濃度。
【主權項】
1.一種嗜酸氧化硫硫桿菌sor基因mRNA表達水平的熒光定量PCR檢測的特異性引物，所述引物的核苷酸序列為: 上游引物:57 -AAGCCCGTGCCTAAAGTG-37， 下游引物:5' -CTGCCATAGTTGGTGTTGT-37。2.—種嗜酸氧化硫硫桿菌sor基因mRNA表達水平的熒光定量PCR檢測方法，包括以下步驟: 嗜酸氧化硫硫桿菌總RNA的提取和純化； 對步驟(I)提取的RNA進行逆轉錄生成cDNA，利用權利要求1所述的特異性引物進行熒光定量PCR; 根據熒光定量PCR的結果計算出mRNA表達水平。3.根據權利要求2所述的熒光定量PCR檢測方法，其中步驟(3)中的PCR擴增的反應程序為:95°C變性30 sec;在退火溫度56°(:下復性158;72°(:延伸25 s，40個循環。4.根據權利要求2或3所述的熒光定量PCR檢測方法，其中采用甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因作為轉錄內參基因；使用A ACt方法計算基因的相對表達量。5.—種用于如權利要求2至4任一項所述的熒光定量PCR檢測方法的檢測試劑盒，其特征在于包括如權利要求1所述的特異性引物。
【文檔編號】C12Q1/04GK105925667SQ201610199719
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年4月1日
【發明人】尹華群
【申請人】中南大學