一種毛竹木聚糖合成關鍵基因PeIRX10的克隆及其應用

一種毛竹木聚糖合成關鍵基因PeIRX10的克隆及其應用
【專利摘要】本發明屬于分子生物學和基因工程領域，具體涉及一個參與木聚糖合成的毛竹糖基轉移酶(glycosyltransferases，GTs)關鍵基因PeIRX10，該基因具有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。本發明為了解次生細胞壁的形成，闡明毛竹組織快速生長的分子基礎提供了一個有力工具；實現了利用PeIRX10能夠修復擬南芥突變體中木聚糖合成缺陷和互補擬南芥突變體中次生細胞壁缺陷。
【專利說明】
-種毛竹木聚糖合成關鍵基因 Pe IRX10的克隆及其應用
技術領域
[0001] 本發明屬于分子生物學和基因工程領域，具體設及一個參與木聚糖合成的毛竹糖 基轉移酶(glycosyltransferases，GTs)關鍵基因化IRXlO的克隆和功能初探。
【背景技術】
[0002] 半纖維素木聚糖(Xylan)是植物中含量僅次于纖維素的多糖成分，在維持細胞壁 的穩定性與完整性中發揮重要作用，是重要的可再生生物質資源。木聚糖由位于高爾基體 內的GTs合成。GTs是一系列參與催化雙糖、聚糖和糖復合物中糖鏈合成的一類酶，存在于所 有生物中，不僅參與了細胞壁主要成分的合成，還催化各種分子的糖基并參與發育、信號轉 導、防御等生物學過程。
[0003] IRXlO基因是參與半纖維素木聚糖主鏈延伸的關鍵基因，對植物次生壁正常的加 厚有重要作用。如果IRXlO基因缺失，則花序和莖中木糖含量下降，細胞壁表現為不規則的 木質部而導致次生細胞壁缺陷。目前，已有植物的IRXlO基因功能研究主要集中在擬南芥、 水稻等模式植物上，然而毛竹中參與木聚糖合成的關鍵基因化IRXlO至今仍未見報道。 [0004]毛竹(Phyllostachys edulis)是我國種植面積最大的經濟竹種，被廣泛應用于食 品、建材、紡織、生物質能源等領域。已經發現毛竹的快速生長過程中伴隨著次生細胞壁生 長。因此，鑒別出毛竹中合成半纖維素木聚糖的相關基因化IRX10,對于了解次生細胞壁的 形成，闡明毛竹組織快速生長的分子基礎具有重要的科學意義。

【發明內容】

[0005] 針對目前尚沒有找到引起毛竹次生細胞生長的原因，本發明旨在提供一個新的來 源于毛竹的參與木聚糖合成的關鍵基因化IRX10,從而為了解次生細胞壁的形成，闡明毛竹 組織快速生長的分子基礎提供了一個有力工具。本發明的目的還在于提供基因化IRXlO在 植物遺傳轉化中的應用，W實現利用基因PeIRXlO能夠修復擬南芥突變體中木聚糖合成缺 陷和互補擬南芥突變體中次生細胞壁缺陷。
[0006] 為實現本發明的發明目的，發明人提供如下技術方案：
[0007] 本發明的目的首先是提供一個新的來源于毛竹的參與木聚糖合成的關鍵基因 PeIRXlO，該基因具有SEQ ID No: 1所示的核巧酸序列。
[000引如附圖1所示:本發明提供的毛竹木聚糖合成關鍵基因化IRXlO在竹算中的表達水 平最高，莖、根和花序中表達量的表達量相對較低，在葉片中的表達水平最低。PeIRXlO的運 一表達模式與竹算具有快速生長的特性有關。
[0009]本發明的另一個目的是提供PeIRXlO在植物遺傳轉化中的應用，一方面包括毛竹 木聚糖合成關鍵基因化IRXlO在制備轉基因植物中的應用，所述的植物為擬南芥;另一方面 包括毛竹木聚糖合成關鍵基因化IRXlO在修復擬南芥突變體中木聚糖合成缺陷和互補擬南 芥突變體中次生細胞壁缺陷上的應用。本發明利用基因工程技術將PeIRXlO基因重組轉入 具有irxlOirxlOl雙突背景的擬南芥植株中，獲得過表達化IRXlO基因的轉基因擬南芥植 株，PeIRXlO基因過表達得到的互補的植株表型與野生型幾乎一致(如表2和圖3所示）。通過 單克隆抗體LMlO進行標記，對互補植株做免疫巧光檢測，顯示互補型擬南芥莖的橫切面切 片中木質部木聚糖具有強烈的免疫信號(如圖5所示），說明化IRXlO基因能夠修復擬南芥突 變體中木聚糖合成缺陷，在毛竹木聚糖合成中起重要作用。
[0010] 與現有技術相比，本發明具有如下優點：
[0011] 1、本發明找到了一個新的來源于毛竹的參與木聚糖合成的關鍵基因化IRX10,從 而為了解次生細胞壁的形成，闡明毛竹組織快速生長的分子基礎提供了具有重要的科學意 義。
[0012] 2、本發明利用基因化IRXlO能夠修復擬南芥突變體中木聚糖合成缺陷和互補擬南 芥突變體中次生細胞壁缺陷，在毛竹木聚糖合成中起著重要作用。
【附圖說明】
[0013] 附圖1是毛竹化IRXlO基因在不同組織器官中的表達模式分析柱形圖。
[0014] 附圖2是轉化IRXlO基因擬南芥植株RT-PCR檢測，
[0015] 其中1代表野生型擬南芥;2代表irxlOirxlOl雙突純合植株;3-6則為轉化IRXlO基 因植株。
[0016] 附圖3是野生型、雙突植株和互補型擬南芥植株的表型變化。
[0017] 附圖4是野生型、irxlOirxlOl雙突和互補植株莖的次生細胞壁變化。
[0018] 附圖5是過表達化IRXlO基因的擬南芥莖部切片的LMlO化學免疫觀察，
[0019] 其中a代表野生型擬南芥；b代表irxlOirxlOl雙突純合植株；C則為轉化IRXlO基因 植株。
【具體實施方式】
[0020] 下面結合實施例和說明書附圖，更具體地說明本發明的內容。應當理解，本發明的 實施并不局限于下面的實施例，對本發明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本 發明保護范圍。
[0021] 在本發明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所有的設備和原料等均 可從市場購得或是本行業常用的。若無特別指明，實施例采用的方法為本領域通用技術。
[0022] 實施例中未注明具體條件的實驗方法，是按照常規條件，Sambrook等作者的分子 克隆實驗室手冊（New York:Cold Spring Harbor LaboratoiT Press,1989)中所述的條件 進行。
[0023] 實施例1毛竹化IRXlO基因表達 [0024](-)實驗方法
[00巧]1.毛竹材料
[0026] 不同組織的毛竹材料取自1年實生苗的根、莖、葉、花序和幼算，液氮速凍后保存- 80°C，用于總RNA的提取。
[0027] (I)RNA的提取和CDNA的合成
[0028] 通過毛竹中已完成的測序的基因序列數據庫和其相應的蛋白序列數據庫進行 BLAST檢索及比對分析，得到化IRXlO基因（P冊1004923G0080;SEQ ID No: 1)的核巧酸序列， 設計引物，如下：
[0029] PeIRX10-Fl:5^CCTGAACCACATGTTTGCCG-3^沈Q ID No:2)
[0030] PeIRXlO-Rl:5'-AATCGCACTGCGCATCATTC-3' (SEQ ID No:3)
[0031] 用RM提取試劑盒（OMEGA )提取毛竹各樣品的總RM。采用PrimeScript IIlstStrand cDNA Synthesis Kit(Takara)試劑盒進行反轉錄，反轉錄的反應體系為：總 RNA 2iig，Ol igo(dT)化L，酶0.5化，RNA酶抑制劑0.5化，dNTP 2化，加d地2〇至總體系為20化； 反應條件為:37°C15min;85°C5s;引物合成在中美泰和生物技術(北京)有限公司進行。
[0032] (2)RT-PCR 分析
[0033] 內參選用0-actin基因，引物如下：
[0034] ACTIN-F：TGAGCTTCCTGATGGGCAAG(SEQ ID No：4)；
[0035] ACTIN-R:CCTGATATCCACGTCGCACTT(沈Q ID No:5)。
[0036] W步驟（I)得到的cDNA為模板，用步驟（I)中的引物進行PCR擴增，測序顯示，得到 PeIRXlO基因（核巧酸序列如沈Q ID No: 1所示KRT-PCR擴增的反應體系為:cDNA化L，10X buffer 扣L，LA hq 0.扣L，dNTP 祉L，PeIRX10-Fl 1 化，PeIRXlO-Rl 1化，32.5化 d地2〇， 共50化;反應程序為:95 °C 30s; 95 °C 5s，60°C 30s，40個循環;烙點曲線檢測程序為，從60°C按 照0.6°C/s速率上升至95°C，連續讀取巧光信號值。所用儀器為CFX96實時巧光定量PCR儀 (Bio-Rad,美國），每次檢測都包括W此0作反應模板的陰性對照，檢測數據采用相對定量A Ct方法，用內參基因0-act in的Ct值進行歸一化。
[0037] (二)實驗結果
[0038] 在毛竹不同的組織器官中化IRXlO基因的表達量存在差異(參見附圖1)，其中在竹 算中的表達水平最高，莖、根和花序中表達量的表達量相對較低，在葉片中的表達水平最 低。
[0039] 實施例2擬南芥中毛竹化IRXlO基因的過表達
[0040] ( - )實驗方法
[0041] 1.表達載體的構建
[0042] 基于Gateway系統用于PCR擴增毛竹化IRXlO全長cDNA序列，擴增引物為：
[0043] PeIRXlO-F:
[0044] 5'-
[0045] GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGAGGAGGTGGGTCTTGGCC-3^沈Q ID No:6);
[0046] PeIRXlO-R:
[0047] 5'-
[0048] GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCCAAGGCTTCAGGTCGCCCACCG-3' (SEQ ID No： 7)。
[0049] PCR反應體系為20化：2XPrimeSTAR Max Premix 10化，上下游引物（10皿ol [I) 各0.扣L，模板化L，dd 出0 化L。反應程序：94°C預變性5min;94°C30s，55°Clmin 30s，72°C 30s，35個循環;72°C延伸lOmin。將擴增產物與PD0NR207連接，轉化DH5a，得到陽性克隆，提 取質粒后進行質粒PCR鑒定，反應體系：回收的PCR目的片段化L，pD0NR207載體IiiUBP Clonase Enzyme Mix化L，然后測序。將測序正確的重組質粒與祀arIyGate 101進行LR重組 反應，LR反應體系：pD0NR207-化IRXlO ：3化，祀arlyGatelOl 化L，LR Clonase E；nz;yme Mix 化L，然后轉化大腸桿菌DH5a，培養后提取質粒并測序。將測序正確的重組質粒轉化農桿菌， 獲得的陽性菌落用薩花法轉化到擬南芥irxl01(-/-)irxl0(+/-)雜合植株中。
[0050] 2.轉基因植株鑒定
[0051 ]經基因工程技術轉化irxl01(-/-)irxl0(-/-)雙突擬南芥，獲得轉基因植株后，通 過PCR和RT-PCR手段進行驗證，引物為：
[0化2] IRX10-F:5^CCACTCGGAGGACTTGGA-3^沈Q ID No:8),
[0化3] IRX10-R:5^GGAAAAAGCCATTGAAAG GG-3^沈Q ID No:9),
[0化4] T-DNA插入引物：
[0055] LBal: 5' -TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG-3'(沈Q ID No: 10)，
[0056] 提取四周大的S種基因型的擬南芥植株的RNA，反轉錄成CDNA，方法如實施例1所 述，內參基因同實施例1 ,RT-PCR反應體系和反應程序同實施例1。
[0057] (二)實驗結果
[005引通過RT-PCR檢測，說明化IRXlO基因已經轉入擬南芥并表達(參見附圖2 )，在附圖2 中，其中1代表野生型擬南芥;2代表irxlOirxlOl雙突純合植株;3-6則為轉PeIRXlO基因植 株。在irxlOirxlOl雙突植株背景下，在化IRXlO基因過表達得到互補的擬南芥植株的表型 大小與野生型幾乎一致(參見附圖3)，同時具有正常的株高、莖粗W及葉片大小和數量(參 見表1)。
[0059] 表1野生型，雙突植株和互補型擬南芥植株的表型分析
[0060]
1234 實施例始B胞壁木聚糖免疫定位 2 (一)實驗方法 3 分別取生長八周的野生型、雙突植株和互補型擬南芥植株基部的莖，切成Imm厚的 切片，用0.1 M憐酸鹽緩沖液(pH 7.2)洗涂切片5~IOmin;用新鮮的3%脫脂牛乳浸泡切片化 并不斷吹打脫脂牛乳;去除脫脂牛乳，并用PBS緩沖液洗涂切片5min;用大鼠抗木聚糖抗體 LMlO(Plantprobes)解育切片化，然后用PBS緩沖液洗涂切片，W洗凈未結合的一抗;用稀釋 50倍的FITC-羊抗大鼠抗體(Zomanbio ,Cat. Z1319)解育化，然后用PBS緩沖液洗涂切片10 次，W洗凈未結合的二抗;最后將切片固定于載玻片上，置于激光共聚焦電子顯微鏡(Zeiss LSM710，495nm)下觀察拍照，結果如附圖4和附圖5所示。 4 (二)實驗結果
[00化]1 .PeIRXlO基因能互補擬南芥irxlOirxlOl雙突植株次生細胞壁缺陷
[0066] irxlOirxlOl雙突植株純合植株次生細胞壁生長基本缺失，在維管束間纖維和木 質部導管細胞的細胞壁明顯變薄(參見附圖4的B和E)"PeIRX10基因的互補植株中維管束間 纖維和木質部導管細胞的細胞壁厚度已經與野生型擬南芥近乎相近(參見附圖4的A和D)。 表明化IRXlO基因能夠互補擬南芥irxlOirxlOl植株細胞壁的次生加厚缺陷。
[0067] 2.?611?10基因可^修復擬南芥^^0山別01雙突植株細胞壁木聚糖合成缺失
[0068] 表2野生型、雙突和互補型擬南芥植株莖部細胞壁單糖組分含量比較 「nnAol
LUU/U」 從巧;看出，巧野生型和此，irxlUirxlUi^乂關擔稱甲木糖宵重減少生8%正 右，而細胞壁中其他單糖(例如阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖等）的含量與野生型相比則有明 顯增加。而在互補植株中，木糖含量W及其他單糖的含量與野生型相近，運說明在 irxlOirxlOl突變體中，PeIRXlO基因的過表達可W使其細胞壁中的單糖含量恢復到與野生 型相似。
[0071] 在野生型和互補型擬南芥莖的橫切切片中木質部具有強烈的免疫信號，而在 irxlOirxlOl雙突植株中沒有檢測到免疫信號(參見附圖5)，說明具有雙突背景的互補植株 中化IRXlO基因的過表達使irxlOirxlOl雙突植株中木聚糖缺乏得到恢復。
[0072] 盡管發明人已經對本發明的技術方案做了較為詳細的闡述和列舉，應當理解，對 于本領域一個熟練的技術人員來說，對上述實施例作出修改和/或變通或者采用等同的替 代方案是顯然的，都不能脫離本發明精神的實質，本發明中出現的術語用于對本發明技術 方案的闡述和理解，并不能構成對本發明的限制。
【主權項】
1. 一種毛竹木聚糖合成關鍵基因 PeIRXlO，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所2. 權利要求1所述的毛竹木聚糖合成關鍵基因 PeIRXlO在制備轉基因植物中的應用，所 述的植物為擬南芥。3. 權利要求1所述的毛竹木聚糖合成關鍵基因 PeIRXlO在修復擬南芥突變體中木聚糖 合成缺陷和互補擬南芥突變體中次生細胞壁缺陷上的應用。
【文檔編號】C12N15/82GK105925591SQ201610261714
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年4月22日
【發明人】宋麗麗, 王杰, 吳藹民, 應葉青, 郭小勤
【申請人】浙江農林大學