一種高純度單克隆抗體的制備方法、單克隆抗體及應用

一種高純度單克隆抗體的制備方法、單克隆抗體及應用
【專利摘要】本申請公開了一種高純度單克隆抗體的制備方法、單克隆抗體及應用。本申請的制備方法，包括提取外周血和/或組織細胞免疫樣品；采用高通量測序技術從免疫樣品中獲得抗體核苷酸信息，將所有免疫樣品中共有的重輕鏈序列合并，獲得抗體對全長序列；合成所篩選出來的單克隆抗體核苷酸序列，采用真核表達系統進行蛋白表達，提純表達蛋白，即獲得高純單克隆抗體。本申請的制備方法，能獲得完全人源化單克隆抗體，通過分析重輕鏈配對信息，能獲得天然條件的抗體結構，保證其具有較高親和力；結合高通量測序分析，得到大量高特異性單克隆抗體，具有高通量優勢。本申請的制備方法為大量制備高特異性、高親和力、高純度單克隆抗體提供了一種新思路和途徑。
【專利說明】
-種高純度單克隆抗體的制備方法、單克隆抗體及應用
技術領域
[0001] 本申請設及單克隆抗體制備領域，特別是設及一種高純度單克隆抗體的制備方 法，所制備的單克隆抗體及其應用。
【背景技術】
[0002] Kohler和Milstein在1975年發明的雜交瘤技術使人們第一次獲得了單克隆抗體。 相對于多克隆抗體，單克隆抗體具有更高的特異性和均一性，在臨床診斷和科研領域顯示 出無可比擬的優勢。從那時起，利用不同途徑來獲得抗原特異性單克隆抗體的技術層出不 窮。除了經典的雜交瘤技術外，還包括:B細胞永生化、隧菌體展示技術、酵母展示技術等等， 都在抗體的制備和人源化過程中顯得日益重要，但是通過運些技術獲得的抗體與自然環境 下循環系統中真實存在的抗體還是具有一定差異。運些不同的技術方法大多屬于勞動密集 型工作，并且十分耗時。
[0003] 雜交瘤技術作為目前單克隆抗體制備的經典技術，其主要缺點一方面體現在其勞 動密集型工作特點，操作重復步驟多，速度慢，效率低，不能滿足高通量篩選的要求;其次， 雜交瘤細胞需要進行多次亞克隆才能獲得相對穩定的細胞系，并且獲得的雜交瘤細胞遺傳 不穩定;此外，在通過腹水制備單克隆抗體的過程中會對實驗動物造成痛苦。
[0004] 隧菌體展示技術通過隧菌體外殼蛋白3或外殼蛋白8表達蛋白，將淋己細胞中的整 套編碼抗體基因序列克隆到載體上，形成人源化的抗體文庫，W融合蛋白的形式展現在隧 菌體表面，通過多輪的淘選可獲得完全人源化抗體。然而，隧菌體展示技術十分依賴于文庫 的多樣性，只有文庫的庫容量足夠大時，才能篩選到陽性隧菌體;隧菌體展示技術的另一個 的局限是真核生物基因很難在原核生物中進行正確的表達和修飾，外源基因轉化效率低， 很難獲得高親和力抗體和針對稀有抗原的抗體。

【發明內容】

[0005] 本申請的目的是提供一種新的高純度單克隆抗體的制備方法，所制備的高純度的 單克隆抗體及其應用。
[0006] 為了實現上述目的，本申請采用了 W下技術方案：
[0007] 本申請公開了一種高純度單克隆抗體的制備方法，包括提取外周血和/或組織細 胞的免疫樣品；采用高通量測序技術從免疫樣品中獲得初步的抗體核巧酸信息，將所有免 疫樣品中共有的重輕鏈序列合并，獲得抗體對全長序列;合成所篩選出來的單克隆抗體的 核巧酸序列，采用真核表達系統對合成的核巧酸序列進行蛋白表達，提純所表達的蛋白，即 獲得高純度單克隆抗體。
[000引其中，免疫樣品是指帶有抗體的樣品，通常有兩種情況，一種是直接采用抗原對受 試對象進行免疫，第二種是受試對象本身就是帶病的。另外，合成所篩選出來的單克隆抗體 的核巧酸序列，實際上就是經過高通量測序分析和重輕鏈配對分析得出的抗體對序列。
[0009]需要說明的是，本申請的關鍵在于采用高通量測序技術對免疫樣品進行測序、分 析，獲得大量的特異性強、且親和力高的抗體，并采用真核表達系統，對分析篩選出來的抗 體進行表達，有效的提高了單克隆抗體的制備效率，為制備高純度、高特異性和高親和力的 抗體提供了一種新的思路和途徑。本申請的制備方法能夠得到大量的高特異性、高親和力 的單克隆抗體信息，與傳統的單克隆抗體技術相比，本申請的制備方法一次性可W篩選并 制備出若干個符合要求的單克隆抗體，具有高通量的優勢；當然，篩選出的多個單克隆抗 體，是分別進行真核表達、提純的，保障各個單克隆抗體的純度。
[0010] 優選的，本申請的制備方法還包括，將抗體對全長序列翻譯為抗體氨基酸序列，從 抗體氨基酸序列中篩選出互補決定區，并對其進行表達量和突變頻率分析，篩選出高親和 力、高特異性的單克隆抗體。
[0011] 優選的，采用高通量測序技術從免疫樣品中獲得初步的抗體核巧酸信息，具體包 括，分別提取外周血和/或組織細胞免疫樣品的RNA，對RNA進行反轉錄，獲得CDNA文庫，采用 高通量測序技術對CDNA進行測序，即獲得初步的抗體核巧酸信息。
[0012] 優選的，采用高通量測序技術從免疫樣品中獲得初步的抗體核巧酸信息，具體包 括，從提取的免疫樣品中分離單核細胞，并采用巧光標記的抗原，對單核細胞進行染色;然 后通過流式細胞儀分選與抗原結合的單核細胞，即得到抗原特異性B細胞;最后對抗原特異 性B細胞進行單細胞建庫測序，獲得初步的抗體核巧酸信息。
[0013] 優選的，采用高通量測序技術從免疫樣品中獲得初步的抗體核巧酸信息，具體包 括，從提取的免疫樣品中分離單核細胞，采用抗原包被的磁珠分離與抗原結合的單核細胞， 即得到抗原特異性B細胞;最后對抗原特異性B細胞進行單細胞建庫測序，獲得初步的抗體 核巧酸信息。
[0014] 需要說明的是，采用抗原包被的磁珠分離與抗原結合的單核細胞的基本原理是， 預先將抗原包被在磁珠上，抗原與抗體結合后，自然的也將單核細胞固定在磁珠上，因此， 分離磁珠可W將與抗原結合的單核細胞分離出來，得到抗原特異性B細胞。本申請中，磁珠 包被和流式細胞儀都可W篩選出抗原特異性B細胞，通過對抗原特異性B細胞進行測序分 析，能夠最大程度獲得特異性抗體，保證得到的抗體絕大部分具有特異性。
[0015] 優選的，本申請的制備方法還包括采用抗原親和層析方法，從提取的外周血免疫 樣品中富集特異性的抗體;然后采用質譜分析;將質譜分析的數據作為篩選條件，對基于高 通量測序獲得的抗體序列進行篩選，獲得高親和力、高特異性的單克隆抗體。
[0016] 優選的，蛋白酶為胃蛋白酶、糜蛋白酶、彈性蛋白酶、膜蛋白酶、胞內蛋白酶Lys-C、 金屬內膚酶Lys-N、蛋白內切酶Glu-C、天冬氨酸膚鏈內切酶Asp-N和梭菌蛋白酶Arg-C中的 至少一種。
[0017] 需要說明的是，本申請的抗原親和層析方法是指，將抗原固定在層析柱上，利用抗 原將特異性的抗體分離出來，從而保障了抗體的高特異性。而采用質譜分析獲得的數據對 高通量測序的結果進行篩選，是考慮到質譜分析的對象實際上就是高特異性的、通過抗原 親和層析獲得的抗體，因此，其分析數據自然是一些高特異性的抗體的特征信息，因此，可 W利用運些特征信息，對高通量測序結果進行篩選，從而篩選出高特異性、高親和力的單克 隆抗體。
[0018] 可W理解，在本申請的其它實現方式中，例如巧光標記抗原篩選抗原特異性B細胞 或抗原包被磁珠分離抗原特異性B細胞，然后對分離的抗原特異性B細胞進行高通量測序的 實現方式中，其本身就是針對抗原特異性的B細胞進行的高通量測序，因此可W直接篩選出 高特異性、高親和力的單克隆抗體，而不需要與基于抗原親和層析的質譜分析結合，即不需 要利用質譜分析的數據對高通量測序結果進行篩選。
[0019] 優選的，采用真核表達系統對合成的核巧酸序列進行蛋白表達，具體包括，將合成 的核巧酸序列克隆到pFUSE質粒上，通過脂質體轉染293T細胞或C冊細胞獲得表達，并使用 無血清培養基培養和馴化轉染細胞，得到能夠高表達重組單克隆抗體的細胞系。
[0020] 優選的，提純所表達的蛋白，具體包括，采用偶聯純化柱分離純化，獲得高純度的 單克隆抗體。
[0021] 優選的，本申請的制備方法還包括采用ELISA對獲得的高純度單克隆抗體進行鑒 定。
[0022] 可W理解，本申請的制備方法可W獲得高純度、高特異性、高親和力的抗體，但是 為了進一步的保障抗體的性能，因此，采用化ISA對獲得的高純度單克隆抗體進行鑒定。
[0023] 本申請的另一面公開了一種采用本申請的制備方法所制備的單克隆抗體。
[0024] 本申請的再一面公開了一種制備單克隆抗體的試劑盒，該試劑盒中采用了本申請 的制備方法。
[0025] 可W理解，本申請的制備方法，能夠制備出高特異性、高親和力的單克隆抗體，與 傳統方法相比具有高通量的優勢；因此，完全可W將相關試劑組合成配套的試劑盒，然后按 照本申請所提供的方法進行單克隆抗體的制備。
[0026] 由于采用W上技術方案，本申請的有益效果在于：
[0027] 本申請的制備方法，能夠獲得人體或動物體內循環系統中存在的抗體信息，可獲 得完全人源化單克隆抗體。并且，通過信息分析獲得重輕鏈配對信息，能夠獲得天然條件下 的抗體結構，保證獲得的抗體具有較高的親和力；結合高通量測序、分析，能夠得到大量的 高特異性、高親和力的單克隆抗體，相比傳統的單克隆抗體技術具有高通量的優勢。本申請 的制備方法為大量制備高特異性、高親和力、高純度的單克隆抗體提供了一種新的思路和 途徑。
【附圖說明】
[0028] 圖1是本申請實施例中單克隆抗體制備方法的流程框圖；
[0029] 圖2是本申請實施例中流式細胞儀分離抗原特異性B細胞的FSC/SSC二維散點圖；
[0030] 圖3是本申請實施例中流式細胞儀分離抗原特異性B細胞的FLl通道/直方圖；
[0031] 圖4是本申請實施例中高通量測序結果的數據分析流程框圖；
[0032] 圖5是本申請實施例中膚段鑒定結果圖；
[0033] 圖6是本申請實施例中還原性SDS-PAGE電泳重組抗體結果圖；
[0034] 圖7是本申請實施例中非還原性SDS-PAGE電泳重組抗體結果圖；
[0035] 圖8是本申請實施例中抗體配對的原理示意圖，其中，超過3個孔中同時出現的重 輕鏈序列被認為是配對抗體序列。
【具體實施方式】
[0036] 本申請的高純度單克隆抗體制備方法，對提取的外周血和/或組織細胞免疫樣品 進行高通量測序分析，并采用重輕鏈配對信息得到抗體對全長序列，然后合成所篩選出來 的單克隆抗體的DNA序列，采用真核表達系統對合成的單克隆抗體的DNA進行蛋白表達，提 純該蛋白，從而獲得高特異性、高親和力、高純度的單克隆抗體。
[0037] 與傳統的雜交瘤技術和隧菌體展示技術相比，本申請的制備方法，直接合成高特 異性、高親和力單克隆抗體的DNA，對其進行蛋白表達，針對性更強，效率高，能夠實現高通 量篩選。并且，本申請的制備方法真核表達獲得的直接就是完全人源化單克隆抗體，無需進 行多輪淘選。
[0038] 本申請的一種優選方案中，還對采用抗原親和層析富集外周血中的特異性抗體， 并采用質譜分析對富集的抗體進行統計分析，將統計分析的結果，用于對高通量測序結果 進行篩選，W獲得高親和力、高特異性的單克隆抗體。整個過程將質譜分析技術與高通量測 序技術相結合，如圖1所示，進一步的保障了單克隆抗體的高特異性和高親和力。
[0039] 本申請的質譜分析是基于抗原親和層析的，已有文獻報道親和層析主要利用 Protein A親和層析介質或Protein G親和層析介質進行抗體純化，獲得生物體液或細胞培 養液中全部免疫球蛋白，雖然獲得蛋白樣品高，但特異性較弱，不能保證獲得的免疫球蛋白 具有高度親和能力。而本申請使用抗原親和層析方法，獲取外周血中只針對祀抗原的免疫 球蛋白，特異性高，通過后續質譜分析，W及與高通量測序分析結合，能夠獲得高特異性、高 親和力的單克隆抗體群。
[0040] 需要說明的是，如前面提到的，質譜分析技術并非必須的，例如在本申請的一些實 現方式中，在進行高通量測序之前已經對抗體的特異性進行了一次篩選，例如抗原巧光標 記篩選抗原特異性B細胞，然后再進行單細胞高通量測序;又例如抗原包被磁珠分離的抗原 特異性B細胞，在進行單細胞高通量測序。運兩種實現方式本身就是有針對性的對特異性的 抗體進行的測序分析，再加上后續的重輕鏈分析，可W篩選出高特異性、高親和力的單克隆 抗體，因此，可W不需要結合質譜分析技術。
[0041] 本申請中的抗體配對原理如圖8所示，檢測中超過3個孔同時出現重輕鏈序列被認 為是配對抗體序列。
[0042] 本申請的高純度單克隆抗體制備方法，W抗原多膚CK18為例進行試驗說明，CK18 也被稱為KRT18,編碼I型的中間纖維鏈角蛋白18,是一種最常見的中間纖維基因家族一員。 CK18在身體組織的單層上皮細胞中表達，同時運個基因的突變已與隱源性肝硬化有關。本 例中選擇原核表達的CK18蛋白作為免疫原對小鼠進行免疫。
[0043] 下面通過具體實施例和附圖對本申請作進一步詳細說明。W下實施例僅對本申請 進行進一步說明，不應理解為對本申請的限制。
[0044] 實施例一
[0045] 本例采用抗原巧光標記篩選抗原特異性B細胞，然后對單細胞進行測序、分析，篩 選高特異性、高親和力的單克隆抗體。具體如下：
[0046] 一、樣品制備
[0047] 1、免疫樣品獲取
[0048] 本例使用已知抗原多膚CK18, Wlmg/次的量對小鼠進行免疫，每兩周免疫一次，共 進行4次免疫，在每次免疫后獲取小鼠外周血，作為試驗免疫樣品。
[0049] 2、巧光分子標記抗原
[00加]巧光分子標記物可W采用常規使用的Alexa Fluor 488、門TC、切3、切5、陽、PE- TR、APC或PerCP等。本例具體采用的是FITC。首先將CK18抗原蛋白超濾至碳酸鹽緩沖液中； 將ImL CK18抗原蛋白碳酸鹽緩沖液加入有機溶劑溶解的巧光標記物中，緩慢加入，4°C避光 反應數小時，本例具體反應了化;有機溶劑可W采用常規使用的二甲基亞諷、二甲苯、甲苯、 乙醇或正丙醇，本例采用乙醇;避光反應結束后，向其中加入終濃度為50mM的離子緩沖液，4 °C反應數小時，本例具體的反應化;其中離子緩沖液可W采用氯化錠、硫酸錠，碳酸氨錠或 硝酸錠緩沖液，本例具體采用氯化錠;反應結束后，混合物超濾至憐酸鹽緩沖液中，測濃度， 濾膜過濾除菌，-20°C保存，即FITC標記的抗原。
[0化1] 3、外周血單核細胞染色
[0052] 在15mL離屯、管中加入等體積的外周血、憐酸鹽緩沖液和淋己細胞分離液，保持明 顯液面分界，室溫SOOg離屯、30分鐘，獲得中間的淋己細胞層，再加入5mL憐酸鹽緩沖液250g 離屯、10分鐘，分離得到外周血單核細胞。
[0053] 將外周血單核細胞重懸，每IO6個細胞加 1~化g抗原-異硫氯酸巧光素，吹打混勻， 室溫避光反應。留少量細胞不加抗原-異硫氯酸巧光素作陰性對照。反應后，加入憐酸鹽緩 沖液重懸，400g離屯、5分鐘棄上清，再次用憐酸鹽緩沖液重懸沉淀。400g離屯、5分鐘，棄上清， 用憐酸鹽緩沖液重懸沉淀，制備成樣本。
[0化4] 4、流式細胞分選
[0055] 樣本在上機前使用濾網過濾。選擇分選收集模式，選擇液滴偏向角度，確定滴液延 遲(Drop Delay),放置合適的收集器口，獲取數據，進行分選。前向角散射/側向角散射 (FSC/SSC)二維散點圖，將外周血單核細胞區域劃出來，W排除死細胞，細胞碎片和粒細胞 等其它細胞，如圖2所示，圖中人為圈出來的部分即外周血單核細胞。
[0056] 然后通過化1通道/直方圖界面的二維峰形圖判斷陽性細胞，根據未染色細胞的 FLl通道巧光強度，確定抗原陰性和陽性的分界限；如圖3所示，曲線1為沒有巧光的單核細 胞；曲線2為巧光染色的單核細胞，即抗原特異性B細胞。
[0057] 二、單細胞免疫組庫制備
[005引 l、首先配置裂解液:0.0化L10%的TritonX-100、0.1化40UA^L的RNA酶抑制劑、 1.0化 IOiiM的01ig0-dT、1.0化 IOiiM的dNTP及 1.86化 Spike-in RNA。
[0059] 將配置好的裂解液噴射分裝到384孔板，每個孔的量為4化。噴液后，用濾紙吸去忍 片表面液滴，封上暫時膜，溫度12 °C、轉速2600RCF下離屯、5min。
[0060] 2、配制細胞懸液
[0061] 將細胞懸液在轉速為1000巧m的條件下離屯、5min，除上清，重復兩次；加入適量憐 酸鹽緩沖液，重懸細胞，用40WI1的細胞濾網進行過濾，得到過濾后的細胞懸液;取適量過濾 后細胞懸液，加入等量40 % per col 1溶液，配成20 % per CO 11細胞懸液；加入適量20 % percol 1溶液，配制成實驗所需濃度細胞懸液，備用。
[0062] 陰性對照為20%percoll溶液；陽性對照為 100pg/50nL(2ngAiL)total-RNA。
[0063] 3、裂解細胞懸液
[0064] 裂解條件為72°C、維持5min，裂解結束后，將忍片置于溫度為12°C、轉速為2600RCF 的條件下離屯、5min。
[00化]4、配置逆轉錄體系：2.OuL First-Strand BufferJ.OuLSM的甜菜堿、0.9化 IOOmM的MgCl2、0.2扣LlOOmM的二硫蘇糖醇、0.1 化 IOOiiM的TS0、0.2扣L 40UAiL的RNA酶抑 制劑、0.7化1 200U/]iL的Superscript反轉錄酶組成。
[0066] 將配置好的裂解液噴射分裝到384孔板，每個孔的量為6.2扣L。將384孔板封上封 口膜，在溫度為12°C、轉速為2600RCF的條件下離屯、5min。
[0067] 5、逆轉錄細胞RNA
[006引 421：90111111;70°(：15111111;121：5111111。逆轉錄結束后，將忍片置于溫度為12°(：、轉速為 2600RCF的條件下離屯、5min。
[0069] 6、配制PCR擴增反應體系
[0070] 本例的PCR擴增采用了6條下游引物，上游引物由Race abriged anchor primer (AAP)Invitorgen提供，并采用了一條錯定引物。下游引物具體序列如Seq ID No. I至Seq ID No.6所示，錯定引物如Seq ID No.7所示。
[0071] Seq ID No.l:Mouse IgHM:5'-AAGACATTTGGGAAGGACTGA-3'
[0072] Seq ID No.2:Mouse Ig服3:5'-CAGATGGGGCTGTTGTTGTA-3'
[0073] Seq ID No.3:Mouse_Ig服！-2pro:5'-GCCAGTGGATAGACDGATG-3'
[0074] Seq ID No.4:Mouse IgL5-4new:5'-TGAGGGTGTAGCCTTGGGT-3'
[0075] Seq ID No.5:Mouse I巧C:5'-GGATGGYGGGAAGATGGAT-3'
[0076] Seq ID No.6:Mouse IgLCl:5'-GGTGACTGATGGCGAAGAC-3'
[0077] Seq ID No.7：
[007引 錯定引物:5 ' -GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG-3 '
[00巧]具體PCR擴增反應體系：去離子水31.5化、IOXPCR buffer 5.0化、25mM MgCb 3.0化、1 OmM dNTP miX混合物1.0化、上述各引物（1 OiiM) 2.0化、錯定引物（1 OiiM) 2.0化、de? tailed cDNA 5.0 化、 hq DNA聚合酶 O.^iL。
[0080]其中，IOXPCR buffer包含200mM Tris-肥 1(抑 8.4)、500mM KC1。
[0081 ]反應條件為：94 °C 2min，然后進入 10個循環：94°C0.5min，55 °C Imin，72 °C Imin;循 環結束后，72°C5min。
[0082] 7、末端修復W及3 '末端加堿基"A"
[0083] PCR擴增產物先經過切膠回收純化，然后在T4DNA聚合酶、Klenow片段和T4多核巧 酸激酶等酶的作用下，WdNTP為底物進行末端修復，形成補平的末端憐酸化的DNA片段，使 用MiniElute PCR Purification Kit膠回收試劑盒回收產物。然后利用Klenow FYgment (3'-5'exo-)聚合酶及dATP在補平序列的3'末端加上堿基。用MiniElute PCR Purification Kit回收純化反應體系的DNA。
[0084] 末端修復反應體系：RCR產物76化、10 XPolynucleotide Kinase Buffer 10化、 dNTP(10mM)4化、T4DNA聚合酶扣L、Klenow Fragment化L、T4多核巧酸激酶扣L。末端修復反 應條件為:20°C30min。
[0085] 加堿基"A"反應體系：末端修復回收DNA產物32化、IOx Blue buffer扣UdATP (lmM)10]iL、Klenow Rrgment(3'-5'exo-)聚合酶化L〇37°C恒溫30min。
[00化]8、連接接頭
[0087] 3'末端加上堿基"A"的DNA序列在T4DNA Ligase連接酶的作用下進行接頭連接，用 Mini Elute PCR Purification Kit回收連接產物，采用Qubit等方法對其進行定量。利用 瓊脂糖凝膠電泳W及Mini Elute PCR Purification Kit回收純化凝膠片段DM。
[008引 連接接頭反應體系：DNA 15化、2XRapid Ligase Buffer 25化、PE Adapter oligo mix(化M)5化、T4DNA連接酶化L。反應條件為：20°C30min。
[0089] 9、文庫接頭PCR擴增
[0090] W使用已經連接接頭的DNA產物為模板，加入Hiseq通用PCR引物，DNA高保真 Phusion酶進行PCR擴增，通過對接頭序列進行擴增得到更高濃度的測序文庫DNA。擴增產物 用磁珠進行純化后即可得到測序文庫。
[0091] PCR擴增反應體系：DNA 12.5化、PlPrimer(IOyM)IiiUPrimer Index(IOiiM)I化、分 子級水 10.5]iL、2Xphusion master mix 25化。
[0092] PCR反應條件:98°C Imin;然后進行30個循環:98°C 20s，65 °C30s，72 °C30s;循環結 束后，72°C5min;12°Chold。
[0093] 將所得到的測序文庫在11 Iumina HiSeq2000高通量測序平臺上進行測序，過濾除 去低質量的數據，得到測序結果。將所有免疫樣品中共有的重輕鏈序列合并，獲得抗體對全 長序列。本例經過數據分析篩選，獲得了 4條重鏈:刖、肥、冊、^，3條輕鏈:1^、1^2、1^3，因此， 重輕鏈合并可W獲得12條抗體全長序列。4條重鏈:Hl、H2、H3、H4的氨基酸序列如SeqID No.8至Seq ID No. 11所示，3條輕鏈：L1、L2、L3的氨基酸序列如Seq ID No. 12至Seq ID No. 14所示。
[0094] Hl的序列為Seq ID No.8:
[00 巧]EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCTTSGFTFTDYYMNWVRQPPGKALEWLGFSRNKASGYTTDYSASVKGR FTIS畑NSQSILYLQMNTLRAEDSATYFCARDKAYWGQGTLVTVSA
[0096] 肥的序列為Seq ID No.9:
[0097] EVMLVESGGGLVEPGGSLKLSCAASGFTFSNFAMSWVRQTP 邸化 EWVATISTGGSNTYYPDSVKGRFT IS畑NARNTLYLQMSSLR沈DTAMYYCARLNYFGTNAYAU)YWGQGTSVTVSS
[009引冊的序列為Seq ID No. 10:
[0099] EV化VESGGDLVKPGGSLKLSCVASGFSFSKSGMSWNRQTPD邸LEWVATISSGGSYTFYADSVKGRFT IS畑NAKNTLYLQMSSLK沈DTAMYYCARGDYWGQGTTLTVSS
[0100] H4的序列為Seq ID No. 11:
[0101 ] EVKLVESGGGLVQPGG 化化 SCATSGFTFPDYYMSWVRQPPGKALEWLGFIRNKANGYTTKYSASVKGR FTIS畑NSQNILFLQMNILRAEDSATYFCARDIGDYEGFPYWGQGTLVTVSA
[0102] Ll的序列為Seq ID No. 12:
[0103] DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSK化LHSNGITYLYWYLQKPGQSPQUJYQMSNLASGVPDRFSS SGSGTD巧LRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPWTFGGGTK
[0104] L2的序列為Seq ID No. 13:
[0105] QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVTYMHWYQQKPGSSLKVWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTS YSLTVSRVEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTK
[0106] L3的序列為Seq ID No. 14:
[0107] DVVMTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQDIV服NGNTYLEWYLQKPGQSPR化IYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFT LKISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPVTFGSGTK。
[010引實施例二
[0109] 本例采用抗原包被磁珠篩選抗原特異性B細胞，然后進行單細胞高通量測序、分 析，獲得高特異性、高親和力的單克隆抗體。詳細如下：
[0110] -、樣品制備
[0111] 1、分離外周血單核淋己細胞
[0112] 本例免疫樣品的制備與實施例一相同，在此不累述。獲得外周血后，在15mL離屯、管 中加入等體積的外周血、憐酸鹽緩沖液和淋己細胞分離液，保持明顯液面分界，室溫SOOg離 屯、30分鐘，獲得中間的淋己細胞層，再加入5mL憐酸鹽緩沖液250g離屯、10分鐘，分離得到外 周血單核細胞。
[0113] 2、制備抗原包被磁珠
[0114] 人原核表達CK18蛋白SOiig超濾至憐酸鹽緩沖液中，加入0.5mL粒徑為200nm，濃度 1 Omg/mL的簇基包被磁珠，37 °C反應化后取出磁珠。用清洗液清洗2次，加入封閉液37 °C反應 化獲得抗原包被磁珠。
[0115] 清洗液組分：NaCl 8.0g、KCl 0.2g、化抽P〇4 ? 12出0 2.9g、KH2P〇4 0.2g、Tween-20 0.5mL。加去離子水調整抑至7.4，定容至化。
[0116] 封閉液組分：NaCl 8.0g、KCl 0.2g、Na2冊〇4 ? 12出0 2.9g、K出P〇4 0.2g、酪蛋白 20.0g、甘氨酸20.0g、甘露醇5.0g、TritonX-100 0.5mL、化化0.9g。加去離子水調整抑至 7.4，定容至化。
[0117] 3、分離抗原特異性B細胞
[011引將0.1血磁珠和SmL外周血單核細胞在4°C共同解育30min，之后放置在磁力架上吸 附2min，吸走上清。加入憐酸鹽緩沖液吹打2-3次，重懸磁珠和細胞混合物;然后置于磁力架 上吸附2min，收獲上清，即獲得抗原特異性B細胞。二、單細胞建庫測序
[0119] 獲得抗原特異性B細胞后，后續的單細胞免疫組庫制備與實施例一相同，在此不累 述。將所得到的測序文庫在IlIumina HiSeq2000高通量測序平臺上進行測序，過濾除去低 質量的數據，得到測序結果。將所有免疫樣品中共有的重輕鏈序列合并，獲得抗體對全長序 列，本例同樣獲得了4條重鏈和3條輕鏈，4條重鏈和3條輕鏈的具體序列與實施例一相同。
[0120] 實施例S
[0121] 本例直接對獲取的免疫樣品進行DNA提取和高通量測序分析，采用重輕鏈配對的 方法，獲得抗體對全長序列;并結合質譜分析，最終篩選出高特異性、高親和力的單克隆抗 體。具體如下：
[0122] -、獲取免疫組織或者外周血
[0123] 使用已知抗原多膚CK18, Wlmg/次的量對小鼠進行免疫，每兩周免疫一次，共進行 4次免疫。在每次免疫后分別獲取小鼠外周血，并在最后一次免疫后處死小鼠獲得小鼠脾臟 組織樣品，并分別從所獲取的組織樣本和外周血提取RNA核酸樣本，所得到核酸樣本用于后 續實驗。
[0124] 二、微量細胞RNA提取
[0125] 在15mL離屯、管中加入等體積的外周血、憐酸鹽緩沖液和淋己細胞分離液，保持明 顯液面分界，室溫SOOg離屯、30分鐘，獲得中間的淋己細胞層，再加入5mL憐酸鹽緩沖液250g 離屯、10分鐘，分離得到外周血單核細胞。然后按照W下步驟提取RNA:1、細胞計數后1-2X IO4個外周血單核細胞加入15化L Trizol，吹打混勻，室溫靜置5min; 2、加3化LS氯甲燒至 Trizol勻漿液中，震蕩20-30S直至混合物成乳濁液;3、4°C12000rpm離屯、15min，將75化上層 水相吸到新的PCR管中，加入化L5mg/mL糖原和75iiL預冷的異丙醇混勻，-20°C冰箱靜置沉淀 SOmin; 4、4 °C 12000巧m離屯、15min，棄上清；5、加入 150 化預冷 80 % DEPC乙醇，4 °C 12000rpm 離 屯、15min;6、小屯、的吸取乙醇溶液，小屯、不要吸到沉淀。超凈工作臺放置、干燥15-30min，待 無乙醇殘留時取出獲得細胞總RNA。
[0126] S、反轉錄cDNA制備
[0127] 接W上步驟6,向在超凈工作臺放置、干燥15-30min后獲得的細胞總RNA中直接加 入化L反應液，65°C反應5miru6化反應液包括aOOng/iiL N6隨機引物化L、10mM dNTP 0.扣 UDEPC出0 4.化Ld65°C反應5min后，向其中加入4化反應液，42°C反應50min，70°C滅活 IOmin，獲得反轉錄cDNA。或者，在加入反應液后，37 °C反應大于化，然后70 °C滅活IOmin^ 得反轉錄cDNA。其中，4化反應液包括：5X First-Stand Buffer化L、0.1 M二硫蘇糖醇化L、 RNA酶抑制劑0.Superscript II逆轉錄酶0.
[01%]每組細胞加入96孔板中的1個孔進行后續試驗。
[0129] 四、多細胞免疫組庫文庫制備
[0130] 本例的多細胞免疫組庫文庫制備可W采用RNA樣本，也可W采用制備的反轉錄 cDNA樣本進行。
[0131 ] 如果采用RNA樣本，則對所得到的RNA樣本進行5 ' -RACE，即5 端的快速擴增法，W 便擴增相應的抗體序列，其中，在擴增反應體系中，RNA的起始量為1-化g。
[0132] 1、混合下列樣品，37 °C 1 Omin;冰浴Imin:
[0133] N6隨機引物2.5pmoles(10-25ng)、RNAl-5i^g、補DEPC-水至15.5化。
[0134] 2、依次加入W下樣品：
[013 引 IOXPCR buffer 緩沖液 2.扣L、25mM MgCb 2.化U IOmM dNTP mix 混合物 1 化、 0.1 M二硫蘇糖醇2.
[0136] W上1和2兩步成分總體積2化L。混勻后簡單甩下來，42°C冰浴Imin。
[0137] 3、W上體系再加入化L反轉錄酶II，混勻，42°C溫浴SOmin反轉錄。
[0138] 4、按照W下方法進行末端加 C
[0139] 反轉錄完成后，向W上體系加入DEPC-水6.化L、SXXtailing buffer末端轉移緩 液5.0化、2mM dCTP 2.S.N.A.P.-purified純化樣本10.0化，共計反應體積49.0化。
[0140] 5、94°(：溫浴2-3111111，冰浴1111111，加入1化末端轉移酶了(11'，簡單離屯、后37°(：溫浴 1 Omin。然后65 "ClOmin滅活TdT,置于冰上。
[0141] 6、PCR擴增富集目標區域：
[0142] 本例的PCR擴增引物與實施例一相同，采用了6條下游引物，上游引物由Race abriged anchor Primer(AAP)Invitorgen提供，并采用了一條錯定引物。下游引物具體序 列如Seq ID No. 1至Seq ID No.6所示，錯定引物如Seq ID No.7所示。
[0143] 具體PCR擴增反應體系和反應條件與實施例一相同。
[0144] 7、末端修復W及3 '末端加堿基"A"
[0145] 本例的末端修改和加堿基"A"與實施例一相同。
[0146] 8、連接接頭
[0147] 本例的接頭連接于實施例一相同。
[0148] 9、文庫接頭PCR擴增
[0149] W使用已經連接接頭的DNA產物為模板，加入Hiseq通用PCR引物，DNA高保真 Phusion酶進行PCR擴增，通過對接頭序列進行擴增得到更高濃度的測序文庫DNA。擴增產物 用磁珠進行純化后即可得到測序文庫。
[01 加]將所得到的測序文庫在IlluminaHiSeq2000、HiSeq2500、MiSeq、MiSeqDx、 NextSeq500、Hiseq X ten、Life SOLiDJon Torrent PGM、P;roton、Roche 454和單分子測 序等至少一種高通量測序平臺上進行測序，從而得到測序結果。進行過濾除去低質量的數 據。
[0151] PCR擴增反應體系：DNA 12.5化、PlPrimer(IOyM)IiiUPrimer Index(IOiiM)I化、分 子級水 10.5]iL、2Xphusion master mix 25化。
[0152] PCR 反應條件:98 °C Imin;然后進行 30 個循環：98 °C 20s，65 °C 30s，72 °C 30s;循環結 束后，72°C5min;12°Chold。
[0153] 五、抗原親和層析
[0154] 將外周血除去脂肪、細胞殘渣及小顆粒物質，得到抗血清。將抗血清用憐酸鹽緩沖 溶液W1:5的比例進行稀釋，再用過濾器進行過濾。W每分鐘0.5mL速度將抗血清上到柱上， 為保證抗血清與填料結合，需連續上柱2次并保留上樣流出液。用憐酸鹽緩沖溶液清洗柱子 至M280nm<0.008后力化肥.7洗脫緩沖溶液，Wo. 5血/min的速度洗脫至所有蛋白均流下。用 已經加入100化中和緩沖溶液的1.5mL EP管分管收集洗脫液，混勻后用抑試紙檢查洗脫液 pH，如pH低于7利用中和緩沖液調至約抑7.4 W防止抗體的變性。在柱中加入IOmL，pHl. 9洗 脫緩沖溶液，按上述方法收集洗脫液至AA280nm<0.008。利用分光光度計測定各管中蛋白質 的含量。若蛋白濃度低于〇.5mg/mL，則加入10%的甘油W便保存，將純化的抗體分裝后在2 °C~8°C保存。用含0.05%疊氮化鋼的0.OlM憐酸鹽緩沖溶液清洗柱子后將柱子儲存在2-8 °C環境。將抗體裝入透析袋中，做好記錄，用0.OlM憐酸鹽緩沖溶液透析4°C過夜或室溫6小 時換一次透析液再透析一次。將透析好的抗體用Mi IliporeAmicoir孩叫tra超濾離屯、管濃 縮。
[0155] 中和緩沖溶液：121.2g Tris(lM)、87.8g 化Cl(1.5M)、0.37g 抓TA(ImM)及5g疊氮 化鋼(0.5 % )溶于1L蒸饋水中，并用肥1調節抑8.0。
[0156] 洗脫緩沖溶液(P肥.7):3.75g甘氨酸(50mM)溶于IL蒸饋水，肥1調抑2.7。
[0157] 六、親和力抗體質譜分析
[015引 1、酶切
[0159]將富集獲得的特異性抗體分成若干份，每份分別采用不同的蛋白酶進行酶切，得 到酶解膚段。然后，將所得到的酶解膚段進行質譜分析，得到質譜檢測結果。其中，特異性抗 體分成若干份，其具體的份數與試驗中所采用的蛋白酶的數量相同；蛋白酶可W采用常規 使用的胃蛋白酶、糜蛋白酶、彈性蛋白酶、膜蛋白酶、胞內蛋白酶Ly S-C、金屬內膚酶Ly S-N、 蛋白內切酶GlU-C、天冬氨酸膚鏈內切酶Asp-N、梭菌蛋白酶Arg-C等。本例具體的將特異性 單克隆抗體分成九份，分別采用了胃蛋白酶、糜蛋白酶、彈性蛋白酶、膜蛋白酶、胞內蛋白酶 Lys-C、金屬內膚酶Lys-N、蛋白內切酶Glu-C、天冬氨酸膚鏈內切酶Asp-N、梭菌蛋白酶Arg-C 對其進行酶切。W膜蛋白酶為例，每種樣品精確取出IOyg蛋白，按照蛋白：酶= 20:1的比例 加入膜蛋白酶，37 °C酶解4h，按照蛋白：酶=20:1的比例再次加入膜蛋白酶繼續酶解化，完 成酶解反應。
[0160] 2、分離
[0161] 采用島津LC-20AB液相系統、分離柱為4.6x250mm型號叫化emexSCX柱對樣品進行 液相分離。膚段采用4mL Buffer A(25mM化此P〇4in 25%ACN抑2.7)復溶，進柱后111117111111 速度進行梯度洗脫，先在5%Buffer B(20mM化此P04，1M KCl in 25%ACN pH2.7)中洗脫 7min，緊跟著一個20min的直線梯度使buffer B由5%上升至60%，最后在2min內使buffer B的比例上升至100%并保持Imin，然后恢復到5%平衡lOmin。整個洗脫過程在214皿吸光度 下進行監測，經過篩選得到所需組分，洗提后的膚段混合為所需數目，一般是6個，S化ata X ClScolumn除去鹽份，冷凍抽干。
[0162] 3、質譜上機
[0163] 將抽干的每個組分分別用buffer A(5%ACN，0.1 %FA)復溶至約0.扣g/化的濃度， 20000g離屯、IOmin，除去不溶物質。每個組分上樣扣L(約2.扣g蛋白），通過島津公司LC-20AD 型號的納升液相色譜儀進行分離。所用的柱子柱包括化ap柱和分析柱兩部分。分離程序如 下：先W祉L/min的流速在4min內將樣品loading到化ap柱上，緊接著一個總流速為30化L/ min的分析梯度將樣品帶入分析柱，分離并傳輸至質譜系統。先在5 % buffer B下洗脫5min， 跟著一個35min的線性梯度使buffer B的比例由5%上升至35%，在接下來的5min內提高到 60 %，然后在2min內buffer B增加到80 %并保持2min，最后在Imin內恢復至5 %并在此條件 下平衡lOmin。使用的機器為TripleTOF 5600(AB SCIEX，Concord，0N)，離子源為 化no spray III source (AB SCIEX , Concord , ON)，放射器為石英材料拉制的噴針（New Objectives,Woburn,MA)。數據采集時，機器的參數設置如下：離子源噴霧電壓2.化V，氮氣 壓力為3〇931(14.5931>化日'），噴霧氣壓15931，噴霧接口處溫度150攝氏度;掃描模式為反 射模式，分辨率>30,000;在一級質譜中積累IOOrns并且只掃描電荷為化~5+的離子;挑選 其中強度超過150邱S的前40個進行掃描，2.8s為一個循環;第二個四極桿(Q2)的傳輸窗口 設置為80及210處效率各為50%;脈沖射頻電的頻率為IlkHz;檢測器的檢測頻率為40G化； 每次掃描的粒子信號W四個通道分別記錄共四次后合并轉化成數據;母離子動態排除設置 為:在一半的出峰時間內，約15s，相同母離子的碎裂不超過2次。
[0164] 4、質譜數據分析
[0165] (1)數據庫構建
[0166] 向酶切質譜獲得的數據中滲入常見污染蛋白序列，滲入的常見污染蛋白主要是作 為陰性結果排除錯誤鑒定，得到最終數據庫。運里所使用的污染蛋白序列包括實驗對象物 種的保守區域序列和作為干擾的來自其他物種的蛋白序列。
[0167] (2)數據庫鑒定
[0168] 通過軟件Mascot對質譜結果進行鑒定，并用Mascot化rcolator對鑒定結果進行 過濾。軟件Mascot來自于ht1:p: //www.matrixscience. com/，軟件Mascot F^ercolator來自 ^： http://WWW.sanger.ac.uk/resources/software/mascotpercolator/ 「niAOl
LUI /u」 ^片民陽巧華粒制卿盜疋職段師趣
[0171] 利用化rget-Decoy方法對上述步驟得到的鑒定結果的假陽性率進行評估，保留低 假陽性率鑒定結果作為后續分析基礎，本例設假陽性率過濾闊值為1%。
[0172] 將高通量測序獲得的數據經過數據分析后的結果作為數據庫，W每條抗體序列為 索引，包括分別獲得的重鏈輕鏈氨基酸序列、DNA序列、抗體可變區和恒定區結構信息，互補 決定區（縮寫CDR3)頻率、CDR3長度、CDR3突變率、V-J基因配對情況、V-D-J基因插入長度、V- J基因堿基組成等相關信息，將質譜獲得的數據在數據庫中作為條件進行篩選獲得相應候 選抗體序列，將運些候選抗體序列通過相應的指標再次進行篩選獲得候選表達抗體序列， 如圖4所示。
[0173] 運些指標包括但不限于:互補決定區（縮寫CDR3)頻率、CDR3長度、CDR3突變率、V-J 基因配對情況、V-D-J基因插入長度、V-J基因堿基組成、抗體質譜數據覆蓋率、抗體CDR3質 譜數據覆蓋度、抗體序列亞型、質譜蛋白信號強度。
[0174] 膚段鑒定情況如圖5和表1所示。
[0175] 表1抗體序列統計情況
體序列、序列3為重鏈、序列4為重鏈C化3_coverage〉50%、序列5為重鏈C化3_coverage== 100%、序列6為輕鏈、序列7為輕鏈Cdr3_coverage〉50%、序列8為輕鏈Cdr3_coverage== 100%。
[0178]表1的結果可見，本例最終獲得含有至少一條膚的抗體序列195735條，含有至少一 條獨有膚的抗體序列734條，重鏈355條，C化3覆蓋度大于50 %的重鏈86條，C化3覆蓋度大于 100%的重鏈31條，輕鏈379條，C化3覆蓋度大于50%的輕鏈103條，C化3覆蓋度大于100%的 輕鏈59條。
[01巧]抗體序列示例:抗體為重鏈H1、H2、H3、H4;抗體輕鏈:L1、L2、L3;其中，H1為Seq ID No.8所示序列，H2為Seq ID No.9所示序列，H3為Seq ID No. 10所示序列，H4為Seq ID No. 11所示序列，Ll為Seq ID No. 12所示序列，L2為Seq ID No. 13所示序列，L3為Seq ID No. 14所示序列。
[0180]重鏈輕鏈各1條相互組合共表達獲得具有完整功能的抗體免疫球蛋白。
[0181 ] 4.覆蓋度，豐度統計與相關性分析
[0182]合并多種酶解的數據，根據抗體和鑒定膚段的對應關系，統計抗體序列的膚段鑒 定數，抗體可變區覆蓋度，CDR3區域覆蓋度等信息，并計算對應抗體序列的定量值。其中，覆 蓋度是指所有鑒定膚段覆蓋的長度占總長度的比例;膚段鑒定數目是指所有高于假陽性率 過濾闊值的鑒定膚段數目。
[0183] 實施例四
[0184] 合成最終篩選出來的高親和力、高特異性的單克隆抗體的DNA，通過蛋白表達系統 表達單克隆抗體，并對表達的單克隆抗體進行純化和鑒定。本例具體合成了 W上篩選出來 的4條重鏈H1、H2、H3、H4和3條輕鏈:L1、L2、L3兩兩組合表達的單克隆抗體，共計12條，即 LlHl組合、L2H1組合、L3H1組合、L1H2組合、L2肥組合、L3H2組合、L1H3組合、L2冊組合、L3H3 組合、L1H4組合、L2H4組合、L3H4組合。本例合成了 12條單克隆抗體的核巧酸序列，采用真核 表達序列進行蛋白表達提純，獲得高純度單克隆抗體。
[0185] Lmi組合:重鏈為Seq ID No.8所示序列，輕鏈為Seq ID No. 12所示序列。
[01化]L2化組合:重鏈為Seq ID No.8所示序列，輕鏈為Seq ID No. 13所示序列。
[0187] L3化組合:重鏈為Seq ID No.8所示序列，輕鏈為Seq ID No. 14所示序列。
[0188] Ll肥組合:重鏈為Seq ID No.9所示序列，輕鏈為Seq ID No. 12所示序列。
[0189] L2肥組合:重鏈為Seq ID No.9所示序列，輕鏈為Seq ID No. 13所示序列。
[0190] L3肥組合:重鏈為Seq ID No.9所示序列，輕鏈為Seq ID No. 14所示序列。
[0191] Lm3組合:重鏈為Seq ID No. 10所示序列，輕鏈為Seq ID No. 12所示序列
[0192] L2冊組合:重鏈為Seq ID No. 10所示序列，輕鏈為Seq ID No. 13所示序列。
[0193] L3冊組合:重鏈為Seq ID No. 10所示序列，輕鏈為Seq ID No. 14所示序列。
[0194] L1H4組合:重鏈為Seq ID No. 11所示序列，輕鏈為Seq ID No. 12所示序列。
[0195] L2H4組合:重鏈為Seq ID No. 11所示序列，輕鏈為Seq ID No. 13所示序列。
[0196] L3H4組合:重鏈為Seq ID No. 11所示序列，輕鏈為Seq ID No. 14所示序列。
[0197] -、構建表達載體 [019引 1.酶切
[0199] 分別對載體和合成的單克隆抗體基因進行酶切，使之獲得粘性末端，并采用瓊脂 糖凝膠DNA回收試劑盒，回收酶切后的載體和單克隆抗體基因。本例具體合成的單克隆抗體 基因為：
[0200] 具體的酶切體系和條件如下：
[0201] 20化質粒P即沈DNA或者單克隆抗體基因，化L EcoRV外切酶，1化化el外切酶，5y L 10 X K緩沖液，2化L dd出0,37 °C恒溫化。
[020^ 2.連接、轉化
[0203] (1)連接：
[0204] 1化載體，化L目的片段，1化T4連接酶，5化2乂緩沖液，混勻，室溫反應3〇111111^ 上。
[0205] (2)轉化
[0206] 1)取出零下80°C保存的化21感受態細胞，放在冰上緩慢解凍。
[0207] 2)將感受態細胞加入化L連接產物中或質粒DNA中混勻，冰上放置30min。
[020引 3) 42 °C熱激90s，然后繼續冰浴。
[0209] 4)冰浴2min后，加入80化L無抗性的LB培養基。
[0210] 5)37°(：培養45111111。
[0211] 6)500化pm離屯、3min，棄大部分上清，留約100-15化L，重懸菌體，博來霉素抗性的 LB平板，涂板。
[0212] 7)驚干，于37°C培養箱中倒置培養過夜。
[0213] 3.擴增質粒和轉染
[0214] (1)從轉化的平板挑單克隆到1.5mL的LB液體培養基中，于37°C，200巧m下培養至 OD = O.6-0.8〇
[0215] (2)收集菌液使用質粒回收試劑盒回收質粒。
[0216] (3)轉染前，3~4*l〇VmL細胞密度將293T接種到6孔培養板上。接種密度是3~4* 10己/血
[0217] (4)溶液1:240化無血清培養基+10化Iipofectamine 2000每孔總體積250化，溫 育5min;溶液2:10化無血清培養基+4iig質粒每孔總體積將溶液1與溶液2混合，室溫 下置20min。
[0218] (5)將6孔板中的細胞用無血清培養基沖洗293T細胞兩遍后，加入2mL無血清培養 基。
[0219] (6)將溶液1與溶液2的混合液逐滴加入孔中，搖動培養板，輕輕混勻。在37°C ,5% 的C02中保溫5~6小時。
[0220] (7)6小時后，更換含有血清的全培養基，在37°C，5%的C02中48~72h檢測轉染水 平。
[0221] (8)換全培養基培養后2地，加藥物進行篩選。
[0222] (9)7化后收獲細胞進行蛋白收集純化。
[0223] 4.蛋白樣品收集及親和層析柱純化
[0224] (1)收集的細胞加入裂解液，冰上放置15min，高速離屯、獲得全蛋白樣品。
[0225] (2)樣品按1 .OmL/min的流速上樣至層析柱中，收集流出液。
[0226] (3)收集流傳穿出的血清，再次加入純化管，樣品經過=次流穿。
[0227] (4)用30mL的平衡緩沖液洗涂樹脂，流速維持約2.OmL/min,或洗至流出液的A280 吸光度達到穩定。
[0228] (5)用15mL洗脫緩沖液洗脫抗體，流速維持ImL/min，收集含有目的免疫球蛋白的 洗脫液，并立刻加入1/10洗脫液體積的中和緩沖液，調節抑至7.0。
[0229] (6)憐酸鹽緩沖液溶液透析過夜，獲得濃縮蛋白質。即真核表達的高純度的單克隆 抗體。
[0230] 5. SDS-PAG 電泳檢測
[0231] 將獲得的蛋白樣品加入等體積的2 X加樣緩沖液，100°C解育5min，SDS-PAGE膠電 泳。樣品在濃縮膠中時，80V電壓電泳25min，接著使用120V電壓繼續電泳，直到指示劑到達 分離膠底部時停止電泳。SDS-PAGE結束后使用馬考斯亮藍對凝膠進行染色。本例分別進行 了還原性SDS-PAGE膠電泳和非還原性SDS-PAGE膠電泳。
[0232] SDS電泳結果如圖6和圖7所示，圖6為還原性SDS-PAGE膠電泳的結果，圖7為非還原 性SDS-PAGE膠電泳的結果，兩個圖中由左至右的電泳通道依序為marker、L1H1、L2化、L3H1、 L1H2、L2肥、L3肥、Lm3、L2冊、L3冊、1^擬、111曰濁6'、1^2擬、13擬。圖6的還原性505斗466膠電泳 結果顯示，重鏈輕鏈都得到正確表達，比例基本合適;而圖7的非還原性SDS-PAGE膠電泳結 果顯示，重鏈輕鏈能夠正確配對，完整性良好。
[0233] 二、抗體鑒定
[0234] 抗體鑒定采用化ISA方法，實驗步驟如下：
[0235] 將步驟"3.擴增質粒和轉染"中，換全培養基培養24h，加藥物進行篩選培養72h后 的菌液，即小量表達蛋白，進行超聲處理，具體的，50mL離屯、管中400W工作5s、間隔5s，重復 60次。12000巧m離屯、IOmin，吸上清到新EP管中，作為抗體使用。
[0236] 1.包被:偶聯抗原多膚包被濃度lOiig/mL，每孔10化L，4°C包被過夜，每個樣品兩個 重復。
[0237] 2.封閉：包被完的板子，用洗板機洗板3次，于吸水紙上拍干，然后用1%牛血清白 蛋白封閉，200化/孔，4°C封閉過夜或37 °C封閉化。
[0238] 3.加一抗:封閉完的板子，用洗板機洗板3次，于吸水紙上拍干，根據不同實驗，取 好相應板子，加入相應一抗，本例的一抗為純化抗體，37 °C解育化。
[0239] 4.洗板:用洗板機洗板5次W上，于吸水紙上拍干。
[0240] 5.加二抗:小量表達蛋白上清的孔加山羊抗小鼠-偶聯HRPQ :2000)作為二抗，其 余孔加憐酸鹽緩沖液，37°C解育化。
[0241] 6.洗板:用洗板機洗板5次W上，于吸水紙上拍干。洗板同時，配制好顯色液TMB。
[0242] 7 .顯色：準備好終止液后，加入顯色液10化L/孔，可W晃動板子加速顯色過程。顯 色到一定程度時，一般不能讓空白和陰性顯色太高，加入50化/孔終止液，加入終止液后靜 置IOminW上，使終止徹底、顏色均一。
[0243] 8.讀數:使用酶標儀，對終止后的板子進行讀數，其中，酶標儀必須預熱30minW 上;TMB顯色檢測波長為:450nm。
[0244] 在1:10的稀釋條件下，陽性結果與陰性對照之間的OD值的比值達到1.5或W上，本 例中為憐酸鹽緩沖液對照:〇. 117X1.5 = 0.175,即大于0.175即為陽性，認為相應單克隆抗 體有活性，結果如表2和表3所示。其中表2中anti-CK18為陽性對照；表3中Anti-PCT、Anti- STRBPII、化gative ser皿of mice為陰性對照，憐酸鹽緩沖液為空白對照。
[0245] 表沈LISA測試結果
[0246]
[024引表3ELISA測試結果 [09491
[02加]表2為樣品分別稀釋為0. lmg/mL、0.05mg/mL和0.025mg/mL后的化ISA測試結果統 計表，450nm處的OD值，目前還不能通過信息分析篩選來指示抗體親和力信息。表帥顯示了 兩個重復樣品的統計結果。經表達后對照驗證：1、抗體稀釋至0.1 mg/ml，陽性率達91.97% ; 2、抗體稀釋至0.05111邑/1111，陽性率達％達75%;3、抗體稀釋至0.025111邑/1111，陽性率達50%。 Qit-Off=Mean of Negatives+(3x SD of 化gatives)計算得到Qit-Off = O.843。
[0巧1] 表3中Anti-PCT為鼠抗人降巧素原單克隆抗體，Anti-STRBPII為鼠抗鏈霉素標簽 單克隆抗體，Negative serum of mice為小鼠未進行免疫的陰性血清;運S種樣品均做為 陰性樣品進行化ISA實驗，其中鏈霉素標簽的抗原決定區與CK18,即細胞角蛋白-18,有一定 相似性，因此OD值較高。
[0252] 結果表明，通過高通量鑒定和質譜測序鑒定的抗體序列經過表達合成的重組抗體 能夠產生相應的活性。
[0253] W上內容是結合具體的實施方式對本申請所作的進一步詳細說明，不能認定本申 請的具體實施只局限于運些說明。對于本申請所屬技術領域的普通技術人員來說，在不脫 離本申請構思的前提下，還可W做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬于本申請的保護 范圍。
【主權項】
1. 一種高純度單克隆抗體的制備方法，其特征在于:包括提取外周血和/或組織細胞的 免疫樣品；采用高通量測序技術從免疫樣品中獲得初步的抗體核苷酸信息，將所有免疫樣 品中共有的重輕鏈序列合并，獲得抗體對全長序列;合成所篩選出來的單克隆抗體的核苷 酸序列，采用真核表達系統對合成的核苷酸序列進行蛋白表達，提純所表達的蛋白，即獲得 所述高純度單克隆抗體。2. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于:還包括，將所述抗體對全長序列翻譯 為抗體氨基酸序列，從抗體氨基酸序列中篩選出互補決定區，并對其進行表達量和突變頻 率分析，篩選出高親和力、高特異性的單克隆抗體。3. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于:所述采用高通量測序技術從免疫樣品 中獲得初步的抗體核苷酸信息，具體包括，分別提取外周血和/或組織細胞免疫樣品的RNA， 對RNA進行反轉錄，獲得cDNA文庫，采用高通量測序技術對cDNA進行測序，即獲得初步的抗 體核苷酸信息。4. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于:所述采用高通量測序技術從免疫樣品 中獲得初步的抗體核苷酸信息，具體包括，從提取的免疫樣品中分離單核細胞，并采用熒光 標記的抗原，對單核細胞進行染色;然后通過流式細胞儀分選與抗原結合的單核細胞，即得 到抗原特異性B細胞;最后對抗原特異性B細胞進行單細胞建庫測序，獲得初步的抗體核苷 酸信息。5. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于:所述采用高通量測序技術從免疫樣品 中獲得初步的抗體核苷酸信息，具體包括，從提取的免疫樣品中分離單核細胞，采用抗原包 被的磁珠分離與抗原結合的單核細胞，即得到抗原特異性B細胞;最后對抗原特異性B細胞 進行單細胞建庫測序，獲得初步的抗體核苷酸信息。6. 根據權利要求1-5任一項所述的制備方法，其特征在于:還包括采用抗原親和層析方 法，從提取的外周血免疫樣品中富集特異性的抗體;然后采用質譜分析;將質譜分析的數據 作為篩選條件，對基于高通量測序獲得的抗體序列進行篩選，獲得高親和力、高特異性的單 克隆抗體。7. 根據權利要求1-5任一項所述的制備方法，其特征在于:所述提純所表達的蛋白，具 體包括，采用偶聯純化柱分離純化，獲得高純度的單克隆抗體。8. 根據權利要求1-5任一項所述的制備方法，其特征在于:還包括采用ELISA對獲得的 高純度單克隆抗體進行鑒定。9. 一種采用權利要求1-8任一項所述的制備方法所制備的單克隆抗體。10. -種制備單克隆抗體的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒采用了權利要求1-8任一 項所述制備方法或者所述試劑盒中含有權利要求9所述單克隆抗體。
【文檔編號】C12N15/79GK105925599SQ201610255098
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年4月21日
【發明人】楊乃波, 劉曉, 聶超, 李新洋, 張曦, 劉楚新, 曹麗霞, 周羽, 黃謐
【申請人】深圳華大基因研究院