一種利用銀耳同時制備銀杏內酯b和槲皮素的方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用銀耳同時制備銀杏內酯B和槲皮素的方法，涉及生物工程技術領域。所述制備方法依次經過試管擴大培養、液體搖瓶培養和種子罐擴大培養、固體前發酵培養、液體后發酵培養及提取分離步驟制得含有銀杏內酯B的發酵液和含有槲皮素的菌絲體；再分別經過提取制得銀杏內酯B和槲皮素晶體。本發明以去皮白果和大米為固體基質添加銀杏葉提取物，以銀耳為菌種通過固體前發酵，轉化銀杏內酯和銀杏黃酮，通過后發酵，使槲皮素和銀杏內酯B得以分離，可實現工業化大規模生產，并可以同時生產銀杏內酯B和槲皮素；工藝簡單，且所得到的產品中，銀杏內酯B純度大于90%，槲皮素純度大于95%，制取的純度較高。
【專利說明】
一種利用銀耳同時制備銀杏內酯B和槲皮素的方法
技術領域
[0001]本發明涉及生物工程技術領域，具體涉及一種利用銀耳同時制備銀杏內酯B和槲皮素的方法。
【背景技術】
[0002]目前，研究證明銀杏內酯是銀杏葉中主要的活性成分之一，是一類特異有效的血小板活化因子(Platelet activating factor)受體措抗劑。血小板活化因子(PAF)是由血小板和多種炎癥組織分泌產生的一種內源性磷酯，是目前發現的最有效的血小板聚集誘導劑，與許多疾病的產生、發展密切相關。銀杏內酯作為PAF受體特異性拮抗劑，具有廣泛的藥理作用。研究發現銀杏內酯B對中樞神經系統與缺血損傷有保護作用，抗休克、抗過敏、抗菌抗炎作用，以及抗器官移植中的排斥反應。同時還發現銀杏內酯B可降低肝門靜脈壓，提高全身血管耐受性，說明它對肝硬化有一定的療效。銀杏內酯對于腎損傷有治療作用。這些作用都與銀杏內酯B作為PAF受體拮抗劑有關，并且它目前被認為是作用最強的、最有臨床應用前景的天然血小板活化因子(PAF)受體拮抗劑。
[0003]槲皮素及其衍生物是植物界分布廣泛的，具有多種生物學活性的黃酮類化合物。近年來，國內外醫藥工作者對槲皮素的研究日益增多，發現其具有許多藥理活性，如抗氧化及清除氧自由基作用、抗纖維化作用、抗腫瘤作用、能降低血壓，保護心肌缺血再灌注損傷、抗病毒、鎮痛及止瀉等，并且槲皮素對人體無毒、無害、無致癌、無致死、無致畸等優點，國外曾試用于多種疾病的治療，取得了良好的效果。槲皮素存在于許多植物的花、葉、果實中，多以甙的形式存在，如蘆丁、槲皮甙、金絲桃甙等，這些甙通常經酸水解制備槲皮素。極少用生物的方法制備槲皮素。
[0004]近年來有學者提出了中藥發酵制藥技術。所謂的中藥發酵制藥技術是在繼承中藥炮制學發酵法的基礎上，吸取了微生態學研究成果，結合現代生物工程的發酵技術而形成的高科技中藥制藥新技術，是從中藥(天然藥物)制藥方面尋找藥物的新療效。傳統的中藥發酵多是在天然的條件下進行的，而現在的中藥發酵制藥技術是在充分吸收了近代微生態學、生物工程學的研究成果而逐漸形成的。
[0005]現有技術中普遍采用對銀杏內酯B和槲皮素分別利用單純的分離提純方法來獲得大量的銀杏內酯B和槲皮素，分離效率低下，不能適用于工業化大規模生產，并且單獨提純分離方法較落后，生產成本較高。
本案發明人經過深入研究和反復工業化生產試驗，摸索出工業化規模同時生產銀杏內酯B和槲皮素技術，本發明無論從產品的生產方式和生產的產品，都有別于以往的專利和文章報道的內容，即一種利用銀耳同時生產銀杏內酯B和槲皮素的方法。
【發明內容】
[0006]、要解決的問題
針對現有技術中存在的上述問題，本發明提供一種利用銀耳同時制備銀杏內酯B和槲皮素的方法，其以去皮白果和大米為固體基質添加銀杏葉提取物，以銀耳為菌種通過固體前發酵，轉化銀杏內酯和銀杏黃酮，通過后發酵，使槲皮素和銀杏內酯B得以分離，可實現工業化大規模生產，并可以同時生產銀杏內酯B和槲皮素;工藝簡單，且所得到的產品中，銀杏內酯B純度大于90%，槲皮素純度大于95%，制取的純度較高。
[0007]、技術方案
為了解決上述問題，本發明所采用的技術方案如下:
所述的一種利用銀耳同時制備銀杏內酯B和槲皮素的方法，所述制備方法以大米、去皮白果和銀杏葉提取物為主要原料，以銀耳為出發菌株，依次經過試管擴大培養、液體搖瓶培養和種子罐擴大培養、固體前發酵培養、液體后發酵培養及提取分離步驟制得含有銀杏內酯B的發酵液和含有槲皮素的菌絲體;所述含有銀杏內酯B的發酵液和含有槲皮素的菌絲體再分別經過提取制得銀杏內酯B和槲皮素晶體，其中銀杏內酯B純度達到90%，槲皮素純度達到95%。
[0008]—種利用銀耳同時制備銀杏內酯B和槲皮素的方法，按照下述步驟進行:
Al試管擴大培養:將銀耳(Tremella fuciformis Berk.)中斜面菌種接種于馬鈴薯葡萄糖培養基中進行培養，制得銀耳試管斜面菌種；
A2液體搖瓶培養:將步驟Al所制得的銀耳試管斜面菌種接種到裝有液體搖瓶培養基的搖瓶中，進行培養，制得銀耳液體搖瓶菌種；
A3種子罐擴大培養:將步驟A2所制得的銀耳液體搖瓶菌種接種到種子罐培養基中進行培養，制成銀耳種子罐菌種；
A4固體前發酵培養:將步驟A3所制得的銀耳種子罐菌種接種到固體培養基中，并混合均勻，進行發酵培養，制得銀耳固體發酵物；
A5液體后發酵培養:將步驟A4所制得的銀耳固體前發酵物轉移到液體發酵罐培養基中，進行液體后發酵，制得含有銀杏內酯B的發酵液和含有槲皮素的銀耳菌絲體；
A6提取分離:將步驟A5所制得的含有槲皮素的銀耳菌絲體和含有銀杏內酯B的發酵液分別經過提取，得到槲皮素和銀杏內酯B晶體。
[0009]優選地，一種利用銀耳同時制備銀杏內酯B和槲皮素的方法，按照下述步驟進行:
BI試管擴大培養:將銀耳試管中斜面菌種切成3X3 mm小塊菌種，接種一小塊到試管斜面培養基中，20?35°C培養4?15天，制得試管斜面菌種，該試管斜面4°C保存備用；
B2液體搖瓶培養:將步驟BI所制得的試管斜面菌種切成3 X 3 mm小塊菌種，挑取3?10塊接種于裝有20?150mL液體搖瓶培養基的250mL三角瓶中，三角瓶在轉速為50?200轉/分，溫度20?35°C的條件下，搖床培養18-86h，制成液體搖瓶菌種；
B3種子罐擴大培養:將步驟B2所制得的液體搖瓶菌種接種于種子罐擴大培養基中，且所述液體搖瓶菌種與種子罐擴大培養基按體積比為I?20%的接種量接種，在溫度為20?3 50C，攪拌轉速為50?160轉/分，在每分鐘通入氣體的體積與種子罐擴大培養基體積比為0.2?1.8:1的通氣量條件下，培養18?96h，制成銀耳種子罐菌種；
B4固體前發酵培養:將步驟B3所制得的銀耳種子罐菌種接入裝有固體前發酵培養基的培養袋中，且所述銀耳種子罐菌種與裝有固體前發酵培養基的培養袋按體積比為2?10%的接種量接種，在溫度20?35°C，濕度80%前發酵20?40天，其中每隔3?6天，翻袋一次，制得固體前發酵物； B5液體后發酵培養:將步驟B4所制得的固體前發酵物粉碎至20目，加入到液體發酵罐培養基中，所述液體發酵罐培養基體積與固體前發酵物的重量比為5?10，在溫度為20?43°C，攪拌轉速為50?160轉/分，在每分鐘通入氣體的體積與液體發酵罐培養基體積比為
0.2-1.8:1的通氣量條件下發酵24?72h，所制得的發酵液體在2000?6000轉/分鐘條件下離心制得含有銀杏內酯B的發酵液和含有槲皮素的菌絲體；
B6提取分離:將步驟A5所制得的含有槲皮素的銀耳菌絲體和含有銀杏內酯B的發酵液分別經過提取，得到槲皮素和銀杏內酯B晶體。
[0010]優選地，步驟B2中所述液體搖瓶培養基是在100?130°C條件下滅菌90?360 min制得，且每升液體搖瓶培養基中含有麩皮5?20g，大米5?20g的原料。
[0011]優選地，步驟B3中所述種子罐擴大培養基是在100?130°C條件下滅菌90?360min制得，且每升液體搖瓶培養基中含有麩皮5?20g，大米5?20g的原料。
[0012]優選地，步驟B4中所述固體前發酵培養基是在100?130°C條件下滅菌90?360min制得，且每一千克固體前發酵培養基中含有去皮白果200?400g、銀杏葉提取物30?50g和大米750?570g的原料。
[0013]優選地，所述固體前發酵培養基中的原料按1:0.6?1.5的比例與水混合。
[0014]優選地，步驟B5中所述液體發酵培養基是在100?130°C條件下滅菌30?60 min制得，且每升液體發酵培養基含有5?40g葡萄糖，0.5?4g蛋白胨和0.01?0.1gK2HPO4。
[0015]優選地，步驟A6或步驟B6中所述從含有槲皮素的銀耳菌絲體中制取槲皮素晶體的方法包括如下步驟:
Cl將所制得的銀耳菌絲體烘干，然后粉碎至20目，加入菌絲體重量的5?20倍體積的60?100%的乙醇，反復提取3?5次，得提取液一；
C2將步驟Cl所制得的提取液一合并，然后減壓濃縮至原體積的1/30，加入剩余體積5倍的水，于4°C條件下結晶3?18小時，然后抽濾干燥，即得到槲皮素晶體，槲皮素純度大于95%。
[0016]優選地，步驟A6或步驟B6中所述從含有銀杏內酯B的發酵液中制取銀杏內酯B晶體的方法包括如下步驟:
Dl將所制得的銀杏內酯B的發酵液減壓濃縮并干燥得產物；
D2向步驟Dl所得產物中加入重量的5?20倍的60?100%乙醇回流提取3?5次，得提取液二；
D3將步驟D2所制得的提取液二合并，然后減壓濃縮至原體積的1/40，于-20°C條件下結晶3?18小時；
D4將步驟D3結晶后的產物進行抽濾，抽濾所得濾渣用乙酸乙酯復溶，然后將乙酸乙酯相減壓濃縮至干，再用無水乙醇復溶，并加入3?10倍體積的水，沉淀，抽濾，所得濾渣烘干即為銀杏內酯B，其純度大于90%。
[0017]、有益效果
相比于現有技術，本發明的有益效果為:
(I)本發明在吸取中藥發酵制藥技術的基礎上，結合現代固態發酵和液態發酵各自的優點，采用固態前發酵轉化銀杏活性成分黃酮和銀杏內酯，克服了液態發酵過程中基質(銀杏葉的活性成分)對銀耳菌絲生長的抑制作用，同時利用深層發酵技術，銀耳將銀杏內酯B分泌到細胞外而將黃酮轉化成槲皮素積累在細胞內，將銀杏內酯B和槲皮素分離；
(2)本發明所述的一種利用銀耳同時制備銀杏內酯B和槲皮素的方法，不是單純的利用分離提純方法獲得大量的銀杏內酯B和槲皮素，而是以去皮白果和大米為固體基質添加銀杏葉提取物，以銀耳為菌種通過固體前發酵，轉化銀杏內酯和銀杏黃酮，通過后發酵，使槲皮素和銀杏內酯B得以分離，可實現工業化大規模生產，并可以同時生產銀杏內酯B和槲皮素；
(3)本發明所述的一種利用銀耳同時制備銀杏內酯B和槲皮素的方法，工藝簡單，且所得到的產品中，銀杏內酯B純度大于90%，槲皮素純度大于95%，制取的純度較高。
【附圖說明】
[0018]圖1為本發明所述的一種利用銀耳同時制備銀杏內酯B和槲皮素的方法的制備流程不意圖。
【具體實施方式】
[0019]下面結合具體實施例對本發明進一步進行描述。
[0020]實施例1
如圖1所示，一種利用銀耳同時制備銀杏內酯B和槲皮素的方法具體包括如下步驟:
(1)試管擴大培養:將銀耳(Tremellafuciformis Berk.G頂5.39，購自北京北納創聯生物技術研究院，下同)試管中斜面菌種切成3 X 3 mm小塊菌種，接種一小塊到試管斜面培養基中，20°C培養15天，制得試管斜面菌種，該試管斜面4 °C保存備用；
(2)液體搖瓶培養:將步驟(I)所制得的試管斜面菌種切成3X3mm小塊菌種，挑取10塊接種于裝有150mL液體搖瓶培養基的250mL三角瓶中，三角瓶在轉速為50轉/分，溫度35°C的條件下，搖床培養18h，制成液體搖瓶菌種;所述液體搖瓶培養基是在130°C條件下滅菌360min制得，且每升液體搖瓶培養基中含有麩皮5g，大米20g的原料；
(3)種子罐擴大培養:將步驟(2)所制得的液體搖瓶菌種接種于種子罐擴大培養基中，且所述液體搖瓶菌種與種子罐擴大培養基按體積比為1%的接種量接種，在溫度為35°C，攪拌轉速為160轉/分，在每分鐘通入氣體的體積與種子罐擴大培養基體積比為0.2:1的通氣量條件下，培養96h，制成銀耳種子罐菌種;所述種子罐擴大培養基是在130°C條件下滅菌360 min制得，且每升液體搖瓶培養基中含有麩皮5g，大米20g的原料；
(4)固體前發酵培養:將步驟(3)所制得的銀耳種子罐菌種接入裝有固體前發酵培養基的培養袋中，且所述銀耳種子罐菌種與裝有固體前發酵培養基的培養袋按體積比為10%的接種量接種，在溫度20°C，濕度80%前發酵40天，其中每隔6天，翻袋一次，制得固體前發酵物;所述固體前發酵培養基是在130°C條件下滅菌360 min制得，且每一千克固體前發酵培養基中含有去皮白果200g、銀杏葉提取物50g和大米750g的原料;所述固體前發酵培養基中的原料按1: 0.6的比例與水混合；
(5)液體后發酵培養:將步驟(4)所制得的固體前發酵物粉碎至20目，加入到液體發酵罐培養基中，所述液體發酵罐培養基體積與固體前發酵物的重量比為10，在溫度為20°C，攪拌轉速為50轉/分，在每分鐘通入氣體的體積與液體發酵罐培養基體積比為0.2:1的通氣量條件下發酵72h，所制得的發酵液體在2000轉/分鐘條件下離心制得含有銀杏內酯B的發酵液和含有槲皮素的菌絲體;所述液體發酵培養基是在130°C條件下滅菌60 min制得，且每升液體發酵培養基含有5g葡萄糖，4g蛋白胨和0.0lgK2HPO4 ；
(6)提取分離:將步驟(5)所制得的含有槲皮素的銀耳菌絲體和含有銀杏內酯B的發酵液分別經過提取，得到槲皮素和銀杏內酯B晶體。
[0021]值得注意的是，步驟(6)中所述從含有槲皮素的銀耳菌絲體中制取槲皮素晶體的方法包括如下步驟:
Al將所制得的銀耳菌絲體烘干，然后粉碎至20目，加入菌絲體重量的20倍體積的100%的乙醇，反復提取3次，得提取液一；
A2將步驟Al所制得的提取液一合并，然后減壓濃縮至原體積的1/30，加入剩余體積5倍的水，于4°C條件下結晶3小時，然后抽濾干燥，即得到槲皮素晶體，槲皮素含量為95%。
[0022]在本實施例中，步驟(6)中所述從含有銀杏內酯B的發酵液中制取銀杏內酯B晶體的方法包括如下步驟:
BI將所制得的銀杏內酯B的發酵液減壓濃縮并干燥得產物；
B2向步驟BI所得產物中加入重量的20倍的60%乙醇回流提取5次，得提取液二；
B3將步驟B2所制得的提取液二合并，然后減壓濃縮至原體積的1/40，于-20°C條件下結晶18小時；
B4將步驟B3結晶后的產物進行抽濾，抽濾所得濾渣用乙酸乙酯復溶，然后將乙酸乙酯相減壓濃縮至干，再用無水乙醇復溶，并加入3倍體積的水，沉淀，抽濾，所得濾渣烘干即為銀杏內酯B，其含量為90%。
[0023]所述的槲皮素含量的測定采用高效液相色譜法(齊寧利等:高效液相色譜-二極管陣列檢測同時測定苦蕎中蘆丁和槲皮素的含量.食品科技，2013，38(10):301-304):采用Intersil ODS-SP C 18柱(150 mmX4.6 !11111，54111)，流動相為甲醇-0.5%磷酸溶液(用磷酸二氫鉀調節P H至4.5)(40:60)，流速:1.0 m L/min，柱溫:35 °C，進樣量:10 yL，檢測波長255 nm，以槲皮素標準品作為對照，根據不同濃度的槲皮素與對應峰面積，進行回歸得到槲皮素濃度與峰面關系方程，再根據樣品中槲皮素峰面積和稀釋倍數和回歸方程計算樣品中槲皮素含量。
[0024]所述的銀杏內酯B含量的測定采用高效液相色譜-質譜:配有高壓二元栗，沃特斯996二極管陣列檢測器和Agilent 1200系列自動進樣器，色譜柱BEH (:_18柱(2.5 μπι，3.0Χ100 mm)的高效液相色譜(HPLC)用于分析銀杏內酯。用甲醇和水(7:3)作為流動相，流速為
0.2 mL/ min進行洗脫。安捷倫三級四極桿質譜6400離子阱質譜儀作為檢測器，在全掃描負離子電噴霧電離(ESI)(M/Z500-800)的模式運行。離子阱質譜儀，最條件高感光度為:ESI，負極性電離;噴霧電壓:4.0千伏;加熱毛細管溫度:275 °C;鞘氣(N2氣)流速:30 Arb;輔助/吹掃氣(N2氣);流速:50 Arb。以銀杏內酯B標準品作為對照，根據不同濃度的銀杏內酯B與對應峰面積，進行回歸得到銀杏內酯B濃度與峰面關系方程，再根據樣品中銀杏內酯B峰面積和稀釋倍數和回歸方程計算樣品中銀杏內酯B含量。
[0025]基于上述，本發明本發明在吸取中藥發酵制藥技術的基礎上，結合現代固態發酵和液態發酵各自的優點，采用固態前發酵轉化銀杏活性成分黃酮和銀杏內酯，克服了液態發酵過程中基質(銀杏葉的活性成分)對銀耳菌絲生長的抑制作用，同時利用深層發酵技術，銀耳將銀杏內酯B分泌到細胞外而將黃酮轉化成槲皮素積累在細胞內，將銀杏內酯B和槲皮素分離;并且本發明不是單純的利用分離提純方法獲得大量的銀杏內酯B和槲皮素，而是以去皮白果和大米為固體基質添加銀杏葉提取物，以銀耳為菌種通過固體前發酵，轉化銀杏內酯和銀杏黃酮，通過后發酵，使槲皮素和銀杏內酯B得以分離，可實現工業化大規模生產，并可以同時生產銀杏內酯B和槲皮素;具有工藝簡單的優點，且所得到的產品中，銀杏內酯B純度大于90%，槲皮素純度大于95%，制取的純度較高。
[0026]實施例2
一種利用銀耳同時制備銀杏內酯B和槲皮素的方法具體包括如下步驟:
(1)試管擴大培養:將銀耳試管中斜面菌種切成3X 3 mm小塊菌種，接種一小塊到試管斜面培養基中，35°C培養4天，制得試管斜面菌種，該試管斜面4°C保存備用；
(2)液體搖瓶培養:將步驟(I)所制得的試管斜面菌種切成3X3mm小塊菌種，挑取3塊接種于裝有20mL液體搖瓶培養基的250mL三角瓶中，三角瓶在轉速為200轉/分，溫度20°C的條件下，搖床培養86h，制成液體搖瓶菌種;所述液體搖瓶培養基是在100°C條件下滅菌90min制得，且每升液體搖瓶培養基中含有麩20g，大米5g的原料；
(3)種子罐擴大培養:將步驟(2)所制得的液體搖瓶菌種接種于種子罐擴大培養基中，且所述液體搖瓶菌種與種子罐擴大培養基按體積比為20%的接種量接種，在溫度為20 0C，攪拌轉速為50轉/分，在每分鐘通入氣體的體積與種子罐擴大培養基體積比為0.2?1.8:1的通氣量條件下，培養18h，制成銀耳種子罐菌種;所述種子罐擴大培養基是在100°C條件下滅菌90min制得，且每升液體搖瓶培養基中含有麩皮20g，大米5g的原料；
(4)固體前發酵培養:將步驟(3)所制得的銀耳種子罐菌種接入裝有固體前發酵培養基的培養袋中，且所述銀耳種子罐菌種與裝有固體前發酵培養基的培養袋按體積比為2%的接種量接種，在溫度35°C，濕度80%前發酵20天，其中每隔3天，翻袋一次，制得固體前發酵物；所述固體前發酵培養基是在100°C條件下滅菌90min制得，且每一千克固體前發酵培養基中含有去皮白果400g、銀杏葉提取物30g和大米570g的原料;所述固體前發酵培養基中的原料按1:1.5的比例與水混合；
(5)液體后發酵培養:將步驟(4)所制得的固體前發酵物粉碎至20目，加入到液體發酵罐培養基中，所述液體發酵罐培養基體積與固體前發酵物的重量比為5，在溫度為35°C，攪拌轉速為160轉/分，在每分鐘通入氣體的體積與液體發酵罐培養基體積比為1.8:1的通氣量條件下發酵24h，所制得的發酵液體在6000轉/分鐘條件下離心制得含有銀杏內酯B的發酵液和含有槲皮素的菌絲體;所述液體發酵培養基是在100°C條件下滅菌30min制得，且每升液體發酵培養基含有40g葡萄糖，0.5g蛋白胨和0.0lgK2HPO4 ；
(6)提取分離:將步驟(5)所制得的含有槲皮素的銀耳菌絲體和含有銀杏內酯B的發酵液分別經過提取，得到槲皮素和銀杏內酯B晶體。
[0027]值得注意的是，步驟(6)中所述從含有槲皮素的銀耳菌絲體中制取槲皮素晶體的方法包括如下步驟:
Al將所制得的銀耳菌絲體烘干，然后粉碎至20目，加入菌絲體重量的5倍體積的60%的乙醇，反復提取5次，得提取液一；
A2將步驟Al所制得的提取液一合并，然后減壓濃縮至原體積的1/30，加入剩余體積5倍的水，于4°C條件下結晶18小時，然后抽濾干燥，即得到槲皮素晶體，槲皮素含量為99.9%。
[0028]在本實施例中，步驟(6)中所述從含有銀杏內酯B的發酵液中制取銀杏內酯B晶體的方法包括如下步驟:
BI將所制得的銀杏內酯B的發酵液減壓濃縮并干燥得產物；
B2向步驟BI所得產物中加入重量的5倍的60?100%乙醇回流提取3次，得提取液二；
B3將步驟B2所制得的提取液二合并，然后減壓濃縮至原體積的1/40，于-20°C條件下結晶3小時；
B4將步驟B3結晶后的產物進行抽濾，抽濾所得濾渣用乙酸乙酯復溶，然后將乙酸乙酯相減壓濃縮至干，再用無水乙醇復溶，并加入10倍體積的水，沉淀，抽濾，所得濾渣烘干即為銀杏內酯B，其含量為99.8%。
[0029]實施例3
一種利用銀耳同時制備銀杏內酯B和槲皮素的方法具體包括如下步驟:
(1)試管擴大培養:將銀耳試管中斜面菌種切成3X 3 mm小塊菌種，接種一小塊到試管斜面培養基中，28°C培養10天，制得試管斜面菌種，該試管斜面4 °C保存備用；
(2)液體搖瓶培養:將步驟(I)所制得的試管斜面菌種切成3X3mm小塊菌種，挑取7塊接種于裝有80mL液體搖瓶培養基的250mL三角瓶中，三角瓶在轉速為120轉/分，溫度28°C的條件下，搖床培養57h，制成液體搖瓶菌種;所述液體搖瓶培養基是在120 °C條件下滅菌260min制得，且每升液體搖瓶培養基中含有麩皮13g，大米13g的原料；
(3)種子罐擴大培養:將步驟(2)所制得的液體搖瓶菌種接種于種子罐擴大培養基中，且所述液體搖瓶菌種與種子罐擴大培養基按體積比為10%的接種量接種，在溫度為28 0C，攪拌轉速為110轉/分，在每分鐘通入氣體的體積與種子罐擴大培養基體積比為1:1的通氣量條件下，培養57h，制成銀耳種子罐菌種;所述種子罐擴大培養基是在120°C條件下滅菌260min制得，且每升液體搖瓶培養基中含有麩皮13g，大米13g的原料；
(4)固體前發酵培養:將步驟(3)所制得的銀耳種子罐菌種接入裝有固體前發酵培養基的培養袋中，且所述銀耳種子罐菌種與裝有固體前發酵培養基的培養袋按體積比為6%的接種量接種，在溫度28°C，濕度80%前發酵30天，其中每隔4.5天，翻袋一次，制得固體前發酵物;所述固體前發酵培養基是在120°C條件下滅菌260 min制得，且每一千克固體前發酵培養基中含有去皮白果300g、銀杏葉提取物40g和大米660g的原料;所述固體前發酵培養基中的原料按1:1的比例與水混合；
(5)液體后發酵培養:將步驟(4)所制得的固體前發酵物粉碎至20目，加入到液體發酵罐培養基中，所述液體發酵罐培養基體積與固體前發酵物的重量比為8，在溫度為27°C，攪拌轉速為110轉/分，在每分鐘通入氣體的體積與液體發酵罐培養基體積比為0.2-1.8的通氣量條件下發酵48h，所制得的發酵液體在4000轉/分鐘條件下離心制得含有銀杏內酯B的發酵液和含有槲皮素的菌絲體;所述液體發酵培養基是在120°C條件下滅菌45 min制得，且每升液體發酵培養基含有23g葡萄糖，2.2g蛋白胨和0.05gK2HP04 ；
(6)提取分離:將步驟(5)所制得的含有槲皮素的銀耳菌絲體和含有銀杏內酯B的發酵液分別經過提取，得到槲皮素和銀杏內酯B晶體。
[0030]值得注意的是，步驟(6)中所述從含有槲皮素的銀耳菌絲體中制取槲皮素晶體的方法包括如下步驟:
Al將所制得的銀耳菌絲體烘干，然后粉碎至20目，加入菌絲體重量的13倍體積的80%的乙醇，反復提取4次，得提取液一； A2將步驟Al所制得的提取液一合并，然后減壓濃縮至原體積的1/30，加入剩余體積5倍的水，于4°C條件下結晶11小時，然后抽濾干燥，即得到槲皮素晶體，槲皮素含量為98%。
[0031]在本實施例中，步驟(6)中所述從含有銀杏內酯B的發酵液中制取銀杏內酯B晶體的方法包括如下步驟:
BI將所制得的銀杏內酯B的發酵液減壓濃縮并干燥得產物；
B2向步驟BI所得產物中加入重量的13倍的80%乙醇回流提取4次，得提取液二 ；
B3將步驟B2所制得的提取液二合并，然后減壓濃縮至原體積的1/40，于-20°C條件下結晶11小時；
B4將步驟B3結晶后的產物進行抽濾，抽濾所得濾渣用乙酸乙酯復溶，然后將乙酸乙酯相減壓濃縮至干，再用無水乙醇復溶，并加入7倍體積的水，沉淀，抽濾，所得濾渣烘干即為銀杏內酯B，其含量為95%。
[0032]實施例4
一種利用銀耳同時制備銀杏內酯B和槲皮素的方法具體包括如下步驟:
(1)試管擴大培養:將銀耳試管中斜面菌種切成3X 3 mm小塊菌種，接種一小塊到試管斜面培養基中，23°C培養12天，制得試管斜面菌種，該試管斜面4°C保存備用；
(2)液體搖瓶培養:將步驟(I)所制得的試管斜面菌種切成3X3mm小塊菌種，挑取8塊接種于裝有30mL液體搖瓶培養基的250mL三角瓶中，三角瓶在轉速為75轉/分，溫度20?350C的條件下，搖床培養30h，制成液體搖瓶菌種;所述液體搖瓶培養基是在100 °C條件下滅菌100 min制得，且每升液體搖瓶培養基中含有麩皮8g，大米12g的原料；
(3)種子罐擴大培養:將步驟(2)所制得的液體搖瓶菌種接種于種子罐擴大培養基中，且所述液體搖瓶菌種與種子罐擴大培養基按體積比為4%的接種量接種，在溫度為25°C，攪拌轉速為120轉/分，在每分鐘通入氣體的體積與種子罐擴大培養基體積比為0.6:1的通氣量條件下，培養35h，制成銀耳種子罐菌種;所述種子罐擴大培養基是在100°C條件下滅菌100 min制得，且每升液體搖瓶培養基中含有麩皮8g，大米15g的原料；
(4)固體前發酵培養:將步驟(3)所制得的銀耳種子罐菌種接入裝有固體前發酵培養基的培養袋中，且所述銀耳種子罐菌種與裝有固體前發酵培養基的培養袋按體積比為4%的接種量接種，在溫度22°C，濕度80%前發酵25天，其中每隔3天，翻袋一次，制得固體前發酵物；所述固體前發酵培養基是在100°C條件下滅菌100 min制得，且每一千克固體前發酵培養基中含有去皮白果250g、銀杏葉提取物35g和大米715g的原料;所述固體前發酵培養基中的原料按1: 0.6的比例與水混合；
(5)液體后發酵培養:將步驟(4)所制得的固體前發酵物粉碎至20目，加入到液體發酵罐培養基中，所述液體發酵罐培養基體積與固體前發酵物的重量比為6，在溫度為24°C，攪拌轉速為65轉/分，在每分鐘通入氣體的體積與液體發酵罐培養基體積比為1.5:1的通氣量條件下發酵60h，所制得的發酵液體在5000轉/分鐘條件下離心制得含有銀杏內酯B的發酵液和含有槲皮素的菌絲體;所述液體發酵培養基是在115°C條件下滅菌50 min制得，且每升液體發酵培養基含有30g葡萄糖，3g蛋白胨和0.09gK2HP04 ；
(6)提取分離:將步驟(5)所制得的含有槲皮素的銀耳菌絲體和含有銀杏內酯B的發酵液分別經過提取，得到槲皮素和銀杏內酯B晶體。
[0033]值得注意的是，步驟(6)中所述從含有槲皮素的銀耳菌絲體中制取槲皮素晶體的方法包括如下步驟:
Al將所制得的銀耳菌絲體烘干，然后粉碎至20目，加入菌絲體重量的18倍體積的95%的乙醇，反復提取3次，得提取液一；
A2將步驟Al所制得的提取液一合并，然后減壓濃縮至原體積的1/30，加入剩余體積5倍的水，于4°C條件下結晶4小時，然后抽濾干燥，即得到槲皮素晶體，槲皮素純度大于95%。
[0034]在本實施例中，步驟(6)中所述從含有銀杏內酯B的發酵液中制取銀杏內酯B晶體的方法包括如下步驟:
BI將所制得的銀杏內酯B的發酵液減壓濃縮并干燥得產物；
B2向步驟BI所得產物中加入重量的18倍的95%乙醇回流提取4次，得提取液二 ；
B3將步驟B2所制得的提取液二合并，然后減壓濃縮至原體積的1/40，于-20°C條件下結晶17小時；
B4將步驟B3結晶后的產物進行抽濾，抽濾所得濾渣用乙酸乙酯復溶，然后將乙酸乙酯相減壓濃縮至干，再用無水乙醇復溶，并加入9倍體積的水，沉淀，抽濾，所得濾渣烘干即為銀杏內酯B，其含量為92%。
[0035]實施例5
一種利用銀耳同時制備銀杏內酯B和槲皮素的方法具體包括如下步驟:
(1)試管擴大培養:將銀耳試管中斜面菌種切成3X 3 mm小塊菌種，接種一小塊到試管斜面培養基中，32°C培養6天，制得試管斜面菌種，該試管斜面4°C保存備用；
(2)液體搖瓶培養:將步驟(I)所制得的試管斜面菌種切成3X3mm小塊菌種，挑取4塊接種于裝有40mL液體搖瓶培養基的250mL三角瓶中，三角瓶在轉速為160轉/分，溫度30°C的條件下，搖床培養36h，制成液體搖瓶菌種;所述液體搖瓶培養基是在128 °C條件下滅菌320min制得，且每升液體搖瓶培養基中含有麩皮6g，大米20g的原料；
(3)種子罐擴大培養:將步驟(2)所制得的液體搖瓶菌種接種于種子罐擴大培養基中，且所述液體搖瓶菌種與種子罐擴大培養基按體積比為15%的接種量接種，在溫度為30 0C，攪拌轉速為160轉/分，在每分鐘通入氣體的體積與種子罐擴大培養基體積比為0.6:1的通氣量條件下，培養68h，制成銀耳種子罐菌種;所述種子罐擴大培養基是在128°C條件下滅菌320 min制得，且每升液體搖瓶培養基中含有麩皮15g，大米7g的原料；
(4)固體前發酵培養:將步驟(3)所制得的銀耳種子罐菌種接入裝有固體前發酵培養基的培養袋中，且所述銀耳種子罐菌種與裝有固體前發酵培養基的培養袋按體積比為6%的接種量接種，在溫度30°C，濕度80%前發酵28天，其中每隔5天，翻袋一次，制得固體前發酵物；所述固體前發酵培養基是在128°C條件下滅菌320 min制得，且每一千克固體前發酵培養基中含有去皮白果350g、銀杏葉提取物50g和大米600g的原料;所述固體前發酵培養基中的原料按1: 1.2的比例與水混合；
(5)液體后發酵培養:將步驟(4)所制得的固體前發酵物粉碎至20目，加入到液體發酵罐培養基中，所述液體發酵罐培養基體積與固體前發酵物的重量比為7，在溫度為30°C，攪拌轉速為120轉/分，在每分鐘通入氣體的體積與液體發酵罐培養基體積比為1.6:1的通氣量條件下發酵58h，所制得的發酵液體在3000轉/分鐘條件下離心制得含有銀杏內酯B的發酵液和含有槲皮素的菌絲體;所述液體發酵培養基是在128°C條件下滅菌60 min制得，且每升液體發酵培養基含有35g葡萄糖，0.5g蛋白胨和0.04gK2HP04 ； (6)提取分離:將步驟(5)所制得的含有槲皮素的銀耳菌絲體和含有銀杏內酯B的發酵液分別經過提取，得到槲皮素和銀杏內酯B晶體。
[0036]值得注意的是，步驟(6)中所述從含有槲皮素的銀耳菌絲體中制取槲皮素晶體的方法包括如下步驟:
Al將所制得的銀耳菌絲體烘干，然后粉碎至20目，加入菌絲體重量的18倍體積的90%的乙醇，反復提取4次，得提取液一；
A2將步驟Al所制得的提取液一合并，然后減壓濃縮至原體積的1/30，加入剩余體積5倍的水，于4°C條件下結晶12小時，然后抽濾干燥，即得到槲皮素晶體，槲皮素含量為96%。
[0037]在本實施例中，步驟(6)中所述從含有銀杏內酯B的發酵液中制取銀杏內酯B晶體的方法包括如下步驟:
BI將所制得的銀杏內酯B的發酵液減壓濃縮并干燥得產物；
B2向步驟BI所得產物中加入重量的8倍的70%乙醇回流提取5次，得提取液二 ；
B3將步驟B2所制得的提取液二合并，然后減壓濃縮至原體積的1/40，于-20°C條件下結晶6小時；
B4將步驟B3結晶后的產物進行抽濾，抽濾所得濾渣用乙酸乙酯復溶，然后將乙酸乙酯相減壓濃縮至干，再用無水乙醇復溶，并加入4倍體積的水，沉淀，抽濾，所得濾渣烘干即為銀杏內酯B，其含量為92%。
[0038]實施例6
一種利用銀耳同時制備銀杏內酯B和槲皮素的方法具體包括如下步驟:
(1)試管擴大培養:將銀耳試管中斜面菌種切成3X 3 mm小塊菌種，接種一小塊到試管斜面培養基中，32°C培養5天，制得試管斜面菌種，該試管斜面4°C保存備用；
(2)液體搖瓶培養:將步驟(I)所制得的試管斜面菌種切成3X3mm小塊菌種，挑取4塊接種于裝有20mL液體搖瓶培養基的250mL三角瓶中，三角瓶在轉速為170轉/分，溫度25°C的條件下，搖床培養60h，制成液體搖瓶菌種;所述液體搖瓶培養基是在110°C條件下滅菌250min制得，且每升液體搖瓶培養基中含有麩皮16g，大米8g的原料；
(3)種子罐擴大培養:將步驟(2)所制得的液體搖瓶菌種接種于種子罐擴大培養基中，且所述液體搖瓶菌種與種子罐擴大培養基按體積比為15%的接種量接種，在溫度為25 0C，攪拌轉速為120轉/分，在每分鐘通入氣體的體積與種子罐擴大培養基體積比為1.6:1的通氣量條件下，培養29h，制成銀耳種子罐菌種;所述種子罐擴大培養基是在110°C條件下滅菌250 min制得，且每升液體搖瓶培養基中含有麩皮14g，大米1g的原料；
(4)固體前發酵培養:將步驟(3)所制得的銀耳種子罐菌種接入裝有固體前發酵培養基的培養袋中，且所述銀耳種子罐菌種與裝有固體前發酵培養基的培養袋按體積比為6%的接種量接種，在溫度25°C，濕度80%前發酵26天，其中每隔5天，翻袋一次，制得固體前發酵物；所述固體前發酵培養基是在110Γ條件下滅菌250 min制得，且每一千克固體前發酵培養基中含有去皮白果276g、銀杏葉提取物33g和大米691g的原料;所述固體前發酵培養基中的原料按1: 0.9的比例與水混合；
(5)液體后發酵培養:將步驟(4)所制得的固體前發酵物粉碎至20目，加入到液體發酵罐培養基中，所述液體發酵罐培養基體積與固體前發酵物的重量比為9，在溫度為25°C，攪拌轉速為110轉/分，在每分鐘通入氣體的體積與液體發酵罐培養基體積比為1.4:1的通氣量條件下發酵48h，所制得的發酵液體在3500轉/分鐘條件下離心制得含有銀杏內酯B的發酵液和含有槲皮素的菌絲體;所述液體發酵培養基是在IlOtC條件下滅菌35 min制得，且每升液體發酵培養基含有34g葡萄糖，4g蛋白胨和0.03gK2HP04 ；
(6)提取分離:將步驟(5)所制得的含有槲皮素的銀耳菌絲體和含有銀杏內酯B的發酵液分別經過提取，得到槲皮素和銀杏內酯B晶體。
[0039]值得注意的是，步驟(6)中所述從含有槲皮素的銀耳菌絲體中制取槲皮素晶體的方法包括如下步驟:
Al將所制得的銀耳菌絲體烘干，然后粉碎至20目，加入菌絲體重量的16倍體積的70%的乙醇，反復提取5次，得提取液一；
A2將步驟Al所制得的提取液一合并，然后減壓濃縮至原體積的1/30，加入剩余體積5倍的水，于4°C條件下結晶12小時，然后抽濾干燥，即得到槲皮素晶體，槲皮素含量為98%。
[0040]在本實施例中，步驟(6)中所述從含有銀杏內酯B的發酵液中制取銀杏內酯B晶體的方法包括如下步驟:
BI將所制得的銀杏內酯B的發酵液減壓濃縮并干燥得產物；
B2向步驟BI所得產物中加入重量的1倍的70%乙醇回流提取4次，得提取液二 ；
B3將步驟B2所制得的提取液二合并，然后減壓濃縮至原體積的1/40，于-20°C條件下結晶8小時；
B4將步驟B3結晶后的產物進行抽濾，抽濾所得濾渣用乙酸乙酯復溶，然后將乙酸乙酯相減壓濃縮至干，再用無水乙醇復溶，并加入7倍體積的水，沉淀，抽濾，所得濾渣烘干即為銀杏內酯B，其含量為94%。
[0041 ] 實施例7
一種利用銀耳同時制備銀杏內酯B和槲皮素的方法具體包括如下步驟:
(1)試管擴大培養:將銀耳試管中斜面菌種切成3X 3 mm小塊菌種，接種一小塊到試管斜面培養基中，23°C培養13天，制得試管斜面菌種，該試管斜面4°C保存備用；
(2)液體搖瓶培養:將步驟(I)所制得的試管斜面菌種切成3X3mm小塊菌種，挑取10塊接種于裝有130mL液體搖瓶培養基的250mL三角瓶中，三角瓶在轉速為150轉/分，溫度23°C的條件下，搖床培養36h，制成液體搖瓶菌種;所述液體搖瓶培養基是在115 °C條件下滅菌260 min制得，且每升液體搖瓶培養基中含有麩皮9g，大米20g的原料；
(3)種子罐擴大培養:將步驟(2)所制得的液體搖瓶菌種接種于種子罐擴大培養基中，且所述液體搖瓶菌種與種子罐擴大培養基按體積比為15%的接種量接種，在溫度為210C，攪拌轉速為120轉/分，在每分鐘通入氣體的體積與種子罐擴大培養基體積比為0.2:1的通氣量條件下，培養81h，制成銀耳種子罐菌種;所述種子罐擴大培養基是在115°C條件下滅菌260 min制得，且每升液體搖瓶培養基中含有麩皮19g，大米18g的原料；
(4)固體前發酵培養:將步驟(3)所制得的銀耳種子罐菌種接入裝有固體前發酵培養基的培養袋中，且所述銀耳種子罐菌種與裝有固體前發酵培養基的培養袋按體積比為4%的接種量接種，在溫度21°C，濕度80%前發酵34天，其中每隔6天，翻袋一次，制得固體前發酵物；所述固體前發酵培養基是在110Γ條件下滅菌250 min制得，且每一千克固體前發酵培養基中含有去皮白果370g、銀杏葉提取物40g和大米590g的原料;所述固體前發酵培養基中的原料按1: 0.7的比例與水混合； (5)液體后發酵培養:將步驟(4)所制得的固體前發酵物粉碎至20目，加入到液體發酵罐培養基中，所述液體發酵罐培養基體積與固體前發酵物的重量比為10，在溫度為21°C，攪拌轉速為60轉/分，在每分鐘通入氣體的體積與液體發酵罐培養基體積比為1.4:1的通氣量條件下發酵66h，所制得的發酵液體在5700轉/分鐘條件下離心制得含有銀杏內酯B的發酵液和含有槲皮素的菌絲體;所述液體發酵培養基是在110°C條件下滅菌35 min制得，且每升液體發酵培養基含有35g葡萄糖，5g蛋白胨和0.05gK2HP04 ；
(6)提取分離:將步驟(5)所制得的含有槲皮素的銀耳菌絲體和含有銀杏內酯B的發酵液分別經過提取，得到槲皮素和銀杏內酯B晶體。
[0042]值得注意的是，步驟(6)中所述從含有槲皮素的銀耳菌絲體中制取槲皮素晶體的方法包括如下步驟:
Al將所制得的銀耳菌絲體烘干，然后粉碎至20目，加入菌絲體重量的17倍體積的90%的乙醇，反復提取4次，得提取液一；
A2將步驟Al所制得的提取液一合并，然后減壓濃縮至原體積的1/30，加入剩余體積5倍的水，于4°C條件下結晶18小時，然后抽濾干燥，即得到槲皮素晶體，槲皮素含量為99.5%。
[0043]在本實施例中，步驟(6)中所述從含有銀杏內酯B的發酵液中制取銀杏內酯B晶體的方法包括如下步驟:
BI將所制得的銀杏內酯B的發酵液減壓濃縮并干燥得產物；
B2向步驟BI所得產物中加入重量的8倍的65%乙醇回流提取5次，得提取液二 ；
B3將步驟B2所制得的提取液二合并，然后減壓濃縮至原體積的1/40，于-20°C條件下結晶6小時；
B4將步驟B3結晶后的產物進行抽濾，抽濾所得濾渣用乙酸乙酯復溶，然后將乙酸乙酯相減壓濃縮至干，再用無水乙醇復溶，并加入5倍體積的水，沉淀，抽濾，所得濾渣烘干即為銀杏內酯B，其含量為99%。
[0044]實施例8
一種利用銀耳同時制備銀杏內酯B和槲皮素的方法具體包括如下步驟:
(1)試管擴大培養:將銀耳試管中斜面菌種切成3X 3 mm小塊菌種，接種一小塊到試管斜面培養基中，29°C培養10天，制得試管斜面菌種，該試管斜面4 °C保存備用；
(2)液體搖瓶培養:將步驟(I)所制得的試管斜面菌種切成3X3mm小塊菌種，挑取8塊接種于裝有60mL液體搖瓶培養基的250mL三角瓶中，三角瓶在轉速為160轉/分，溫度33°C的條件下，搖床培養SOh，制成液體搖瓶菌種;所述液體搖瓶培養基是在120 °C條件下滅菌300min制得，且每升液體搖瓶培養基中含有麩皮19g，大米19g的原料；
(3)種子罐擴大培養:將步驟(2)所制得的液體搖瓶菌種接種于種子罐擴大培養基中，且所述液體搖瓶菌種與種子罐擴大培養基按體積比為18%的接種量接種，在溫度為33 0C，攪拌轉速為140轉/分，在每分鐘通入氣體的體積與種子罐擴大培養基體積比為1.8:1的通氣量條件下，培養90h，制成銀耳種子罐菌種;所述種子罐擴大培養基是在120°C條件下滅菌300 min制得，且每升液體搖瓶培養基中含有麩皮18g，大米18g的原料；
(4)固體前發酵培養:將步驟(3)所制得的銀耳種子罐菌種接入裝有固體前發酵培養基的培養袋中，且所述銀耳種子罐菌種與裝有固體前發酵培養基的培養袋按體積比為9%的接種量接種，在溫度33°C，濕度80%前發酵37天，其中每隔6天，翻袋一次，制得固體前發酵物；所述固體前發酵培養基是在105°C條件下滅菌350 min制得，且每一千克固體前發酵培養基中含有去皮白果400g、銀杏葉提取物30g和大米570g的原料;所述固體前發酵培養基中的原料按1: 1.4的比例與水混合；
(5)液體后發酵培養:將步驟(4)所制得的固體前發酵物粉碎至20目，加入到液體發酵罐培養基中，所述液體發酵罐培養基體積與固體前發酵物的重量比為10，在溫度為33°C，攪拌轉速為150轉/分，在每分鐘通入氣體的體積與液體發酵罐培養基體積比為1.8:1的通氣量條件下發酵70h，所制得的發酵液體在5800轉/分鐘條件下離心制得含有銀杏內酯B的發酵液和含有槲皮素的菌絲體;所述液體發酵培養基是在105°C條件下滅菌35 min制得，且每升液體發酵培養基含有38g葡萄糖，4g蛋白胨和0.09g K2HPO4 ；
(6)提取分離:將步驟(5)所制得的含有槲皮素的銀耳菌絲體和含有銀杏內酯B的發酵液分別經過提取，得到槲皮素和銀杏內酯B晶體。
[0045]值得注意的是，步驟(6)中所述從含有槲皮素的銀耳菌絲體中制取槲皮素晶體的方法包括如下步驟:
Al將所制得的銀耳菌絲體烘干，然后粉碎至20目，加入菌絲體重量的19倍體積的100%的乙醇，反復提取5次，得提取液一；
A2將步驟Al所制得的提取液一合并，然后減壓濃縮至原體積的1/30，加入剩余體積5倍的水，于4°C條件下結晶16小時，然后抽濾干燥，即得到槲皮素晶體，槲皮素含量為99%。
[0046]在本實施例中，步驟(6)中所述從含有銀杏內酯B的發酵液中制取銀杏內酯B晶體的方法包括如下步驟:
BI將所制得的銀杏內酯B的發酵液減壓濃縮并干燥得產物；
B2向步驟BI所得產物中加入重量的18倍的98%乙醇回流提取5次，得提取液二 ；
B3將步驟B2所制得的提取液二合并，然后減壓濃縮至原體積的1/40，于-20°C條件下結晶17小時；
B4將步驟B3結晶后的產物進行抽濾，抽濾所得濾渣用乙酸乙酯復溶，然后將乙酸乙酯相減壓濃縮至干，再用無水乙醇復溶，并加入10倍體積的水，沉淀，抽濾，所得濾渣烘干即為銀杏內酯B，其含量為98%。
[0047]實施例9
一種利用銀耳同時制備銀杏內酯B和槲皮素的方法具體包括如下步驟:
(1)試管擴大培養:將銀耳試管中斜面菌種切成3X 3 mm小塊菌種，接種一小塊到試管斜面培養基中，24°C培養6天，制得試管斜面菌種，該試管斜面4°C保存備用；
(2)液體搖瓶培養:將步驟(I)所制得的試管斜面菌種切成3X3mm小塊菌種，挑取4塊接種于裝有24mL液體搖瓶培養基的250mL三角瓶中，三角瓶在轉速為58轉/分，溫度24°C的條件下，搖床培養20h，制成液體搖瓶菌種;所述液體搖瓶培養基是在100°C條件下滅菌100min制得，且每升液體搖瓶培養基中含有麩皮5g，大米5g的原料；
(3)種子罐擴大培養:將步驟(2)所制得的液體搖瓶菌種接種于種子罐擴大培養基中，且所述液體搖瓶菌種與種子罐擴大培養基按體積比為3%的接種量接種，在溫度為24°C，攪拌轉速為58轉/分，在每分鐘通入氣體的體積與種子罐擴大培養基體積比為1.8:1的通氣量條件下，培養25h，制成銀耳種子罐菌種;所述種子罐擴大培養基是在100°C條件下滅菌100min制得，且每升液體搖瓶培養基中含有麩皮5g，大米6g的原料； (4)固體前發酵培養:將步驟(3)所制得的銀耳種子罐菌種接入裝有固體前發酵培養基的培養袋中，且所述銀耳種子罐菌種與裝有固體前發酵培養基的培養袋按體積比為3%的接種量接種，在溫度24°C，濕度80%前發酵23天，其中每隔3天，翻袋一次，制得固體前發酵物；所述固體前發酵培養基是在100°C條件下滅菌150 min制得，且每一千克固體前發酵培養基中含有去皮白果220g、銀杏葉提取物33g和大米747g的原料;所述固體前發酵培養基中的原料按1: 0.8的比例與水混合；
(5)液體后發酵培養:將步驟(4)所制得的固體前發酵物粉碎至20目，加入到液體發酵罐培養基中，所述液體發酵罐培養基體積與固體前發酵物的重量比為6，在溫度為24°C，攪拌轉速為55轉/分，在每分鐘通入氣體的體積與液體發酵罐培養基體積比為1.8:1的通氣量條件下發酵26h，所制得的發酵液體在2300轉/分鐘條件下離心制得含有銀杏內酯B的發酵液和含有槲皮素的菌絲體;所述液體發酵培養基是在100°C條件下滅菌35 min制得，且每升液體發酵培養基含有6g葡萄糖，0.6g蛋白胨和0.02gK2HP04 ；
(6)提取分離:將步驟(5)所制得的含有槲皮素的銀耳菌絲體和含有銀杏內酯B的發酵液分別經過提取，得到槲皮素和銀杏內酯B晶體。
[0048]值得注意的是，步驟(6)中所述從含有槲皮素的銀耳菌絲體中制取槲皮素晶體的方法包括如下步驟:
Al將所制得的銀耳菌絲體烘干，然后粉碎至20目，加入菌絲體重量的6倍體積的67%的乙醇，反復提取4次，得提取液一；
A2將步驟Al所制得的提取液一合并，然后減壓濃縮至原體積的1/30，加入剩余體積5倍的水，于4°C條件下結晶5小時，然后抽濾干燥，即得到槲皮素晶體，槲皮素含量為95%。
[0049]在本實施例中，步驟(6)中所述從含有銀杏內酯B的發酵液中制取銀杏內酯B晶體的方法包括如下步驟:
BI將所制得的銀杏內酯B的發酵液減壓濃縮并干燥得產物；
B2向步驟BI所得產物中加入重量的6倍的65%乙醇回流提取3次，得提取液二 ；
B3將步驟B2所制得的提取液二合并，然后減壓濃縮至原體積的1/40，于-20°C條件下結晶4小時；
B4將步驟B3結晶后的產物進行抽濾，抽濾所得濾渣用乙酸乙酯復溶，然后將乙酸乙酯相減壓濃縮至干，再用無水乙醇復溶，并加入4倍體積的水，沉淀，抽濾，所得濾渣烘干即為銀杏內酯B，其含量為91%。
[0050]以上示意性的對本發明及其實施方式進行了描述，該描述沒有限制性，實際的結構并不局限于此。所以，如果本領域的普通技術人員受其啟示，在不脫離本發明創造宗旨的情況下，不經創造性的設計出與該技術方案相似的結構方式及實施例，均應屬于本發明的保護范圍。
【主權項】
1.一種利用銀耳同時制備銀杏內酯B和槲皮素的方法，其特征在于，所述制備方法以大米、去皮白果和銀杏葉提取物為主要原料，以銀耳為出發菌株，依次經過試管擴大培養、液體搖瓶培養和種子罐擴大培養、固體前發酵培養、液體后發酵培養及提取分離步驟制得含有銀杏內酯B的發酵液和含有槲皮素的菌絲體;所述含有銀杏內酯B的發酵液和含有槲皮素的菌絲體再分別經過提取制得銀杏內酯B和槲皮素晶體，其中銀杏內酯B純度達到90%，槲皮素純度達到95%。2.根據權利要求1所述的一種利用銀耳同時制備銀杏內酯B和槲皮素的方法，其特征在于，所述制備方法包括如下步驟: Al試管擴大培養:將銀耳中斜面菌種接種于馬鈴薯葡萄糖培養基中進行培養，制得銀耳試管斜面菌種； A2液體搖瓶培養:將步驟Al所制得的銀耳試管斜面菌種接種到裝有液體搖瓶培養基的搖瓶中，進行培養，制得銀耳液體搖瓶菌種； A3種子罐擴大培養:將步驟A2所制得的銀耳液體搖瓶菌種接種到種子罐培養基中進行培養，制成銀耳種子罐菌種； A4固體前發酵培養:將步驟A3所制得的銀耳種子罐菌種接種到固體培養基中，并混合均勻，進行發酵培養，制得銀耳固體發酵物； A5液體后發酵培養:將步驟A4所制得的銀耳固體前發酵物轉移到液體發酵罐培養基中，進行液體后發酵，制得含有銀杏內酯B的發酵液和含有槲皮素的銀耳菌絲體； A6提取分離:將步驟A5所制得的含有槲皮素的銀耳菌絲體和含有銀杏內酯B的發酵液分別經過提取，得到槲皮素和銀杏內酯B晶體。3.根據權利要求2所述的一種利用銀耳同時制備銀杏內酯B和槲皮素的方法，其特征在于，所述制備方法具體如下: BI試管擴大培養:將銀耳試管中斜面菌種切成3X3 mm小塊菌種，接種一小塊到試管斜面培養基中，20?35°C培養4?15天，制得試管斜面菌種，該試管斜面4°C保存備用； B2液體搖瓶培養:將步驟BI所制得的試管斜面菌種切成3 X 3 mm小塊菌種，挑取3?10塊接種于裝有20?150mL液體搖瓶培養基的250mL三角瓶中，三角瓶在轉速為50?200轉/分，溫度20?35°C的條件下，搖床培養18-86h，制成液體搖瓶菌種； B3種子罐擴大培養:將步驟B2所制得的液體搖瓶菌種接種于種子罐擴大培養基中，且所述液體搖瓶菌種與種子罐擴大培養基按體積比為I?20%的接種量接種，在溫度為20?3 50C，攪拌轉速為50?160轉/分，在每分鐘通入氣體的體積與種子罐擴大培養基體積比為0.2?1.8:1的通氣量條件下，培養18?96h，制成銀耳種子罐菌種； B4固體前發酵培養:將步驟B3所制得的銀耳種子罐菌種接入裝有固體前發酵培養基的培養袋中，且所述銀耳種子罐菌種與裝有固體前發酵培養基的培養袋按體積比為2?10%的接種量接種，在溫度20?35°C，濕度80%前發酵20?40天，其中每隔3?6天，翻袋一次，制得固體前發酵物； B5液體后發酵培養:將步驟B4所制得的固體前發酵物粉碎至20目，加入到液體發酵罐培養基中，所述液體發酵罐培養基體積與固體前發酵物的重量比為5?10，在溫度為20?43°C，攪拌轉速為50?160轉/分，在每分鐘通入氣體的體積與液體發酵罐培養基體積比為0.2-1.8:1的通氣量條件下發酵24?72h，所制得的發酵液體在2000?6000轉/分鐘條件下離心制得含有銀杏內酯B的發酵液和含有槲皮素的菌絲體； B6提取分離:將步驟A5所制得的含有槲皮素的銀耳菌絲體和含有銀杏內酯B的發酵液分別經過提取，得到槲皮素和銀杏內酯B晶體。4.根據權利要求3所述的一種利用銀耳同時制備銀杏內酯B和槲皮素的方法，其特征在于，步驟B2中所述液體搖瓶培養基是在100?130°C條件下滅菌90?360 min制得，且每升液體搖瓶培養基中含有麩皮5?20g，大米5?20g的原料。5.根據權利要求3所述的一種利用銀耳同時制備銀杏內酯B和槲皮素的方法，其特征在于，步驟B3中所述種子罐擴大培養基是在100?130°C條件下滅菌90?360 min制得，且每升液體搖瓶培養基中含有麩皮5?20g，大米5?20g的原料。6.根據權利要求3所述的一種利用銀耳同時制備銀杏內酯B和槲皮素的方法，其特征在于，步驟B4中所述固體前發酵培養基是在100?130°C條件下滅菌90?360 min制得，且每一千克固體前發酵培養基中含有去皮白果200?400g、銀杏葉提取物30?50g和大米750?570g的原料。7.根據權利要求6所述的一種利用銀耳同時制備銀杏內酯B和槲皮素的方法，其特征在于，所述固體前發酵培養基中的原料按1:0.6?1.5的比例與水混合。8.根據權利要求3所述的一種利用銀耳同時制備銀杏內酯B和槲皮素的方法，其特征在于，步驟B5中所述液體發酵培養基是在100?130°C條件下滅菌30?60 min制得，且每升液體發酵培養基含有5?40g葡萄糖，0.5?4g蛋白胨和0.01?0.1gK2HPO4。9.根據權利要求2或3所述的一種利用銀耳同時制備銀杏內酯B和槲皮素的方法，其特征在于，步驟A6或步驟B6中所述從含有槲皮素的銀耳菌絲體中制取槲皮素晶體的方法包括如下步驟: Cl將所制得的銀耳菌絲體烘干，然后粉碎至20目，加入菌絲體重量的5?20倍體積的60?100%的乙醇，反復提取3?5次，得提取液一； C2將步驟Cl所制得的提取液一合并，然后減壓濃縮至原體積的1/30，加入剩余體積5倍的水，于4°C條件下結晶3?18小時，然后抽濾干燥，即得到槲皮素晶體，槲皮素純度大于95%。10.根據權利要求2或3所述的一種利用銀耳同時制備銀杏內酯B和槲皮素的方法，其特征在于，步驟A6或步驟B6中所述從含有銀杏內酯B的發酵液中制取銀杏內酯B晶體的方法包括如下步驟: Dl將所制得的銀杏內酯B的發酵液減壓濃縮并干燥得產物； D2向步驟Dl所得產物中加入重量的5?20倍的60?100%乙醇回流提取3?5次，得提取液二； D3將步驟D2所制得的提取液二合并，然后減壓濃縮至原體積的1/40，于-20°C條件下結晶3?18小時； D4將步驟D3結晶后的產物進行抽濾，抽濾所得濾渣用乙酸乙酯復溶，然后將乙酸乙酯相減壓濃縮至干，再用無水乙醇復溶，并加入3?10倍體積的水，沉淀，抽濾，所得濾渣烘干即為銀杏內酯B，其純度大于90%。
【文檔編號】C12R1/645GK105925638SQ201610391343
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月6日
【發明人】張志才, 李金花, 樊亞娟, 胡坤雅
【申請人】江蘇大學