調控基因在分泌型腺毛基細胞中優勢表達的啟動子及應用
【專利摘要】調控基因在分泌型腺毛基細胞中優勢表達的啟動子及應用。本發明公開了一種植物生物技術領域的基因啟動子，該啟動子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，能夠調控目的基因在植物分泌型腺毛基細胞中優勢表達。同時本發明還涉及前述基因啟動子在利用植物腺毛組織表達和生產代謝產物的基因工程育種中的用途。由于利用植物腺毛特異表達的啟動子對植物的腺毛系統進行遺傳操作時，不會對植物的生長發育造成危害。因此，本發明對利用植物腺毛組織表達和生產代謝產物的基因工程育種具有重要意義。
【專利說明】
調控基因在分泌型腺毛基細胞中優勢表達的啟動子及應用
技術領域
[0001] 本發明設及植物生物技術領域，尤其設及一種調控基因在分泌型腺毛基細胞中優 勢表達的啟動子及其應用。
【背景技術】
[0002] 青葛(Artemisia annua L.)是菊科葛屬一年生草本植物，植株有濃烈的揮發性香 氣，其植株中含有許多次級代謝產物:青葛素、揮發油、Q-羨締、精腦、青葛酬等，此外還含有 黃酬類化合物。青葛素(Ademisinin)是從其地上部分分離出的一種含有過氧橋結構的倍 半祗內醋化合物，作為世界衛生組織（WHO)推薦的抗追疾藥物聯合治療（Artemisinin- based combination therapies, ACTS) 的主要有效成分。目前青葛素的主要來源是從青葛 的地上部分提取，然而青葛中青葛素的含量非常低(〇.〇1%-1%)，運使得運種藥物的大規 模商業化生產受到了極大限制。
[0003] 青葛的葉片表面有兩種腺毛：分泌型腺毛（glandular secretoiy t;richome，GST) 和非分泌型腺毛(T shaped trichomeJST)，兩種腺毛對于植物的生長、發育、防御、花粉傳 播等都起到至關重要的作用。其中，青葛素只在青葛的分泌型腺毛中合成，分泌型腺毛是青 葛葉片表面一種具有十細胞結構的特化器官，是由兩個基細胞、兩個柄細胞、六個分泌型細 胞W及外部的囊腔結構所構成。啟動子是位于結構基因5'端上游的特定核酸序列，能夠調 控下游基因的表達，啟動子就像一個"開關"，通過順式作用元件和反式作用因子的相互作 用來發揮其特定的功能。啟動子一共分=種:組成型啟動子、特異型啟動子、誘導型啟動子。 在目前青葛的基因工程研究中，多采用組成型啟動子，例如花挪菜花葉病毒35S啟動子 (CaMV35S )，運種啟動子能夠驅動外源基因在所有的組織和器官中表達，會過度消耗細胞內 的物質和能量，并且不能在時間和空間上調控目的基因的表達，極可能會對植物的正常生 長造成一定的負擔和危害。因此急需找到在植物的組織器官中特異性表達的啟動子來代替 組成型啟動子，從而更好的對植物基因的表達進行調控。由于腺毛特異表達的啟動子對于 植物的腺毛系統進行遺傳操作，不會對植物的生長發育造成危害，可W克服組成型啟動子 的種種弊端。因此，本發明致力提供一種克隆到植物腺毛組織特異表達的啟動子。
【發明內容】
[0004] 有鑒于現有技術的上述缺陷，本發明提供了一種調控基因在分泌型腺毛基細胞中 優勢表達的啟動子，能引導基因在轉基因植物分泌型腺毛中特異表達。上述啟動子為MYB家 族轉錄因子基因啟動子，其核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0005] 進一步地，上述啟動子為誘導型啟動子。
[0006] 本發明還提供了上述啟動子在植物生產代謝產物的基因工程育種中的應用。
[0007] 進一步地，上述啟動子為特異型啟動子，能夠代替組成型啟動子引導外源基因在 植物分泌型腺毛中特異表達。
[000引本發明還提供了一種重組表達載體，其包含如SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序列。
[0009] 本發明還提供了一種重組表達轉化體，其包含如SEQ ID NO. I所示的核巧酸序列。
[0010] 本發明還提供了一種調控基因在分泌型腺毛基細胞中優勢表達的啟動子的制備 方法，包括W下步驟：
[0011] 步驟一、培養青葛無菌苗；
[0012] 步驟二、克隆調控基因在分泌型腺毛基細胞中優勢表達的啟動子基因組序列；
[0013] 步驟=、分析調控基因在分泌型腺毛基細胞中優勢表達的啟動子上面的順式作用 元件，確定上述啟動子類型；
[0014] 步驟四、將克隆到的上述啟動子通過酶切連接連入PCAMBIA1391Z載體中；
[0015] 步驟五、將步驟四中構建好的載體轉化根癌農桿菌；
[0016] 步驟六、將步驟五中帶有載體的根癌農桿菌穩定轉化青葛；
[0017] 步驟屯、PCR檢現贈基因植株；
[0018] 步驟八、確定上述啟動子所引導的GUS報告基因在植株中表達部位。
[0019] 進一步地，上述步驟二W基因組DNA為模板，采用兩輪巢式PCR方法擴增啟動子序 列。
[0020] 進一步地，上述步驟S中的順式作用元件包括:TATA box、CAAT box、G-box、ARE、 GATA-mo t i f、GAG-mo t i f、ABRE、肥S。
[0021 ]啟動子序列中調控元件見下表1:
[0022]表1:啟動子序列中調控元件分析
[00731
[0024] 進一步地，上述步驟四中，為構建PCAMBIA1391Z載體，正向引物中引入PstI酶切位 點，反向引物中引入BamHI酶切位點，引物序列如下所示：
[0025] 1391z-proAaMIXTAl-F：AACTGCAGAAAGGCCCCCTTAAAAGATACG
[0026] 1391z-proAaMIXTAl-R：CGGGATCCAATGAAGACGAAAACCGTCGC
[0027] 進一步地，上述步驟六具體包括：
[0028] 1)外植體的預培養；
[0029] 2)農桿菌與外植體的共培養；
[0030] 3)抗性再生植株的篩選。
[0031] 本發明的有益效果在于，利用有效的青葛表皮毛組織特異性啟動子代替組成型啟 動子可W用于構建在分子生物學中在青葛分泌型腺毛特異表達目的基因的融合基因，利用 遺傳轉化技術將其轉入其他植物的基因組中，從而實現目的基因的定向操作已獲得轉基因 植物，并且不會對植物的生長發育造成危害，能廣泛用于利用植物腺毛組織表達和生產代 謝產物的基因工程育種中。
[0032] W下將結合附圖對本發明作進一步說明，W充分說明本發明的目的、技術特征和 技術效果。
【附圖說明】
[0033] 通過閱讀參照W下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發明的其它特征、 目的和優點將會變得更明顯：
[0034] 圖1示出了本發明的一個較優實施例中的AaMIXTAl基因啟動子序列及其順式作用 元件；
[0035] 圖2示出了轉基因青葛植株的PC郎日性檢測結果圖；
[0036] 圖3示出了利用AaMIXTAl基因啟動子與GUS基因融合的載體pCAMBIA1391z-pro AaMIXTAl通過農桿菌介導的穩定轉化青葛后，所獲得的轉基因青葛中GUS組織染色圖；
[0037] 圖4示出了 AaMIXTAl在青葛中分泌型腺毛基部表達示意圖。
【具體實施方式】
[0038] 下面結合具體實例對本發明進行詳盡說明，W下實例將有助于本領域的技術人員 進一步理解本發明而不W任何形式限制本發明。應當指出的是，對本領域的普通技術來說， 在不脫離本發明構思的前提下，還可W做出若干變形和改進，運些都屬于本發明的保護范 圍。
[0039] 下述實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等 分子克隆：實驗室手冊見化W York:Cold Spring化rbor Laboratory Press的1989年版中 所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0040] 本實施例設及的根癌農桿菌邸A105已在《黃亞麗，蔣細良，田云龍，郭萍，朱昌雄； 根癌農桿菌介導的哈茨木霉菌遺傳轉化的研究，中國生物工程雜志，2008，28(3): 38-43》文 獻中公開。根癌農桿菌EHA105，質粒PCAMBIA1391Z可通過公開市售的商業渠道取得，如可W 從澳大利亞GAMBIA公司購得，菌株編號為Gambarl。
[0041 ]實施例
[0042 ]本實施例設及AaMIXTAl基因啟動子的獲得，具體包括如下步驟：
[0043] 步驟一、培養青葛無菌苗
[0044] 青葛種子用體積分數為75%的乙醇浸泡Imin,再用20% (w/v)的化QO浸泡20min 后，無菌水沖洗3次~4次，用無菌吸水紙吸干表面水分，接種于無任何激素的MS固體培養基 上，25°C、1化/她(Ii曲t/dark)光照培養，14天后即可獲得青葛無菌苗；
[0045] 步驟二、基因組DNA中啟動子序列的克隆
[0046] 1.基因組DNA的提取
[0047] 在1.5血離屯、管中加入2粒鋼珠，在其中放一片青葛葉片（Icm2左右大小，用冰盒盛 取）。加入300化TPS buf f er (通風楓內操作，TPS中含有2 %琉基乙醇），55-60HZ，震蕩90秒。 再加入30化L TPS buffe;r(通風楓）d65°C水浴化(每隔20min搖一搖），可適當延長時間，最 長1.化。冷卻至室溫，4°C 1200化pm離屯、15min。取30化レ40化L上清液。等體積加入30化心 400化異丙醇(異丙醇在-20°C預冷）。混合后在-20°C冰箱中放置IO-ISmin(可延長至化）。取 出4 °C 12000巧m離屯、IOmin，吸去上清，在通風楓中倒置IO-ISmin。加入75 %乙醇500-600化， 將沉淀吹打起或用手指彈起，放在搖床上搖15-20min，重復一次。吸干液體，放在37°C中烘 干，直到沉淀變為透明。加入50化dd出0回溶，4 °C保存。
[004引 2. PCR擴增
[0049] W基因組DNA為模板，利用PCR方法擴增分泌型腺毛特異啟動子序列。為了提高產 物的特異性，采用兩輪巢式PCR(Nested PCR)擴增，根據本實驗室基因組測序得到的 AaMIXTAl基因的啟動子序列設計巢式PCR引物如表2所示，首輪PCR反應體系如表3所示。PCR 條件為:95°C預變性5min ;94°C變性30s; 55°C退火30s; 72°C延伸3min，35個循環;72°C延伸 IOmin。在I %的瓊脂糖凝膠中電泳檢測PCR產物。
[0化0] 親2巢式PCR引物巧計
[0化1 ]
[0化2]
[0化3]
[0054] H化1-的'|職什丄。。1口，|尸^ |大'化^。^^化1。1、，^^化1。1、/入應體系見表 4dPCR 條件為:95°C 預變性 5min; 94°C 變性 30s; 55°C 退火 30s; 72°C 延伸 Smin，35 個循環;72°C 延伸lOmin。在1%的瓊脂糖凝膠中電泳檢測PCR產物，切膠回收目的片段，純化DM。然后連 接到pMD18-T(購自化KaRa公司）載體用于測序，將該片段的序列與基因序列進行拼接，獲得 AaMIXTAl基因上游2569bp的片段。
[0化日]表4第二輪PCR反應體系
[0化6]
[0化7] 巧驟二、分機恃判WAaMiWAi雖囚舊功于W順巧化用兀巧，側疋AaMIXTAl基因啟 動子的類型
[005引本發明中得到的AaMIXTAl基因啟動子序列長度為2569bp。為了尋找啟動子上面的 乃頃式作用元件，用 Pl曰ntc曰re (http : //bioinform曰tics .psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html/)對AaMIXTAl基因的啟動子進行分析。分析發現多克隆到的啟動子上面具 有除了TATA box和CAAT box,還具有很多順式作用元件：G-box、ARE、ABRE-motif、GATA- motif、肥S等;G-box在很多植物啟動子中都有發現，它是很多應激響應啟動子行使功能所 必須的元件，在植物啟動子對光、無氧環境和植物激素的響應過程中起到很重要的作用;此 夕h G A - m 01 i f受光調控，A B R E - m 01 i f在植物中能夠響應脫落酸；W上結果分析表明， AaMIXTAl基因啟動子是一個誘導型的啟動子，能受多種激素和自然因素誘導。AaMIXTAl基 因啟動子序列及其順式作用元件示于圖1。
[0059] 步驟四、將得到的啟動子連入PCAMBIA-1391Z載體，融合GUS報告基因。
[0060] 為了研究基因啟動子在植物不同組織部位中的表達，將AaMIXTAl基因的啟動子 proAaMIXTAl連接PCAMBIA-1391Z載體融合GUS報告基因，為了實現對表達載體的構建，正向 引物中引入PstI酶切位點，反向引物中引入BamHI酶切位點，引物序列如下表所示：
[0061 ]表 5pCAMBIA1391z-proAaMIXTAl 載體構建 PCR 引物 [00A91
12345 步驟五、將構建好的pCAMBIA1391z-proAaMIXTAl載體轉化根癌農桿菌并檢測。 2 將含有構建完成的植物雙元表達載體轉入根癌農桿菌化HA105)，并進行PCR驗證。 結果表明：含有基因啟動子片段的植物雙元表達載體成功的構建到根癌農桿菌菌株中，從 而獲得含基因啟動子和GUS基因融合的植物表達載體pCAMBIA1391z-proAaMIXTAl的根癌農 桿菌菌株中。 3 步驟六、將帶有pCAMBIA1391z-proAaMIXTAl載體的根癌農桿菌轉化青葛 4 1)外植體的預培養 5 青葛種子用體積分數為75 %的乙醇浸泡Imin;再用20 % (w/v)的NaQO浸泡20min; 無菌水沖洗3~4次；用無菌吸水紙吸干表面水分；接種于無激素的MS,該MS培養基采用 Murashige和Skoog在1962年發明的固體培養基，該固體培養基可W通過商業渠道獲得;25 °C、16小時的日光和8小時的黑夜培養，即可獲得青葛無菌苗，待苗長至5cm左右后，剪取無 菌苗葉片外植體用于轉化；
[0068] 2)農桿菌與外植體的共培養
[0069] 將所述的葉片外植體，轉到1/2MS和100皿ol/L AS組成的共培養培養基中，滴加含 活化好的所述含DELO到DEL8基因植物雙元表達載體的根癌農桿菌工程菌的1/2MS懸液，使 外植體與菌液充分接觸，28°C暗培養3d，W滴加在不帶有目的基因的根癌農桿菌的1/2MS液 體培養基懸液的葉片外植體為對照；
[0070] 3)抗性再生植株的篩選
[0071] 將所述的共培養3d的青葛外植體轉入到MS、0.5mg/L 6-BA、0.05mg/L NAA、50mg/L Kan和500mg/L Cb組成的發芽篩選培養基上，于25°C、16小時的日光（light)和8小時的黑暗 (dark)中培養，每兩周繼代培養一次，經過2-3次繼代后即可獲得Kan抗性叢生芽，將生長良 好的抗性叢生芽剪下轉入1/2MS0和125mg/L化組成的生根培養基上培養至生根，從而獲得 Kan抗性再生青葛植株；
[0072] 步驟屯、PCR檢測轉基因植株
[0073] 根據目的基因所在表達盒promoter-GUS序列promoter和GUS分別設計正向引物 (proAaMIXTAlF:CTCCGTATTATCTTATACTAGTA)和反向引物（GUSR:GACATCGGCTTCAAATGGCGTA) 對GUS基因進行檢測；結果表明，利用所設計的PCR特異引物，能擴增出特異DNA片段，而W非 轉化青葛基因組DNA為模板時，沒有擴增出任何片段，如圖2所示；
[0074] 步驟八、啟動子所引導的GUS報告基因在植株中的表達部位的確定
[0075] 對PCR檢測為陽性的青葛植株，取其葉片進行GUS組織染色，結果如圖3所示；圖4則 示出了AaMIXTAl在青葛中分泌型腺毛基部表達示意圖；結果表明，染色部位在青葛的分泌 型腺毛基部中優勢表達，說明proAaMIXTAl基因啟動子在轉基因青葛中能夠引導外源基因 在腺毛中特異表達，由此可見，本發明所克隆的proAaMIXTAl基因啟動子可用于利用植物腺 毛組織表達和生產代謝產物的基因工程育種和產業化中。
[0076] W上詳細描述了本發明的較佳具體實施例。應當理解，本領域的普通技術無需創 造性勞動就可W根據本發明的構思作出諸多修改和變化。因此，凡本技術領域中技術人員 依本發明的構思在現有技術的基礎上通過邏輯分析、推理或者有限的實驗可W得到的技術 方案，皆應在由權利要求書所確定的保護范圍內。
【主權項】
1. 一種調控基因在分泌型腺毛基細胞中優勢表達的啟動子，其特征在于，所述啟動子 為MYB家族轉錄因子基因啟動子，所述啟動子的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。2. 根據權利要求1所述的啟動子，其特征在于，所述啟動子為誘導型啟動子。3. 根據權利要求1或2所述的啟動子在植物生產代謝產物的基因工程育種中的應用。4. 一種重組表達載體，其特征在于，所述重組表達載體包含如SEQ ID NO. 1所示的核苷 酸序列。5. -種重組表達轉化體，其特征在于，所述重組表達轉化體包含如SEQ ID NO. 1所示的 核苷酸序列。6. -種調控基因在分泌型腺毛基細胞中優勢表達的啟動子的制備方法，其特征在于， 所述制備方法包括以下步驟： 步驟一、培養青蒿無菌苗； 步驟二、克隆調控基因在分泌型腺毛基細胞中優勢表達的啟動子基因組序列； 步驟三、分析調控基因在分泌型腺毛基細胞中優勢表達的啟動子上面的順式作用元 件，確定所述啟動子類型； 步驟四、將克隆到的所述啟動子通過酶切連接連入pCAMBIA1391z載體中； 步驟五、將步驟四中構建好的載體轉化根癌農桿菌； 步驟六、將步驟五中帶有載體的根癌農桿菌穩定轉化青蒿； 步驟七、PCR檢測轉基因植株； 步驟八、確定所述啟動子所引導的GUS報告基因在植株中表達部位。7. 根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述步驟二以基因組DNA為模板，采用 兩輪巢式PCR方法擴增啟動子序列。8. 根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述步驟三中的所述順式作用元件包 括：TATA box、CAAT box、G-box、ARE、GATA-motif、GAG-motif、ABRE、HES〇9. 根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述步驟四中，為構建pCAMBIA1391z 載體，正向引物中引入Pst頂每切位點，反向引物中引入BamM酶切位點，引物序列如下所示： 1391z-proAaMIXTAl-F：AACTGCAGAAAGGCCCCCTTAAAAGATACG 1391z-proAaMIXTAl-R：CGGGATCCAATGAAGACGAAAACCGTCGC〇10. 根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述步驟六具體包括： 1) 外植體的預培養； 2) 農桿菌與外植體的共培養； 3) 抗性再生植株的篩選。
【文檔編號】C12N15/84GK105925577SQ201610298499
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年5月6日
【發明人】唐克軒, 石璞, 付雪晴, 唐岳立, 孫小芬, 呂宗友, 顏廷祥, 陳明慧
【申請人】上海交通大學