非酒精性脂肪肝細胞核酸適體及其應用

非酒精性脂肪肝細胞核酸適體及其應用
【專利摘要】本發明提供了一種非酒精性脂肪肝細胞核酸適體及其應用，非酒精性脂肪肝細胞核酸適體的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1所示的DNA片段。本發明的非酒精性脂肪肝細胞核酸適體具有高特異性和高親和力，可應用于制備非酒精性脂肪肝的治療藥物、制備檢測非酒精性脂肪肝病的檢測試劑盒和非酒精性脂肪肝組織切片成像。
【專利說明】
非酒精性脂肪肝細胞核酸適體及其應用
技術領域
[0001] 本發明設及核酸技術領域，尤其設及一種非酒精性脂肪肝細胞核酸適體及其應 用。
【背景技術】
[0002] 非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指除酒精 和其他明確的損肝因素所致的肝細胞內脂肪過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征，是代 謝綜合征(MS)在肝臟的特征性表現。隨著社會的經濟發展，人們生活方式及飲食結構的改 變，NAFLD患病率迅猛增高，發病年齡漸趨低齡化，已成為21世紀全球重要的公共健康難題 之一。NA化D已經成為歐美等發達國家和我國慢性肝病的首位病因，它不但可W導致肝硬 化、肝癌及肝功能衰竭，更與MS、糖尿病(diabetes mell;Uus，DM)相關的屯、腦血管疾病的發 生、發展及死亡密切相關。NAFLD的發病機制尚未明確闡明，可能是多因素復雜的病理生理 機制，"二次"打擊學說被認為是目前較為成熟的解釋其發病機制的理論:初次打擊主要是 膜島素抵抗(Insulin resis化nce，IR)。二次打擊主要是反應性氧化代謝產物增多，導致脂 質過氧化，細胞因子、線粒體解偶聯蛋白被誘導活化，進而引起脂肪變性的肝細胞發生炎 癥、壞死，甚至進展至肝纖維化。目前，NAFLD的治療主要包括健康宣傳教育，改變生活方式， 控制體質量，減少腰圍，改善IR,糾正代謝素亂，減少附加打擊W免加重肝臟損害W及保肝 抗炎藥物防治肝炎和纖維化。尚無特異性的藥物及方法，不能有效到達祀標。因此，建立和 發展有效的特異性的祀向治療方法是改善NAFLD病情，從而改善預后的關鍵。
[0003] 核酸適體是指用指數富集的配體系統進化技術（systematic evolution of ligands by exponential enrichment,沈LEX)從人工合成的DNA/RNA文庫中篩選得到的能 夠高親合性和高特異性地與祀標分子結合的單鏈寡核巧酸。核酸適體借助氨鍵、范德華力、 疏水作用等分子間作用力形成特殊的=維結構，如發夾、G-四聚體等，從而特異性地識別祀 向物質并影響其生物活性。相比抗體，其具備W下優點：祀分子廣、親合力強、特異性高、修 飾剪裁方便、無毒性和免疫原性、組織滲透性及穩定性好。2006年美國佛羅里達大學譚蔚激 (Weihong Tan)教授的研究團隊在SELEX基礎上發展了一項新的針對活細胞的篩選技術，也 被稱為細胞-S化EX(Cell-SELEX)。該技術W活細胞為篩選對象，從而確保了目標分子保持 其天然構象，最大程度的保留了其生物功能。其基本原理是在體外人工合成一個寡核巧酸 文庫，包括RNA、SSDNA，通過寡核巧酸文庫與目標分子的相互作用，結合PCR技術指數級放大 與祀分子特異結合的寡核巧酸，經過幾輪或數十輪篩選過程，獲得高親和力和高特異性的 核酸適體。近年來發展的核酸適體探針，尤其是細胞祀向的核酸適體，為NAFLD祀向治療帶 來了新的希望和解決途徑。

【發明內容】

[0004] 目前，國內外尚無特異性針對NAFLD細胞的核酸適體的報道，本發明要解決的問題 是首次提供一種高特異性和高親和力結合NAFLD細胞的核酸適體W及該核酸適體的應用。
[0005] 為解決上述問題，本發明采用如下技術方案：
[0006] -種非酒精性脂肪肝(NAFLD)細胞核酸適體，所述NAFLD細胞核酸適體的核巧酸序 列具有SEQ ID NO. 1所示的DNA片段。
[0007] 上述的NAFLD細胞核酸適體，優選的，所述NAFLD細胞核酸適體還包括基于所述SEQ ID NO. 1所示的DNA片段做切短，并具有G四聚體結構或者莖環結構的非酒精性脂肪肝細胞 核酸適體。
[000引上述的NAFLD細胞核酸適體，優選的，所述NAFLD細胞核酸適體還包括基于所述SEQ ID NO. 1所示的DNA片段做延長，并具有G四聚體結構或者莖環結構的非酒精性脂肪肝細胞 核酸適體。
[0009] 上述的NAFLD細胞核酸適體，優選的，所述NAFLD細胞核酸適體還包括基于所述SEQ ID NO. 1所示的DNA片段做堿基替換，并具有G四聚體結構或者莖環結構的非酒精性脂肪肝 細胞核酸適體。
[0010] 本發明中，核酸適體的特異性取決于核酸適體中特殊性的G四聚體結構或者莖環 結構，所W其兩端堿基部分延長或者切短，只要不影響其重要的莖環結構就可W特異性結 合NAFLD細胞，達到NAFLD的生物醫學檢測W及祀向治療的效果。
[0011] 本發明參照下述核酸適體的篩選方法，包括W下步驟：
[001。S1、合成單鏈DNA隨機寡核巧酸文庫和引物；
[001引S2、誘導分化NAFLD細胞，將NAFLD細胞與單鏈DNA隨機寡核巧酸庫解育，進行Cel 1- 沈LEX篩選；
[0014] S3、將首輪篩選產物進行PCR擴增得到擴增產物；
[0015] S4、將所述步驟S3所得的PCR擴增產物W鏈霉親和素瓊脂糖珠為基質進行分離得 到用于次輪篩選的單鏈DNA文庫；
[0016] S5、W步驟S4所得的單鏈DNA文庫為原始來源，重復步驟S2至S4,直至獲得目的寡 核巧酸序列。
[0017] 上述的篩選方法，優選的，所述單鏈DNA隨機寡核巧酸文庫具有SEQ ID NO. 2所示 的DNA序列。
[001 引 沈Q ID N0.2:5'-CGACACCTCCAGACGC(25N)TCGTCCACTGTGCCTC-3'。
[0019] 上述的篩選方法，優選的，引物包括SEQ ID NO.3所示的引物、SEQ ID NO.4所示的 引物。
[0020] SEQIDN0.3:5'-KTC-CGACACCTCCAGACGC-3'；
[0021] 沈Q ID NO.4:5 '-Biotin-GAGGCACAGTGGACGA-3 '。
[0022] 上述的篩選方法，優選的，所述SEQ ID NO. 3所示的引物3'端帶有FITC標記;所述 SEQ ID NO.4所示的引物5'端帶有生物素標記。
[0023] 上述的篩選方法，優選的，所述步驟S2中所述Ce 11-沈LEX篩選具體包括W下步驟：
[0024] S2-1、誘導分化NAFLD細胞，將所述NAFLD細胞與上述單鏈DNA隨機寡核巧酸庫進行 解育，使單鏈DNA序列與NAFLD細胞特異結合；
[0025] S2-2、將結合在NAFLD細胞上的單鏈DNA解離得到首輪篩選產物；.
[0026] 上述的篩選方法，優選的，誘導分化NAFLD細胞的具體步驟為:將化細胞接種于 IOcm培養皿，采用完全培養液(完全培養液的成分含10%FBS和lOOiig/mL青霉素、lOOiig/mL 鏈霉素的高糖DMEM)，在37°C、5 %的C〇2條件下培養，每2天換液I次，當細胞密度達到60 %~ 70%時開始誘導分化。傾去原培養液，改用終濃度含IOOmM油酸，50mM棟桐酸，1 X IO-6M地塞 米松，IX 10-1?膜島素的誘導液繼續培養細胞，每2天換培養液1次，直至1周，顯微鏡下可見 90% W上細胞已經誘導分化為NAFLD細胞。
[0027] 上述的篩選方法，優選的，所述步驟S2-1中所述解育的溫度為4°C，解育時間為化。
[0028] 上述的篩選方法，優選的，所述步驟S2-2中所述解離的具體過程為：收集NAFLD細 胞于去離子水中，于95°C加熱15min，使單鏈DNA序列從NAFLD細胞的表面膜蛋白上解離下 來，在4°C、14000巧m轉速離屯、5min，取上清液得到首輪篩選產物。
[0029] 上述的篩選方法，優選的，所述步驟S4具體為：
[0030] S4-1:將所述PCR擴增產物過DNA層析柱，使PCR擴增產物中的dsDNA吸附DNA層析柱 的鏈霉親和素瓊脂糖珠上；
[0031] S4-2:將NaOH加入到DNA層析柱中，收集濾液。
[0032] 上述的篩選方法是優選的，所述步驟S5中，重復次數為20次。
[0033] 作為本發明的同一技術構思，本發明還提供了一種采用前述的NA化D細胞核酸適 體在制備NAFLD治療藥物中的應用。
[0034] 作為本發明的同一技術構思，本發明還提供了一種采用前述的NA化D細胞核酸適 體在制備檢測NAFLD的檢測試劑盒中的應用。
[0035] 作為本發明的同一技術構思，本發明還提供了一種采用前述的NA化D細胞核酸適 體在NAFLD組織切片成像中的應用。
[0036] 與現有技術相比，本發明的優點在于：
[0037] (1)本發明提供了一種NAFLD細胞核酸適體，目前，國內外尚無特異性針對NAFLD細 胞的核酸適體的報道，本發明首次提供一種高特異性和高親和力結合NAFLD細胞的核酸適 體W及該核酸適體可應用于生物醫學檢測及祀向治療。
[0038] (2)本發明的NA化D細胞核酸適體，W活細胞為祀細胞進行篩選，最大限度的保證 祀蛋白的自然屬性，所篩選的核酸適體具有高特異性和高親和力、無毒，分子量小為(分子 量為28147)，易于合成與標記，在生物醫學檢測W及祀向治療方面將有重要的潛在應用價 值。
【附圖說明】
[0039] 為使本發明實施例的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合本發明實施例 中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整的描述。
[0040] 圖1為富集文庫不同循環周期擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0041 ]圖2為流式細胞儀檢測篩選進程中DNA隨機寡核巧酸庫對化pG2細胞的富集圖。
[0042] 圖3為流式細胞儀檢測篩選進程中DNA隨機寡核巧酸庫對NAFLD細胞的富集圖。
[0043] 圖4為NFD-I核酸適體的測序結果圖。
[0044] 圖5為第15輪篩選到的NAFLD細胞特異性核酸適體NFD-I的二級結構。
[0045] 圖6為流式細胞儀測定所得的第15輪DNA隨機寡核巧酸庫對NA化D細胞對解離常 數。在圖中橫坐標為DNA濃度(nM)，縱坐標為平均巧光強度。
[0046] 圖7為流式細胞儀測定所得核酸適體NFD-I對正負篩選細胞的偏移。
[0047] 圖8為溫度對核酸適體NFD-I的影響，橫坐標為巧光強度，縱坐標為細胞數，紫色曲 線為4°C，藍色曲線為37°C。
[0048] 圖9為蛋白酶處理細胞后對核酸適體N抑-1的影響，橫坐標為巧光強度，縱坐標為 細胞數，綠色曲線為trypsin處理后30min，藍色曲線為Proteinase K處理后30min。
[0049] 圖10為NAFLD細胞核酸適體對不同石蠟切片的特異性結果。
【具體實施方式】
[0050] W下結合說明書附圖和具體優選的實施例對本發明作進一步描述，但并不因此而 限制本發明的保護范圍。
[0051 ]實施例1:體外篩選與NAFLD細胞特異性結合的核酸適體 [0052] (1)第1輪篩選：
[0化3] 1.1、NAFLD細胞的誘導分化：
[0化4]將化pG2細胞接種于1 Ocm培養皿，采用完全培養液(完全培養液中含10 % FBS、10化 g/mL青霉素 、1 OOiig/mL鏈霉素的高糖DMEM)，在37 °C、5 %的C〇2條件下培養，每2天換液1次， 當細胞密度達到60%~70%時開始誘導分化。傾去原培養液，改用終濃度含IOOmM油酸、 50mM棟桐酸、1 X ICT6M地塞米松和1 X 10-1?膜島素的誘導液繼續培養細胞，每2天換培養液1 次，直至1周，顯微鏡下可見90 % W上細胞已經誘導分化為NAFLD細胞。
[0055] 1.2、使用20nmol的高通量的單鏈DNA隨機寡核巧酸庫（IQis數量級)文庫溶解于500 化結合緩沖液(結合緩沖液采用W下方法制備得到：將4.5g右旋葡萄糖、IOOmg tRNA、Ig牛 血清蛋白、5mL溶度為5M氯化儀同時溶解于IL DPBS溶液中，于4°C冰箱冷藏，保存時間不超 過2個月，W下所使用的緩沖液均采用同樣方法制備得到）中得至化NA懸浮液。將DNA懸浮液 在95°C加熱5min，立即置于冰上冷卻直到使用。
[0056] 單鏈DNA隨機寡核巧酸庫為：
[0057] 5'-CGACACCTCCAGACGC(25N)TCGTCCACTGTGCCTC-3'（SEQ ID N0.2)，其中25N為25 個堿基的隨機序列。
[0化引 引物 1:5'-門TC-CGACACCTCCAGACGC-3'（SEQ ID N0.3);
[0059] 引物2:5'-Biotin-GAGGCACAGTGGACGA-3'（SEQ ID N0.4)。
[0060] 1.3、在一個100mmX20mm的培養皿中約包含有超過5X106個細胞培養細胞（即由 HepG2細胞誘導分化的NA化D細胞），而在一個60mmX 15mm的培養皿中約包含有1 X IO6個 HepGs細胞。將細胞培養至90 %聚合度時，進行第一輪篩選。
[0061] 具體步驟為：
[0062] 1.3.1、用洗涂緩沖液(洗涂緩沖液采用W下方法制備得到:4.5g右旋葡萄糖，5mL 溶度為5M氯化儀溶解于IL DPBS溶液中，于4°C冰箱冷藏，保存時間不超過2個月，W下所使 用的洗涂緩沖液均采用同樣方法制備得到)洗涂培養皿中的細胞3次，然后加入1000化步驟 (1)中的DNA懸浮液，使DNA懸浮液能夠充分覆蓋培養皿表面，在4°C搖床（5化pm)上緩解育 Iho
[0063] 1.3.2、解育后用5mL洗涂緩沖液輕輕洗涂3次，每次3min，W去除不能特異性結合 的細胞培養細胞（即由H邱G2細胞誘導分化的NAFLD細胞）的單鏈DNA序列，洗涂過程中盡量 避免細胞脫落。
[0064] 1.3.3、用細胞刮子刮離培養皿中的細胞，收集細胞于50化L的不含DNA的去離子水 中；然后轉移到1.5mL離屯、管中，保證所有的細胞均已轉移到離屯、管中。將離屯、管在95°C加 熱15min，使與細胞表面膜蛋白結合的DNA序列解離下來。然后在4°C下Wl40(K)rpm轉速離屯、 5min。收集離屯、后的上清液，此為第1輪篩選產物。
[0065] (2)PCR擴增第1輪篩選產物：
[0066] 將步驟(1)中制得的第1輪篩選產物進行PCR擴增得到擴增產物。
[0067] 其中擴增引物為：
[006引 引物 1:5'-門TC-CGACACCTCCAGACGC-3'（SEQ ID N0.3);
[0069] 引物2:5'-Biotin-GAGGCACAGTGGACGA-3'（SEQ ID N0.4)。
[0070] PCR反應體系總體積為lOOOiiL，具體成分列于表1中。
[OOW 表1: PCR反應體系表
[0072]
[0073] 將上述PCR反應體系混合均勻后用移液槍平均分裝到5個0.5mL PCR管中（60孔熱 循環儀），每管20化L。
[0074] PCR擴增參數為:變性:95°C30s;退火:58. (TC30s，延伸：72°C30s。分別循環變性、 退火、延伸步驟4,6,8，10，12個周期，然后進行最后一次延升:721：3111^。
[0075] 同時設置1管同為12個循環周期的陰性對照，表2為PCR反應體系和陰性對照的成 分表。
[0076] 表2 :PCR反應體系表和陰性對照成分表
[0077]
[0078] 將擴增后的PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳進行評估，其中瓊脂凝膠電泳選用含有 0.06%漠化乙錠的3%瓊脂糖凝膠來進行分離。將分別將陰性對照品、不同循環周期的PCR 產物W及標準液(Ladder)按照表3的成分進行配制，然后充分混勻后加入凝膠孔中，在IOOV 電壓下電泳30min，然后在紫外成像儀下觀察分析電泳條帶。
[0079] 表3:瓊脂糖疑腦電泳成分配制表
[0080]
1234 圖1為富集文庫不同循環周期擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖，圖中標號1為標準液 (Ladder),標號2為陰性對照，標號3為4個循環周期的PCR產物，標號4為6個循環周期的PCR 產物，標號5為8個循環周期的PCR產物，標號6為10個循環周期的PCR產物，標號7為12個循環 周期的PCR產物。從圖1中可知:標號7的PCR產物最多，證明循環周期為12的PCR效果最佳。 2 (3)富集文庫擴增PCR: 3 將凝膠電泳中標號7的PCR產物切割下來，進行PCR擴增，PCR反應體系總體積為 100化L，表4為PCR擴增的反應體系具體成分。 4 表4: PCR擴增的反應體系成分表
[0085]
[0086] PCR擴增參數為:變性:95°C30s;退火:58. (TC30s，延伸：72°C30s。分別循環變性、 退火、延伸步驟12個周期，然后進行最后一次延升:72°C3min。
[0087] 擴增后將得到1000化擴增產物，一般而言從第3輪起開始固定用于下一輪篩選的 富集單鏈DNA產物為50~I(K)Pmol ,1000化的擴增產物已足夠用于下一輪篩選。多余的產物 可用于流式檢測篩選時富集的過程和冰凍備用。
[0088] (4)ssDNA 的制備：
[0089] 4.1、在空白的DNA層析柱一端塞入濾膜(濾膜孔徑為0.02WI1)，在另一端接注射器。 將20化L鏈霉親和素瓊脂糖珠懸浮液通過注射器注入DNA層析柱，加壓注射器活塞過濾掉鏈 霉親和素瓊脂糖珠緩沖液。用2mL的DPBS緩慢洗涂濾膜上的瓊脂糖珠，并重復洗涂3次。
[0090] 4.2、采用步驟4.1的注射器吸取步驟(3)中得到的擴增產物，加壓活塞過濾擴增產 物中的液體，因 PCR產物中的互反義鏈含有生物素，所WdsDNA能吸附在鏈霉親和素瓊脂糖 珠上；為最大限度的回收擴增PCR產物。用2. OmL的離屯、管收集過濾的PCR擴增產物中的液 體，再次過濾。然后加入2.5mL 1 XDPBS洗去殘存液體和未標記的非特異性DNA。
[0091] 4.3、用注射器吸取50化L 200mM的NaOH,加壓活塞，用2.0血的離屯、管收集過濾液， 良P S SDNA溶液。
[0092] (5)ssDNA 脫鹽：
[0093] 5.1、準備NP5脫鹽柱，上方加入一漏斗.加入15mL的去離子水沖洗脫鹽柱。
[0094] 5.2、在NP5脫鹽柱中加入步驟(4)中收集到的ssDNA溶液50化L，讓溶液緩慢流出， ssDNA則留在NP5脫鹽柱中。
[0095] 5.3、再加入1000化不含DNA的去離子水，留在NP5脫鹽柱中的ssDNA將和去離子水 一起流出，收集濾液。
[0096] 5.4、在26〇111的紫外吸收波長測定濾液中33〇臟濃度。
[0097] 5.5、用真空干燥機中干燥樣品，DNA沉淀溶解于結合緩沖液中，調整其濃度為 1 OOOnM，儲存于-20°C冰箱中備用。
[009引 （6)第2輪篩選：
[0099] 我們引入了負篩選，即用化9&細胞作為負細胞。第2輪篩選的隨機文庫為第1輪篩 選獲得的文庫，文庫與化pG2細胞誘導的NAFLD細胞解育后接著與化pG2細胞解育，兩種細胞 均為5 X IO6個，再接著進行PCR擴增，其余步驟與第一輪篩選相同。
[0100] 具體步驟為:在1個IOOmmX 20mm的培養皿中約包含有超過5 X IO6個化pG2細胞誘導 的NAFLD細胞，用洗涂緩沖液洗涂細胞3次，加入第1輪篩選獲得的單鏈DNA文庫（即步驟(5) 中獲得的ssDNA)，使DNA懸浮液能夠充分覆蓋培養皿表面，在4°C搖床上解育化(5化pm)。解 育后用5mL洗涂緩沖液輕輕洗涂3次，每次3min，去除不能特異性結合祀細胞的單鏈DNA序 列，洗涂過程中盡量避免細胞脫落。用細胞刮子刮離細胞，收集細胞于50化L不含DNA的去離 子水中并轉移到1.5mL離屯、管中，保證所有的細胞均已轉移到離屯、管中。將離屯、管在95°C加 熱15min，使與細胞表面膜蛋白結合的DNA序列解離下來。在4 °C 1400化pm條件下離屯、5min。 收集包含DNA的洗脫液上清，此上清液再與IOOmm X 20mm的培養皿中約包含有超過5 X IO6個 HepGs細胞解育比(5化pm)。解育后用5mL洗涂緩沖液輕輕洗涂3次，每次3min，收集洗涂液離 屯、并進行PCR擴增。
[0101] (7)第3輪篩選：
[0102] 我們從第3輪起固定用于篩選的文庫量為SOpmol，同時逐漸減少陽性細胞的數量 (第1輪和第2輪時用IOOmmX 20mm的培養皿.而到第3輪W后時可W改在60mmX 15mm的培養 皿上進行篩選），延長洗涂時間和增加洗涂緩沖液的量，減少解育時間（從Ih逐漸減少至 30min)，加結合緩沖液中FBS的量(從10%逐漸增加至20%)。負篩選的細胞均保持在5X10? 個，解育時間保持在化，其余與第2輪篩選相同。
[0103] 具體步驟為:在1個60mmX 15mm的培養皿中約包含有超過1 X IO6個化pG2細胞誘導 的NAFLD細胞，用洗涂緩沖液洗涂細胞3次，加入第二輪篩選獲得的單鏈DNA文庫，使DNA懸浮 液能夠充分覆蓋培養皿表面，在4°C搖床上解育30min(50rpm)。解育后用5mL洗涂緩沖液輕 輕洗涂3次，每次3min，去除不能特異性結合祀細胞的單鏈DNA序列，洗涂過程中盡量避免細 胞脫落。用細胞刮子刮離細胞，收集細胞于500化不含DNA的去離子水中并轉移到1. SmL離屯、 管中，保證所有的細胞均已轉移到離屯、管中。將離屯、管在95°C加熱15min，使與細胞表面膜 蛋白結合的DNA序列解離下來。在4°C1400化pm條件下離屯、5min。收集包含DNA的洗脫液上 清，此上清液再與IOOmm X 20mm的培養皿中約包含有超過5 X IO6個HepG2細胞解育Ih (5化pm)。解育后用5ml洗涂緩沖液輕輕洗涂3次，每次3min，收集洗涂液離屯、并進行PCR擴 增。
[0104] (8)第4至第20輪篩選:其篩選方法與第3輪篩選一致，每次篩選均是用上一輪篩選 獲得的文庫。
[0105] (9)流式細胞術監測文庫富集：
[0106] 流式細胞術是一種在功能水平上對單細胞或其他生物粒子進行定量分析和分選 的檢測手段，它可高速分析上萬個細胞。流式細胞儀通常W激光作為發光源。被巧光染色的 細胞在激光束的照射下，產生散射光和激發巧光。光散射信號在前向小角度進行檢測，運種 信號基本上反映了細胞體積的大小；巧光信號的接受方向與激光束垂直，經過一系列雙色 性反射鏡和帶通濾光片的分離，形成多個不同波長的巧光信號。運些巧光信號的強度代表 了所測細胞膜表面抗原的強度或其核內物質的濃度。在篩選過程中，門TC標記的的SSDNA用 于檢測篩選的進度。
[0107] 檢測步驟如下：
[0108] 樣本準備：供試樣本:選取I X IO6個生長狀態良好的經誘導分化的NA化D細胞，待 細胞生長豐度達到90%左右時用洗涂緩沖液洗涂細胞3次，再用非酶消化液37°C消化細胞 lOmin，輕輕吹打細胞，將細胞制成單個細胞懸液。再次用洗涂緩沖液洗涂細胞2次（4°C， 1150巧m，4min)，計數細胞，將細胞懸液濃度調整至1 X IO6個/mL,分裝于流式細胞儀管。每 管加入250nM的待檢測的各輪篩選富集產物，混勻后于4°C解育30min。解育結束后再次用洗 涂緩沖液洗涂2次(4°C，115化pm，4min)，最后將每管細胞懸浮于200mL結合緩沖液中，上機 檢測。
[0109] 陰性對照：另準備1 X IO6個化pG2細胞，加入250nM DNA文庫，作為陰性對照。
[0110] 圖2、3為流式細胞儀檢測篩選進程中DNA寡核巧酸序列對NAFLD細胞的富集圖。在 圖中，橫坐標為巧光強度，縱坐標為細胞數，綠色曲線為初始DNA隨機核巧酸序列庫，藍色曲 線為第15輪DNA富集寡核巧酸序列，黃色曲線為第20輪DNA富集寡核巧酸序列。
[0111] 從圖2中可知:第15輪富集序列與負篩選細胞有較強巧光信號，提示其與負篩選細 胞均有結合，但與正篩選細胞的結合能力更強，第18輪富集序列的巧光信號較第15輪結果 有所減低，且與負篩選細胞的信號減低更多，說明此時序列中與正篩選細胞結合的序列占 了絕大多數，文庫已經得到富集。第20輪富集序列巧光信號進一步降低，與負細胞的巧光信 號基本回復到陰性對照，可能丟失了某些與正篩選細胞結合的序列。
[0112] 從圖3中可知:第15輪富集序列與正篩選細胞有較強巧光信號，提示其與正篩選細 胞均有結合，第18輪富集序列的巧光信號較第15輪結果有所減低，文庫已經得到富集。第20 輪富集序列巧光信號進一步降低，可能丟失了某些與正篩選細胞結合的序列。
[0113] (10)測序；
[0114] 本實施例采用454測序方法。454測序技術依靠 DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、巧光素酶 和雙憐酸酶的協同作用，將引物上每一個dNTP聚合與一次巧光信號釋放偶聯起來，通過檢 測巧光的釋放和強度，達到實時測定DNA序列的目的。
[011引具體步驟如下：
[0116] 10.巧庫制備:將454測序引物5'端與PCR引物連接。
[0117] 10.2、乳液PCR擴增：單鏈DNA文庫被固定在特別設計的DNA捕獲磁珠上，然后磁珠 結合的文庫被擴增試劑乳化，形成油包水的混合物，每個獨特的片斷在自己的微反應器里 進行獨立的擴增，而不受其他影響。擴增后產生了幾百萬個相同的拷貝。隨后，乳液混合物 被打破，擴增后的片段被回收純化用于測序實驗。
[011引10.3、測序反應:攜帶ssDNA的珠子與其他反應物混合后放入PTP板中。PTP孔的直 徑(29皿)只能容納一個珠子(20皿)。然后將PTP板放置在GS FLX中開始測序。每添加一個與 模板鏈互補的核巧酸都會產生化學發光的信號，并被CCD照相機所捕獲，由此一一對應，準 確、陜速地確定待測模板的堿基序列。
[0119] 10.4、數據分析:測序結束后，每個序列的引物部分被去除，中間的隨機序列部分 應用Clus化1 1.83軟件進行比對進行同源序列分析。
[0120] 圖4為NFD-I的測序結果。由圖中可知，NFD-I的DNA片段為：
[0121] 5 '-CGACACCTCCAGACGCACGCTCGACACGACACCTCCAGACCGCCTCGTCCACTGTGCCTC-3 ' (沈Q ID NO. 1)。
[0122] 圖5為第15輪篩選到的NAFLD細胞特異性核酸適體NFD-I的二級結構。
[0123] (11)親和力測定：
[0124] 用流式細胞技術測定所篩選到的核酸適體與祀細胞的親和力，具體步驟如下：
[01巧]11.1、將合成的核酸適體和結合緩沖液配置成濃度分別為:250nM，125mM，62.5nM， 31.25nM，15.625mM，6.25nM，InM，0.25mM的梯度濃度溶液。
[01%] 11.2、選取生長狀態良好，處于對數生長期，細胞豐度達到90% W上誘導分化的 NAFLD細胞，去除培養基，用洗涂緩沖液于4°C洗涂2次。
[0127] 11.2、加入3mL的非酶消化液(非酶消化液不含膜蛋白酶等蛋白消化酶類，其成分 包括:氯化鋼、氯化鐘、憐酸氨二鋼、憐酸二氨鐘、乙二胺四乙酸二鋼巧DTA)、1 %酪紅溶液。） 于37°C消化5~15min不等，當細胞變圓漂浮時終止消化，輕斜培養皿，去除非酶消化液。
[01 %] 11.4、加入5mL洗涂緩沖液，慢慢吹打重懸細胞，收集細胞于15mL離屯、管中， 1150巧m離屯、3min，重復洗涂3次。
[0129] 11.5、計數細胞，收集細胞于流式管中，每管含細胞數IX IO6個，體積為I(K)化結合 緩沖液。
[0130] 11.6、將FITC標記的NFD-I核酸適體和隨機文庫與IX IO6細胞在4°C解育30min.終 濃度為250nM。
[0131 ] 11.7、用洗涂緩沖液洗涂細胞3次，用結合緩沖液20化L重懸細胞，上機檢測。
[0132] 11.8、計算相對巧光強度時，用所測的平均巧光強度減去對照隨機文庫的巧光信 號強度后，使用Sigmaplot軟件計算核酸適體的解離常數，核酸適體的解離常數通過公式Y = Bmax X/化d+X)。
[0133] 圖6為流式細胞儀測定所得的第15輪DNA隨機寡核巧酸庫對NA化D細胞對解離常 數。在圖中橫坐標為DNA濃度(nM)，縱坐標為平均巧光強度。
[0134] 從圖6中可知= NFD-I與NAFLD細胞的解離常數在nmol級別，說明NFD-I具有與祀細 胞較強的結合能力。親和性是核酸適體的一個重要特性，常用平衡解離常數表示。一個好的 核酸適體與祀細胞常具有較強的親和性，即具有較小的解離常數。
[0135] (12)流式細胞儀測定所得核酸適體NFD-I對正負篩選細胞的偏移。
[0136] 12.1、用DNA合成儀合成篩選得到的序列，每條序列的5'用FITC標記。合成完畢后 的核酸適體經過HPLC純化后干燥備用；
[0137] 12.2、取生長良好的經誘導分化的NAFLD細胞，傾去培養基，用PBS洗涂3次；
[0138] 12.3、加入31111的非酶消化液于37°(：消化1〇111111，待細胞由扁平變圓，少數開始脫落 時，終止消化；
[0139] 12.4、加入5mL洗涂緩沖液，輕輕吹打重懸細胞，收集于15mL離屯、管中，計數細胞， 分裝于流式管中，每I(K)化溶液中加入1 X IO6個祀細胞，115化pm離屯、3min，再次用洗涂緩沖 液洗涂3次；
[0140] 12.5、將合成的5'端標記FITC的核酸適體和隨機文庫與細胞在4°C解育30min，核 酸適體的終濃度為250nM;
[0141] 12.6、重復用洗涂緩沖液洗涂2次，最后用2(K)化結合緩沖液重懸浮細胞上機檢測 計數2 X IO4個細胞。
[0142] 圖7為流式細胞儀測定所得核酸適體N抑-1對正負篩選細胞的偏移。在圖7中，橫坐 標為巧光強度，縱坐標為細胞數。
[0143] 用流式細胞儀檢測其親和性與特異性。通常，與對照ssDNA文庫相比，如果巧光信 號平均值超出10%即可認為與祀細胞有結合。從圖7中可知:N抑-1對正篩選細胞顯示出明 顯的信號前移，而對負篩選細胞基本沒有移動，說明其對祀細胞親和力高，而對負篩選無親 和力。
[0144] 實施例2
[0145] 考察溫度對核酸適體NFD-I的影響。
[0146] 因為篩選的條件是在4°C下進行的，所做的結合試驗也是在4°C下進行的，但是人 體的內環境溫度是37°C，因此我們研究了在4°C和37°C溫度下，核酸適體和祀細胞的親和力 有沒有影響。
[0147] 具體步驟如下：
[0148] (1)將合成的FITC標記的核酸適體和隨機對照文庫用結臺緩沖夜配置成濃度為 250nM的溶液，置于4 °C保存。
[0149] (2)選取生長狀態良好，處于對數生長期，細胞豐度達到90% W上誘導分化的 NAFLD細胞，去除培養基，用洗涂緩沖液于4°C洗涂2次。
[0150] (3)加入3mL的非酶消化液于37°C消化5~15min不等，當細胞變圓漂浮時終止消 化，輕斜培養皿，去除非酶消化液。
[0151] (4)加入5mL洗涂緩沖液，慢慢吹打重懸細胞，收集細胞于15mL離屯、管中，115化pm 離屯、3min，重復洗涂3次。
[0152] (5)計數細胞，收集細胞于流式管中，每管含細胞數IX IO6個，體積為10化L結合緩 沖液；
[0153] (6)將FITC標記的各濃度核酸適體和隨機文庫與1 X IO6個細胞分別在37°C和4°C 解育30min.終濃度為250nM。
[0154] 用洗涂緩沖液洗涂細胞3次，用結合緩沖液20化L重懸細胞，上機檢測。
[0155] Cell-沈LEX技術是在4°C條件下進行的，核酸適體與祀細胞的親和力實驗也是在4 °C條件下進行。人體的體溫卻是37°C，不同的溫度可能對核酸適體與祀細胞的親和力產生 影響，而篩選到的核酸適體要想獲得更好的實驗意義，需要在37°C條件下進行與祀細胞的 親和力實驗。
[0156] 圖8為溫度對核酸適體NFD-I的影響，橫坐標為巧光強度，縱坐標為細胞數，紫色曲 線為4°C，藍色曲線為37°C。從圖8中可知:不論是在4°C還是在37°C條件下，NFD-I和祀細胞 均具有相同的結合能力。
[0157] 實施例3
[0158] 考察蛋白酶處理細胞后對核酸適體NFD-I的影響。
[0159] (1)收集生長狀態良好，處于對數生長期，細胞豐度達到90% W上誘導分化的 NAFLD細胞，用蛋白酶K或膜蛋白酶于37°C分別消化30min，用洗涂緩沖液洗涂細胞3次。
[0160] (2)計數IX IO6個細胞，收集細胞于流式細胞管中，每管細胞中加入250nM核酸遁 體100化，于-4°C解育30min。
[0161] (3)解育結束后再次洗涂細胞3次，用20化L洗涂緩沖液重懸細胞，上機檢測。
[0162] 通過Cell-沈LEX技術篩選到的核酸適體通常和細胞膜上的蛋白特異性結合，為了 驗證N抑-1與細胞膜蛋白結合，我們選用化ypsin和Proteinase K兩種蛋白酶實驗，我們用 t巧psin和Proteinase K兩種蛋白酶與細胞解育30min，破壞細胞膜上的膜蛋白，然后用 N抑-1與經蛋白酶處理后的祀細胞解育，用流式細胞術檢驗。
[0163] 圖9為蛋白酶處理細胞后對核酸適體NFD-I的影響，橫坐標為巧光強度，縱坐標為 細胞數，綠色曲線為trypsin處理后30min，藍色曲線為Proteinase K處理后30min。
[0164] 從圖9中可知:N抑-1與經蛋白酶處理后的祀細胞無巧光前移，說明N抑-1與經蛋白 酶處理后的祀細胞無結合能力，進一步驗證了 N抑-1的祀標是細胞的膜蛋白。
[01化]實施例4
[0166] 考察NAFLD細胞核酸適體對不同細胞系的結合能力。
[0167] 檢測所篩選到的核酸適體的特異性，使用流式細胞技術檢測核酸適體與其他細胞 的結合情況。實驗過程中所使用的細胞種類包括:人肝細胞癌亞型L服6和化h7，CEM(T淋己 細胞白血病細胞），Ramos(B淋己細胞白血病細胞）、H23(非小細胞肺癌細胞）、A549(肺癌細 胞亞型）、冊61 (大細胞肺癌）、CA0V3 (卵巢腺癌）、NAFLD、CK562、MCF-7、胎pG2、肥3。
[016引步驟如下：
[0169] (1)選取生長狀態良好，處于對數生長期，細胞豐度達到90% W上的各細胞系，去 除培養基.用洗涂緩沖液于4°C洗涂2次。
[0170] (2)加入3mL的非酶消化液于37°C消化5~15min不等，當細胞變圓漂浮時終止消 化，輕斜培養皿，去除非酶消化液。
[0171] (3)加入5mL洗涂緩沖液，慢慢吹打重懸細胞，收集細胞于15mL離屯、管中，115化pm 離屯、3min，重復洗涂3次。
[0172] (4)計數細胞，收集細胞于流式管中，每管含細胞數IX IO6個，體積為10化L結合緩 沖液。
[0173] (5)將FITC標記的核酸適體和文庫與1 X IO6個細胞在4°C解育30min，終濃度為 250nM〇
[0174] (6)用洗涂緩沖液洗涂細胞3次，用結合緩沖液20化L重懸細胞，上機檢測。
[0175] (7)FACScall流式細胞儀檢測巧光強度，計數2 X IO4個細胞，使用FITC標記的隨機 ssDNA文庫作為對照。通過計算核酸適體與文庫對照位移比例來評價核酸適體與細胞的結 合能力。
[0176] 表5 = NAFLD細胞核酸適體對不同細胞系的結合能力結果表。
[0-1771
[0178J -:0、<10; + :10~35% ;++:35~60%
;+++:60~85% ;++++:〉85%。
[0179] 從表5中可知:N抑-1與化P&細胞無結合能力，與化細胞誘導分化的NAFLD細胞 有較強的結合能力，與人肝細胞癌亞型化H86)，T淋己細胞白血病細胞(CEM)，B淋己細胞白 血病細胞(Ramos)，非小細胞肺癌細胞化23)，肺癌細胞亞型(A549)，乳腺癌(MCF-7)，卵巢腺 癌(CA0V3)，人肝細胞癌亞型化化7)等均無結合能力。提示篩選到的核酸適體具有較強的特 異性。
[0180] 實施例5
[0181 ]考察NAFLD細胞核酸適體NFD-I對石蠟切片的特異性。
[0182] (1)脫蠟:將石蠟切片浸入二甲苯中3次，每次lOmin。
[0183] (2)水化：已脫蠟的切片依次浸入無水乙醇、95 %乙醇和70 %乙醇中，每次浸沒 10min〇
[0184] (3)抗原復性：水化的切片用TE Buffer(pH8.0)洗嫌后，于沸騰TE Buffer中放置 15min〇
[0185] (4)所述用隨機DNA序列封閉非特異性結合:在切片的組織上滴加濃度為1皿ol/L 的隨機序列20化L，低溫(4°C)環境下在水平搖床解育30min。
[0186] (5)所述用帶巧光信號CY3的核酸適體SYL3C進行解育：切片的相應組織滴加濃度 為250nmol/L的核酸適體15化L，室溫環境下在水平搖床解育60min。
[0187] (6)洗涂非特異性結合:將切片置于50mL離屯、管中，倒入40mL D-PBS進行洗涂，低 溫(4°C)環境下在水平搖床洗涂3次，每次15min。巧光顯微鏡下觀察結果；同時取來源于同 一個組織的石蠟切片用帶巧光信號CY3的N抑-1解育，方法參照經典免疫巧光法。成像結果 與SYL3C所得成像結果進行對比。
[0188] 除了在細胞層面分析核酸適體NFD-I的親和力和特異性外，我們進一步在組織層 面分析其親和力和特異性。圖10為NAFLD細胞核酸適體對不同石蠟切片的特異性結果。從圖 10中可知:NFD-I對組織切片也具有較好的親和力及特異性。
[0189] W上所述，僅是本發明的較佳實施例而已，并非對本發明作任何形式上的限制。雖 然本發明已W較佳實施例掲示如上，然而并非用W限定本發明。任何熟悉本領域的技術人 員，在不脫離本發明的精神實質和技術方案的情況下，都可利用上述掲示的方法和技術內 容對本發明技術方案做出許多可能的變動和修飾，或修改為等同變化的等效實施例。因此， 凡是未脫離本發明技術方案的內容，依據本發明的技術實質對W上實施例所做的任何簡單 修改、等同替換、等效變化及修飾，均仍屬于本發明技術方案保護的范圍內。
【主權項】
1. 一種非酒精性脂肪肝細胞核酸適體，其特征在于，所述非酒精性脂肪肝細胞核酸適 體的核苷酸序列具有SEQ ID NO. 1所示的DNA片段。2. 根據權利要求1所述的非酒精性脂肪肝細胞核酸適體，其特征在于，所述非酒精性脂 肪肝細胞核酸適體還包括基于所述SEQ ID NO. 1所示的DNA片段做切短，并具有G四聚體結 構或者莖環結構的非酒精性脂肪肝細胞核酸適體。3. 根據權利要求1所述的非酒精性脂肪肝細胞核酸適體，其特征在于，所述非酒精性脂 肪肝細胞核酸適體還包括基于所述SEQ ID NO. 1所示的DNA片段做延長，并具有G四聚體結 構或者莖環結構的非酒精性脂肪肝細胞核酸適體。4. 根據權利要求1所述的非酒精性脂肪肝細胞核酸適體，其特征在于，所述非酒精性脂 肪肝細胞核酸適體還包括基于所述SEQ ID NO. 1所示的DNA片段做堿基替換，并具有G四聚 體結構或者莖環結構的非酒精性脂肪肝細胞核酸適體。5. -種權利要求1至4中任一項所述的非酒精性脂肪肝細胞核酸適體在制備治療非酒 精性脂肪肝藥物中的應用。6. -種權利要求1至4中任一項所述的非酒精性脂肪肝細胞核酸適體在制備檢測非酒 精性脂肪肝的檢測試劑盒中的應用。7. -種權利要求1至4中任一項所述的非酒精性脂肪肝細胞核酸適體在非酒精性脂肪 肝組織切片成像中的應用。
【文檔編號】A61K48/00GK105925582SQ201610287042
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年5月3日
【發明人】劉波, 劉俊, 廖潔, 蒲穎, 劉慧霞, 譚蔚泓
【申請人】劉波