水稻抗稻瘟病基因Pi35內特異SNP共顯性分子標記引物的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種水稻抗稻瘟病基因Pi35內特異SNP共顯性分子標記引物，屬于植物分子育種領域。本標記引物其序列分別為：Pi35?PF：GCGTACAGCGTTCGCTCTATA；Pi35?PR：CTTCAAAAGCTCACAACCA；Pi35?NR：CTGCAAAACAAAGGAAACGTG；Pi35?NF：CCGTCCTCCCTCCAGCATATATGTATAAGG。本發明利用該引物對水稻DNA進行PCR擴增，可快速判斷待測水稻Pi35的基因型，方法簡便快速、成本低廉，可廣泛應用于分子標記輔助選擇育種或者水稻種質資源Pi35基因型鑒定。
【專利說明】
水稻抗稻痘病基因 Pi 35內特異SNP共顯性分子標巧引物
技術領域
[0001] 本發明屬于植物分子育種領域，設及一種水稻抗稻攝病基因Pi35內特異SNP共顯 性分子標記引物，適用于在水稻育種中對Pi35基因型的大量篩選W及從水稻種質資源中篩 選新的Pi35基因型抗性親本。
【背景技術】
[0002] 水稻是我國重要的糧食作物，稻攝病是我國稻作區最嚴重的的病害之一，嚴重影 響稻谷產量和質量。利用抗病基因培育抗病水稻品種是控制水稻稻攝病最經濟和有效的方 式。由于稻攝病生理小種變異很快，含有單一抗性基因的抗性品種長期使用便會因為稻攝 病菌新的優勢種群的出現而抗性漸失；因此，利用分子標記輔助選擇組裝、聚合具有不同抗 譜的抗性基因，培育廣譜、持久抗性水稻品種成為解決問題的最佳途徑。
[0003] Pi35位于水稻1號染色體，供體親本來源于日本梗稻品種化kkai 188(Nguyen等， 2006)，攜帶Pi35基因的化化ai 188(北海188)和化kei 138(藤系138)是日本水稻育種的骨 干抗源，抗葉攝水平高且穩定，因此Pi35對于培育具有稻攝抗性的水稻品種具有巨大的利 用價值。
[0004] 分子標記是一種快速、簡便、成本低廉并可在水稻生長早期進行無損檢測的一種 技術，利用分子標記輔助選擇培育具有稻攝抗性的水稻品種是抵抗水稻稻攝病的有效方 法;但目前還沒有對Pi35基因內特異性共顯性分子標記的報道。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種水稻抗稻攝病基因Pi35內特異SNP共顯性分子標記引 物；引物特異性好，擴增效率高，可用于水稻抗稻攝病基因Pi35的基因型鑒定。
[0006] 本發明的另一個目的是提供水稻抗稻攝病基因 Pi35特異SNP共顯性分子標記引物 的應用；利用該引物可W有效對抗稻攝病基因 Pi35進行基因型選擇，既可W用于水稻資源 的篩選鑒定，又可W用于水稻抗稻攝病基因 Pi35的分子育種。
[0007] 為了實現上述目的，本發明采用W下技術方案 通過對Pi35來源材料的Pi35編碼區的等位基因進行了 PCR擴增、等位基因重測序，最終 在Pi35基因編碼區3780T位點獲得一個Pi35特異性SNP位點，Pi35等位基因型為T堿基，其余 基因型均為G堿基，在兩對交叉引物PCR(PCR with confronting two-pair primersJCR- CTPP)方法的基礎上加W改進創新，通過在內引物倒數第=位引入錯配堿基，開發出鑒定該 SNP位點不同堿基類型的共顯性標記，如圖1所示;通過設計4條引物(PF ^3、^、^)并利用 待測品種基因組DNA進行PCR擴增，根據擴增條帶類型鑒定Pi35基因型，純合Pi35基因型擴 增出535bp和317bp條帶，其余等位基因類型擴增條帶為53化P和266bp條帶，雜合型的擴增 條帶為53化p、317bp和266bp條帶。因此該方法簡便快速、成本低廉，可廣泛應用于分子標記 輔助選擇育種或者水稻種質資源Pi35基因型鑒定。
[000引一、引物 對Pi35來源材料的Pi35編碼區的等位基因進行了 PCR擴增、等位基因重測序，將獲得序 列首先與包含感病等位基因的材料日本晴及9311的對應序列進行比對，對于具有差異序列 的位點再利用包含其余3個等位基因的材料進行測序比對確認，最終在Pi35基因3780T處獲 得一個Pi35特異性SNP位點，Pi35等位基因型為T堿基，其余基因型均為G堿基；因此，通過設 計特異性引物對該SNP位點特異性擴增即可實現Pi35等位基因的鑒定。
[0009]引物設計原理如下（圖1): 在設計T型等位基因鑒定引物時，根據PCR-CTPP方法原理，首先在該SNP位點上游設計 正向引物PF(表1)，W該SNP位點的T堿基的互補堿基A作為3'端在該位點設計反向引物PR, PR的3'端的A堿基與T型等位基因材料正常結合擴增而與G型材料形成A/G錯配無法擴增；同 理，按照上述思路開發出擴增G型等位基因材料的NF與NR，實驗結果表明NF與NR在T型材料 中也有較微弱的擴增，因此為增強該引物特異性我們在NF的倒數第S位引入了一個錯配堿 基A增強其特異性，結果表明該引物只有與G型等位基因材料擴增時有一條266bp條帶，與T 型材料沒有條帶擴增;4條引物名稱、序列及擴增片段長度見表1所示。
[0010]水稻抗稻攝病基因Pi35基因內特異SNP共顯性分子標記引物，其序列分別為： Pi35-PF：GCGTACAGCGTTCGCTCTATA； P i 3 5-PR：CTTCAAAAGCTCACAACCA； P i 3 5-NR：CTGCAAAACAAAGGAAACGTG； P i 3 5-NF:CCGTCCTCCCTCCAGCATATATGTATAAGG。 二、鑒定 對水稻DNA進行PCR擴增； 純合Pi35基因型擴增出53加P和317bp條帶，其余等位基因類型擴增條帶為53化P和 266bp條帶，雜合型的擴增條帶為53化P、31化P和26化P條帶。
[001" S、應用 1、在水稻抗稻攝病基因分子育種中的應用。
[0012] 2、在水稻資源的篩選鑒定中的應用。
[0013] 水稻抗稻攝病基因Pi35基因內特異SNP共顯性分子標記引物的應用，包括利用常 規方式對水稻DNA進行PCR擴增，通過對擴增條帶進行判斷，用于水稻資源的篩選鑒定或水 稻抗稻攝病基因Pi35的分子育種。
[0014] W上所述的方案中，優選的，引物PF、PR、NF與NR按1:1:1:1混合擴增，退火溫度為 55 °C。
[0015] W上所述的方案中，擴增條帶的判斷方式為：SNP位點為T堿基的Pi35型等位基因 材料擴增出53加P和317bp 2條條帶，SNP位點為G堿基的其他型等位基因材料擴增出53加P 和26化P 2條條帶，TG雜合型則擴增出53化p、31化P和26化P的3條條帶。
[0016] 表1引物序列
與現有技術相比，本發明具有W下優點： ① 本引物對Pi35來源材料的Pi35編碼區的等位基因進行了 PCR擴增、等位基因重測序， 最終在Pi35基因3780T處獲得一個Pi35特異性SNP位點，Pi35等位基因型為T堿基，其余基 因型均為G堿基； ② 與傳統的利用接種不同的稻攝病生理小種鑒定稻攝病抗性等位基因不同，本發明在 PCR-CTPP方法的基礎上加W改進，利用目標基因內SNP位點開發出僅利用PCR電泳技術即可 鑒定親本及F2子代Pi35基因型的特異共顯性分子標記； ③ 與其它標記相比，本發明提供的Pi35基因內特異性共顯性SNP分子標記可W直接通 過鑒定PCR產物判定目標材料的基因型，無需酶切，檢測準確率100%，不僅可W判斷目標材 料是否含有Pi35基因，還可W檢測出目標材料的基因型是雜合還是純合； ④ 在利用Pi35基因對水稻稻攝病抗性進行改良時，分子標記輔助選擇(MAS)在回交過 程中成為一種最直接、有效的篩選工具，利用本發明的方法可準確實現子代基因型檢測，篩 選攜帶目的基因的個體連續回交后自交純合從而完成品種改良；因此，該方法具有簡單、準 確、成本低并可W在水稻生長早期進行非破壞性檢測等一系列優點，適于在育種中對Pi35 基因型的大量篩選W及對于水稻種質資源中Pi35等位基因型鑒定。
[0017]總之，本發明利用該引物對水稻DNA進行PCR擴增，可快速判斷待測水稻Pi35的基 因型，方法簡便快速、成本低廉，可廣泛應用于分子標記輔助選擇育種或者水稻種質資源 Pi35基因型鑒定。
【附圖說明】
[001引圖1是利用兩對交叉引物PCR擴增(PCR-CTPP)方法對水稻Pi35基因內特異SNP位點 擴增示意圖。
[0019] 圖2是利用本發明設計的引物對巧帕i35基因型DNA模板擴增的電泳圖， M:DL2000 DNA marker,其中： 泳道1為SNP位點為純合T堿基，含有Pi 35基因的親本材料化ke i 138 (藤系138 ); 泳道2為SNP位點為TG雜合型堿基，由化kei 138(藤系138)與9311雜交獲得的Fi代材 料； 泳道3為SNP位點為純合G堿基，含有Pi35的感病等位基因親本材料9311。
[0020] 圖3是利用本發明設計的引物檢測生產上常用的水稻骨干親本的電泳圖， M:DL2000 DNA marker,其中： 泳道I為含有Pi35基因的親本材料化kei 138(藤系138); 泳道2為化kei 138(藤系138)與9311雜交獲得的Fi代材料； 泳道3為含有Pi35的感病等位基因親本材料9311; 泳道4-16分別為生產上常用骨干親本:培矮64S、廣占63S、皿9802S、明恢63、中國香稻、 日本晴、桂朝2號、黃華占、Lemont、HPl 21、超級己斯瑪蒂、鹽稻4號、Rl 128。
【具體實施方式】
[0021] 本實施例中未特別說明的實驗方法即為分子生物學常規方法。本研究所用 Taq酶及dNTP產自北京全式金生物技術有限公司，其余均為常規生化試劑。
[0022] 1、實施例1: 利用本發明設計的引物對巧中Pi35基因型DNA模板擴增 1)生物材料 TT型材料為含有Pi35基因的親本材料化kei 138(藤系138);GG型材料為含有感病等位 基因的親本材料9311 ;TG型材料為化kei 138(藤系138)與9311雜交獲得的Fi代材料。
[0023] 2)水稻DNA提取及引物合成 CTAB方法提取上述材料的DNA，合成表1所示的引物序列，具體為： Pi35-PF：GCGTACAGCGTTCGCTCTATA； P i 3 5-PR：CTTCAAAAGCTCACAACCA； Pi35-NF：CCGTCCTCCCTCCAGCATATATGTATAAGG； P i 3 5-NR：CTGCAAAACAAAGGAAACGTG； 3)PCR PCR反應體系為 15化，含 1.5化 lOXBuffera.OyL dNTPsQO mmol/L), 4條引物PF、 PR、NF與NR各為0.1 yM; Taq酶0 . (抓/yL)，1.0 yL模板DNA( 50ng/yL)，其余用d地2〇補齊； PCR反應程序:94°C預變性5min; 94 °C變性30s，55 °C退火30s，72 °C延伸40s，共35個循環;72 °C延伸5min，擴增產物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，用凝膠成像儀掃描記錄結果。
[0024] 4、結果分析 1泳道為SNP位點為純合T堿基的Pi35型材料，利用本發明標記擴增結果顯示有53化P和 317bp 2條條帶，3泳道為SNP位點為純合G堿基的材料擴增出53加P和266bp 2條條帶，2泳 道為SNP位點為TG雜合型的材料則擴增出53化p、317bp和266bp 3條條帶。該結果表明，我們 設計的標記對不同基因型材料擴增時條帶清晰（圖2)。
[0025] 2、實施例2 利用本發明設計的引物檢測生產上常用的水稻骨干親本。
[0026] 1)生物材料 親本對照為含有Pi35基因的親本材料化kei 138(藤系138);含有感病等位基因的親本 材料9311;Fukei 138(藤系138)與9311雜交獲得的Fl代材料。骨干親本材料：培矮64S、廣 占63S、HD9802S、明恢63、中國香稻、日本晴、桂朝2號、黃華占、Lemont、冊121、超級己斯瑪 蒂、鹽稻4號、R1128等13個，CTAB方法提取上述材料的DNA。
[0027] 2)PCR PCR反應體系為 15化，含 1.5化 IOXBuffera.OyL dNTPsQO mmol/L), 4條引物PF、 PR、NF與NR各為O. IyM; hq酶O . ^U5U/yL)，1.0 yL模板DNA巧Ong/yL)，其余用ddH20補齊； PCR反應程序:94°C預變性5min; 94 °C變性30s，55 °C退火30s，72 °C延伸40s，共35個循環;72 °C延伸5min，擴增產物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，用凝膠成像儀掃描記錄結果。
[0028] 3)結果分析 利用本發明的Pi35基因內特異共顯性標記鑒定含有不同等位基因的材料表明，Pi35純 合子類型材料具有53化P和317bp 2條條帶，含有純合感病基因的材料擴增出53化P和266bp 2條條帶，Pi35雜合型的材料則擴增出53加p、317bp和266bp 3條條帶，因此該標記可W將 Pi35抗性基因和其余常用親本的感病等位基因區分開。如圖3所示，泳道1為含有Pi35基因 的親本材料化kei 138(藤系138);泳道3為含有感病等位基因的親本材料9311;泳道2為 Fuke i 138 (藤系138 )與9311雜交獲得的Fi代材料。泳道4-16對應親本材料依次分別為:培 矮64S、廣占63S、皿9802S、明恢63、中國香稻、日本晴、桂朝2號、黃華占、Lemont、HP121、超級 己斯瑪蒂、鹽稻4號、R1128。圖3結果表明，泳道4-16所鑒定的水稻其SNP位點的基因型均為G 型，判斷其為感病等位基因型，均與實際相符。
[0029] 本實施例中的應用過程，可用于有效的對抗稻攝病基因 Pi35進行基因型選擇，既 可W用于水稻資源的篩選鑒定，又可W用于水稻抗稻攝病基因 Pi35的分子育種。
[0030] 序列表 <110〉湖北省農業科學院糧食作物研究所 <120〉水稻抗稻攝病基因Pi35內特異SNP共顯性分子標記引物 <140〉 <141〉 <160〉 4 <210〉 1 <211〉 21 <212〉DNA-引物序列 <400〉 Pi35-PF:GCGTACAGCGTTCGCTCTATA; <210〉 2 <211〉 19 <212〉DNA-引物序列 <400〉Pi35-PR:CTTCAAAAGCTCACAACCA; <210〉 3 <211〉 30 <212〉DNA-引物序列 <400> Pi35-NF：CCGTCCTCCCTCCAGCATATATGTATAAGG； <210〉 4 <211〉 21 <212〉DNA-引物序列 <400〉 Pi35-NR:CTGCAAAACAAAGGAAACGTG。
【主權項】
1. 一種水稻抗稻瘟病基因 Pi35內特異SNP共顯性分子標記引物，其特征在于其序列包 括： Pi35-PF：GCGTACAGCGTTCGCTCTATA； Pi 35-PR：CTTCAAAAGCTCACAACCA； Pi 35-NR：CTGCAAAACAAAGGAAACGTG； Pi 35-NF:CCGTCCTCCCTCCAGCATATATGTATAAGG。2. 利用權利要求1所述標記引物的序列對水稻抗稻瘟病基因 Pi35的鑒定方法，其特征 在于： 對水稻DNA進行PCR擴增； 純合Pi35基因型擴增出535bp和317bp條帶，其余等位基因類型擴增條帶為535bp和 266bp條帶，雜合型的擴增條帶為535bp、317bp和266bp條帶。3. 按權利要求1所述的引物在水稻抗稻瘟病基因分子育種中的應用。4. 按權利要求1所述的引物在水稻資源的篩選鑒定中的應用。
【文檔編號】C12N15/11GK105925575SQ201610519850
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年7月5日
【發明人】徐華山, 游艾青, 周雷, 劉凱, 閘雯俊, 李三和, 楊國才, 陳志軍, 李培德, 蔣醫蔚, 方國成
【申請人】湖北省農業科學院糧食作物研究所